一种成团细胞悬液快速优化制备悬浮细胞的方法与流程

本发明属于细胞生物学技术领域，具体涉及一种成团细胞悬液快速优化制备悬浮细胞的方法。

背景技术：

哺乳动物细胞大规模培养技术是生物制药企业生产重组蛋白、病毒疫苗等生物制品的有效方法，在我国传统细胞培养采用贴壁细胞培养方式。这种方式虽然操作简便，但由于转瓶表面积有限，细胞密度低，造成产品产量低下，并且培养时需要加入血清，由于血清化学成分不确定，批间差异大，可能携带有未充分灭活的动物病毒或支原体，血清的使用不仅增加了成本的投入，而且增加了产品的不稳定性和下游纯化的困难。由此，实现哺乳动物细胞的无血清悬浮培养，对于提高产能，降低成本，简化下游生产具有重要意义。

贴壁细胞悬浮驯化的通用方式是逐渐降低培养基血清含量使细胞逐渐适应无血清悬浮培养基，以此通过驯化，使多种哺乳动物细胞从贴壁状态成为可悬浮生长于无血清的培养基中的细胞系，使得单位体积内能生长更多的细胞。但驯化后的悬浮细胞，培养到一段时间会在培养液中出现细胞聚集结团的现象，在更换其他培养基进行培养的条件下，也会产生成团的现象。出现细胞成团有以下几个因素：(1)细胞在培养过程中，出现细胞活率下降，细胞死亡率增高，细胞破裂后释放到悬液中的dna会引起悬液中的细胞逐渐成团；(2)无血清培养基中的ca²⁺离子浓度、硫酸葡聚糖钠浓度、肝素钠浓度等成分会对细胞成团有一定的影响，尤其硫酸葡聚糖钠和肝素钠在培养基中所发挥的作用是抗细胞聚集，随着培养基中细胞密度的增大，当营养液中的细胞密度增大到一定密度时(如hek293细胞密度达到3～5×10⁶cells/ml)，营养液中的抗细胞聚团的成分对细胞的抗聚团作用会降低，从而使得相互聚集的细胞会逐渐增多；(3)悬浮细胞未完全驯化成悬浮状态，导致培养过程中细胞成团。针对悬浮细胞在培养过程中再次成团的问题，通常采用的解决方式有两种方法，第一种方法是使用胰酶重悬和消化细胞，利用含2％fbs(dmen)终止胰酶消化，然后再用无血清细胞营养液重悬细胞；第二种方法是重头开始驯化，采用胰酶消化并逐级降低培养基血清含量，从含有10％fbs至含有1％fbs，当细胞适应含有1％fbs的培养基几代后，dmen与无血清培养基逐级按95％-90％-75％-50％-25％-10％-5％-0％最终适应完全无血清培养基。上述两种方法都是利用胰酶进行再次消化，通过多次换液和频繁分种使成团细胞通过再驯化重新成为悬浮细胞。然而在已经驯化成悬浮状态后再次成团的细胞非常脆弱，对外界环境非常敏感，当细胞出现聚集成团现象后，再次利用传统的方法制备成单个悬浮细胞培养状态，其驯化时间长达一个月并且细胞容易受到消化酶的损伤而导致活力降低，再加上胰酶的活性需要用胎牛血清来中止，这样不可避免的在细胞培养过程中引入了血清成分。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是针对悬浮驯化后的细胞再次聚集成团后，消化成团细胞，使细胞再次成为单个游离的悬浮细胞，使所制备的悬浮细胞能够在无血清培养基中存活和健康生长，在后续放大培养中不出现细胞成团的现象。

鉴于上述问题，本发明提供了一种成团细胞悬液快速优化制备悬浮细胞的方法。

作为优选，所述方法的步骤为：采用accutase酶消化成团细胞，消化结束后中和消化酶，然后用无血清培养基重悬细胞，获得悬浮细胞。

作为优选，在采用accutase酶消化成团细胞前还包括对accutase酶进行稀释的步骤。

作为优选，采用不含ca²⁺和mg²⁺的溶液对accutase酶稀释5倍以上。

作为优选，所述中和消化酶采用5倍以上体积的无血清培养基。

作为优选，所述无血清培养基的ca²⁺和mg²⁺含量为0.05mmol/l～0.2mmol/l。

作为优选，所述消化温度为35～38℃，消化时间为2～3min。

作为优选，在应用accutase酶消化成团细胞前还包括对成团细胞悬液进行摇床摇转和过滤的步骤，其中，所述过滤采用40μm的过滤网。

作为优选，所述过滤网为40μm细胞筛。

本发明在继代时用40μm灭菌的细胞筛对悬浮培养的细胞进行筛选，滤去大颗粒细胞团，只留下大小均一的细胞团，用此法能够建立起大小均匀，长势良好的悬浮细胞系。

本发明的方法适用于多种哺乳动物细胞，例如hek293细胞、a549细胞、pk15细胞等。

本发明的第二个目的在于提供一种制备悬浮细胞的方法在用于哺乳动物细胞悬浮培养中的应用。

作为优选，所述制备悬浮细胞的方法为：采用accutase酶消化成团细胞，消化结束后中和消化酶，然后用无血清培养基重悬细胞，获得悬浮细胞。

作为优选，在采用accutase酶消化成团细胞前还包括对accutase酶进行稀释的步骤。

作为优选，采用不含ca²⁺和mg²⁺的溶液对accutase酶稀释5倍以上。

作为优选，所述中和消化酶采用5倍以上体积的无血清培养基。

作为优选，所述无血清培养基的ca²⁺和mg²⁺含量为0.05mmol/l～0.2mmol/l。

作为优选，所述消化温度为35～38℃，消化时间为2～3min。

作为优选，在应用accutase酶消化成团细胞前还包括对成团细胞悬液进行摇床摇转和过滤的步骤，其中，所述过滤采用40μm的过滤网。

作为优选，所述过滤网为40μm细胞筛。

作为优选，所述哺乳动物细胞为hek293细胞，a549细胞和pk15细胞中的任意一种。

本发明的方法能够有效解决悬浮细胞在培养过程中再次出现细胞聚集或成团的问题，使得成团细胞能够被快速优化为悬浮状态，从而提高细胞的体外增殖水平。

本发明的第三个目的在于提供一种制备悬浮细胞的方法在生产重组蛋白或病毒疫苗中的应用。

通过优化细胞培养过程，实现细胞在无血清培养基中进行连续、稳定的悬浮培养，使得细胞的体外增殖水平提高，从而使得生产重组蛋白或病毒疫苗等生物制品的生产力得到提高。

有益效果：

(1)本发明针对细胞敏感的问题，使用accutase酶进行消化，所使用的accutase酶浓度低，活力高，作用温和，不会使细胞的细胞膜和表面表位受到损伤，并且accutase不含任何哺乳动物或细菌衍生的蛋白质以及不含bse，细小病毒和胰蛋白酶中常见的其他病毒，安全性高。

(2)本发明的方法是针对悬浮培养的细胞在培养过程中成团后再次进行驯化，与传统再驯化方式相比不需要花费很长时间，细胞驯化成单个悬浮细胞只需要1天时间，具有操作简单、驯化快速的特点。

(3)本发明使用无血清培养基终止消化，有效杜绝了动物来源的血清存在病原体、吸附因子等的缺陷，同时所使用的无血清培养基含有多种生长因子和营养元素，能够有效提高细胞的增殖能力。

(4)本发明制备的悬浮细胞单个状态稳定，连续培养多代不会出现细胞成团现象，稳定性高。

附图说明

图1是实施例1驯化前观察到hek293悬浮培养密度为3×10⁶个/ml时出现严重的细胞成团现象图，放大倍数100倍。

图2是摇床摇转后的上清悬液经过40μm细胞筛后，细胞悬液镜下观察结果，放大倍数100倍。

图3是实施例1应用本发明的方法驯化后细胞悬液稀释4倍观察到细胞培养密度为5×10⁶个/ml未出现细胞成团现象图，放大倍数100倍。

图4是实施例1应用本发明的方法驯化后细胞悬液稀释4倍观察到细胞培养25代后出现少量细胞成团现象图，放大倍数100倍。

具体实施方式

下面结合实施例，更具体地说明本发明的内容。应当理解，本发明的实施并不局限于下面的实施例，对本发明所做的任何形式上的变通和/或改变都将落入本发明保护范围。

在本发明中，若非特指，所有的稀释倍数均为体积单位，所有的设备和原料等均可从市场购得或是本行业常用的。若无特别指明，实施例采用的方法为本领域通用技术。

在本发明中，所使用的accutase酶购自gibco公司及promocell公司，accutase酶的原始浓度未被公开；在本发明中，所使用的无血清培养基为本领域在细胞培养时常用的无血清培养基，任何能够用于细胞培养的无血清培养基均适用于本发明，要求无血清培养基的ca²⁺和mg²⁺含量为0.05mmol/l～0.2mmol/l。

实施例1

一种成团细胞快速优化制备hek293悬浮细胞的方法：

(一)accutase酶消化浓度、消化时间、终止消化的优化

针对不同的细胞所需要accutase酶的浓度是不同的，而在原始酶浓度未知的情况下，需要筛选出能够消化成团细胞的合适的accutase酶浓度。

试剂：accutase酶(购自gibco公司及promocell公司)，不含ca2+和mg2+的pbs缓冲液(ph值为7.4)，无血清培养基(购自gibco公司，ca²⁺和mg²⁺含量0.05mmol/l～0.2mmol/l)，hek293细胞悬液。

1、从一瓶已经聚团的细胞悬液中取样计数，取2板12孔板，每孔细胞密度1×10⁶cells/ml，每孔1ml细胞悬液，摇匀后放入二氧化碳培养箱内于37℃静止培养一天。该已经聚团的细胞悬液为驯化后进行了悬浮培养的hek293细胞，当培养密度达到3×10⁶个/ml时，该细胞悬液出现了明显的团聚，如图1所示。

2、将accutase酶分别用pbs缓冲液稀释2倍、5倍、7倍、10倍、15倍，得到不同稀释倍数的accutase酶。

3、从二氧化碳培养箱内取出一板12孔板，添加不同浓度的accutase酶消化细胞，每个浓度消化2孔，accutase酶的添加量为250μl/孔，消化时通过光学显微镜镜下观察每孔细胞的消化程度及消化后的细胞单个状态，并通过血球计数板或者countstar细胞计数仪计数细胞数及细胞活力，实验结果如下表1所示。可以看出，稀释5倍以上的accutase酶的消化效果较稀释2倍的消化效果好，其中采用稀释5倍的accutase酶进行消化后细胞活力较高，且消化时间短，因此，优选采用稀释5倍的accutase酶进行消化，消化时间优选2～3min。

表1不同稀释倍数的accutase酶的消化效果

需要理解的是，accutase酶的稀释优选使用不含ca²⁺、mg²⁺的pbs缓冲液，也可以使用超纯水以及其他任何不含ca²⁺、mg²⁺的溶液或缓冲溶液。ca²⁺和mg²⁺浓度对细胞结团具有显著影响，发明人发现，当无血清培养基中ca²⁺和mg²⁺的浓度高于0.2mmol/l时，细胞明显产生成团趋势，说明高浓度的ca²⁺和mg²⁺有利于细胞贴壁培养，而不利于细胞悬浮培养，因此，为了避免ca²⁺和mg²⁺对accutase酶的消化效果产生影响，优选使用不含ca²⁺、mg²⁺的溶液对accutase酶进行稀释。

4、将已用pbs缓冲液稀释5倍的accutase酶分别用无血清培养基稀释1、2、3、4、5、7、8、9、10、11、12倍，得到具有不同浓度的用无血清培养基稀释后的accutase酶溶液，通过观察用无血清培养基稀释不同倍数的accutase酶对成团细胞的消化作用，从而确定无血清培养基对消化酶的中和。

5、从二氧化碳培养箱内取出另一板12孔板，添加用无血清培养基稀释后的不同浓度的accutase酶，每个浓度消化1孔，accutase酶的添加量为250μl/孔，通过光学显微镜观察细胞状态，实验结果如下表2所示。发现用无血清培养基稀释5倍以上的accutase酶无法消化细胞，说明用无血清培养基稀释5倍以上可以完全终止accutase消化细胞，即中和消化酶的消化作用。

表2用无血清培养基稀释不同倍数的accutase酶的消化效果

无血清培养基：

无血清培养基为不添加动物来源血清的培养基，是由基础培养基和合适比例的激素、生长因子、贴壁因子、结合蛋白和微量元素等添加因子组成。常用的激素比如胰高血糖素、生长激素、胰岛素、甲状腺素、雌二醇、氢化可的松、孕酮等，常用的生长因子有多肽类生长因子和甾类生长因子，比如表皮生长因子、成纤维细胞生长因子、神经生长因子等，贴壁因子包括纤粘连蛋白、胶原、昆布氨酸和多聚赖氨酸等，结合蛋白包括转铁蛋白和白蛋白，微量元素如硒等。基础培养基通常是将葡萄糖、氨基酸、无机盐和维生素等按一定比例组合而成的合成培养基，基础培养基对于维持组织或细胞生长代谢必不可少。在针对不同的细胞株进行培养时可以对培养基的某些组分的添加量进行相应的调整，从而更好的符合细胞株的营养要求，使其长势良好。

硫酸镁和氯化钙是基础培养基中常用的无机盐，发明人通过采用含有不同浓度ca²⁺和mg²⁺的无血清培养基对293细胞进行悬浮培养时发现，当无血清培养基中ca²⁺和mg²⁺的浓度高于0.2mmol/l时，通过光学显微镜镜下观察到细胞明显产生成团趋势，说明高浓度的ca²⁺和mg²⁺有利于细胞贴壁培养，而不利于细胞悬浮培养；而当无血清培养基中ca²⁺和mg²⁺的浓度过低时(小于0.05mmol/l)，通过血球计数板或者countstar细胞计数仪计数发现细胞的增殖能力降低。因此，为了避免ca²⁺和mg²⁺对细胞悬浮培养产生影响，提高细胞培养效率，优选无血清培养基的ca²⁺和mg²⁺含量为0.05mmol/l～0.2mmol/l。

(二)快速优化制备悬浮细胞

试剂：pbs缓冲液稀释5倍的accutase酶，无血清培养基，hek293细胞悬液。

1、用移液管从一瓶已经出现细胞聚团的细胞悬液中吸取50ml细胞悬液至离心管内(标记为试管a)，盖紧盖子，放入37℃，200rpm恒温摇床上摇转10min。该已经出现细胞聚团的细胞悬液为驯化后进行了悬浮培养的hek293细胞，当培养密度达到3×10⁶个/ml时，该细胞悬液出现了明显的团聚，具有多个含有大量细胞个数的细胞团块，如图1所示。

2、另取一个离心管(标记为试管b)，在安全柜内打开试管b，在试管b上放置1个40μm细胞筛，在生物安全柜内用移液管吸取试管a内的上清液缓慢加入试管b，待全部上清液加入到试管b后，去掉细胞筛并盖紧试管b，于800rpm离心10min。

3、在生物安全柜内弃掉试管b内的上清液，并在试管b内留500μl的下层细胞悬液，采用电子显微镜观察细胞成团情况，如图2所示，该细胞悬液中依然存在大量细胞聚团。向细胞悬液中加入pbs缓冲液稀释5倍的accutase酶1.5ml，轻轻吹打后将试管b放入37℃，150rpm摇转上摇转2min～3min。

对于较大的细胞团块，位于团块中央的细胞大量凋亡或死亡，利用不同细胞个数的细胞团块其重力不同，结合摇床的离心力能快速的分离出不同层次的细胞。摇床摇转后，试管中的团块由上而下逐渐变大，取上清中细胞团块较小的细胞悬液进行过筛能够筛选出团块大小均一的细胞，并且可以将大团块中的已经死亡的细胞排除在外，目的在于消化时能更好的控制消化时间，获得消化细胞效果一致，细胞活力较高的细胞。

4、取出试管b，向试管b内加入10ml无血清培养基终止accutase消化细胞，混匀后，于800rpm离心10min。这里离心的目的在于去除accutase酶，发明人进一步通过对比离心与不离心的效果发现，中和消化酶后，不进行离心也可以获得同样效果的悬浮细胞，说明用无血清培养基中和后的accutase酶不会对细胞悬浮培养产生影响。

5、取出试管b，弃去试管b内的上清液，再向试管b内加入10ml无血清培养基，重悬细胞。将重悬后的细胞分装至离心管内，并计数每毫升细胞浓度，每个离心管内的细胞密度为0.5×10⁶cells/ml，每个离心管内含细胞悬液10ml，将上述离心管放入37℃二氧化碳培养箱内，200rpm摇转培养。

6、当每个离心管内的细胞密度达到3～5×10⁶cells/ml时未出现细胞成团现象，说明细胞驯化成悬浮细胞成功，该悬浮细胞能够稳定传代(图3)。

实施例2

对实施例1所获得的hek293悬浮细胞在无血清培养基中的稳定性进行评估。

对应用本发明的方法再次驯化后获得的hek293细胞在无血清培养基中进行悬浮培养，每24h使用countstar细胞计数仪统计细胞数和存活率，每3天按照0.5×10⁶细胞/ml密度进行传代。经过25代的生长稳定性评估，发现细胞的生长稳定，仅出现了少量的细胞成团现象，说明采用本发明的方法再次驯化成悬浮状态的hek293细胞适应无血清培养基的营养环境，能够稳定的悬浮培养，且生长良好(图4)。

发明人采用同样的方法对悬浮培养出现细胞成团的a549细胞进行快速优化，获得了同样的实验效果。说明本发明的方法适用于多种哺乳细胞的悬浮培养，能够在较短的时间内将成团的细胞再次驯化成能够稳定多代培养的悬浮状态，并且不会破坏细胞活力。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。