一种可控永生化的逆转录病毒载体和人脐带间充质干细胞及其构建方法与流程

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种可控永生化的逆转录病毒载体和人脐带间充质干细胞及其构建方法。

背景技术：

人脐带间充质干细胞(humanumbilicalcordmesenchymalstemcells，humscs)是一类来源于中胚层具有多向分化潜能的基质细胞，免疫原性低且具有免疫调控功能，在基因治疗和细胞替代治疗、免疫性疾病方面有着广泛的临床应用前景。然而，humscs与机体其他正常细胞一样，经过有限次的细胞传代后，出现细胞停止增殖，发生衰老和死亡，即细胞老化现象(cellsenescence)。研究显示，humscs在体外培养约10-30代左右出现细胞老化，这就阻碍了humscs在临床应用和机制方面的研究。若可以将humscs永生化，使其能够避免细胞培养过程中出现老化、干性消失，保持多潜能分化状态，不仅能为细胞生物学的研究提供稳定性状，在基因治疗、细胞治疗等研究方面也具有潜在的应用价值。

细胞永生化是指细胞自发或受体外因素影响能克服增殖危机，具有无限增殖的能力。1998年，bodnar和ouellette等将人端粒酶逆转录酶基因(humantelomerasereversetranscriptase，tert)转染到原代视网膜色素上皮细胞和成纤维细胞中，细胞寿命至少延长了20倍。2003年，cui将tert基因转染到绵羊成纤维细胞中，携带tert基因的成纤维细胞能够连续培养500天以上，未携带tert基因组只能连续培养200天左右。因此，通过转入外源性的永生化基因tert来获得细胞永生化状态。目前也有通过将重组到慢病毒载体的tert基因转染humscs使其延长寿命的方法，但是转化的细胞会在细胞表型或代谢方式上和原代分离的细胞有所差异。另外，将病毒转化的细胞连续不可控的表达永生化因子tert的细胞模型替代原代细胞进行研究存在潜在的风险性，会使它在细胞治疗、基因治疗等临床应用中受到限制。

四环素诱导表达系统由强启动子、四环素反应元件和四环素类小分子诱导剂构成，其中tet-on系统的调节蛋白为反义四环素转录激活子，在无诱导物的情况下能持续保持外源基因转录关闭的状态，当存在诱导物时，外源基因转录被激活。tet-on系统中，不存在诱导物时，反式转录活化因子(rtta)仍会少量的结合tre，造成一定的背景表达。

在基因治疗领域，常见的外源基因递送载体有非整合型载体和逆转录病毒载体，但是非整合型载体的转染效率取决于细胞种类及转染试剂，并且只能在细胞核外暂时表达，导致永生化效率偏低。携带永生化因子的逆转录病毒转化的脐带间充质干细胞，能够持续不可控的表达永生化因子tert，使其在临床应用中有潜在的风险性，会使它在细胞治疗、基因治疗中受到限制。另外，tet-on3g系统只有在添加诱导物的情况下，才能诱导表达永生化因子tert，但是不能将外源基因整合到细胞基因组。

可见，现有技术亟待改进。

技术实现要素：

鉴于此，有必要针对上述问题提供一种可控永生化的逆转录病毒载体和人脐带间充质干细胞及其构建方法，以克服现有永生化脐带间充质干细胞构建的缺陷，能较好的解决永生化因子tert连续不可控的表达带来的不安全性。

本发明通过以下技术方案实现的：

一种可控永生化脐带间充质干细胞的构建方法，操作包括：

(s1)借助tet-on3g系统构建含永生化因子tert的可控永生化逆转录病毒载体；

(s2)包装步骤(s1)的逆转录病毒载体，感染脐带间充质干细胞；

(s3)通过添加诱导物诱导永生化因子tert表达，将其转化为具有高增殖能力的永生化细胞。

进一步的，所述可控永生化脐带间充质干细胞的构建方法，其步骤(s1)的具体操作包括：

s11、重组质粒puc19-ptre3g的构建：以携带有ptre3g启动子序列的质粒为模板，pcr扩增ptre3g启动子序列插入到puc19载体质粒，ptre3g启动子序列如序列表中seqidno：1所示；

s12：重组质粒puc19-ptre3g-tert的构建：以携带有tert基因的质粒为模板，pcr扩增tert基因插入到重组质粒puc19-ptre3g的ptre3g启动子序列下游，tert基因序列如序列表中seqidno：2所示；

s13、重组质粒pcmv-puror-t2a-tet3g的构建：以携带有puror基因、t2a基因的质粒为模板，pcr扩增puror基因和t2a基因插入到pcmv-teton3g载体质粒，puror和t2a基因序列分别如序列表中seqidno：4、seqidno：5所示；

s14、重组质粒pclxsn-ptre3g-tert的构建：以步骤s12中获得的重组质粒为模板，pcr扩增ptre3g-tert基因插入到pclxsn载体质粒。

s15、重组质粒pclxsn-teton3g-tert的构建：以步骤s13中获得的重组质粒为模板，pcr扩增cmv-puror-t2a-teton3g-sv40poly(a)signal基因定向插入到pclxsn-ptre3g-tert载体质粒，重组构建的载体质粒还携带了cmv基因(seqidno：3)、t2a基因序列(seqidno：5)、teton3g基因(seqidno：6)、sv40poly(a)signal(seqidno：7)基因和kanr元件(seqidn0:8)；

编码tet-on3g基因以及ptre3g基因的意义用于永生化因子tert在脐带间充质细胞中，通过添加诱导物实现可控表达。

编码puror基因的意义在于，筛选出整合了外源基因的阳性克隆细胞。

进一步的，所述可控永生化脐带间充质干细胞的构建方法，其步骤(s2)的具体操作包括：

s21：将步骤s1中的重组逆转录病毒载体与包装质粒共转染293t细胞进行逆转录病毒包装，浓缩病毒液后进行病毒滴度检测；

s22：将携带tert基因的逆转录病毒感染原代脐带间充质干细胞，嘌呤霉素筛选得到稳定的细胞系。

进一步的，所述嘌呤霉素浓度为0.2μg/ml。

进一步的，所述步骤(s3)中通过添加诱导物调控tert基因的表达，具体包括：当培养基中添加有诱导物时，诱导表达tert；当需要将细胞用于正常生理或疾病治疗时，撤销诱导物，tert基因处于转录关闭状态，细胞回复原代脐带间充质干细胞特性。通过对诱导物诱导的逆转录病毒转化的细胞进行蛋白表达、诱导分化能力等特性分析，结果显示，具有典型的脐带间充质干细胞特性。

进一步的，所述诱导物可选强力霉素或地美环素或米诺霉素或金霉素或土霉素或四环素。

进一步的，所述诱导物的诱导浓度为0.2μg/ml。

一种可控永生化逆转录病毒载体，携带有ptre3g启动子(seqidno：1)、tert基因(seqidno：2)、puror基因(seqidno：4)、t2a基因(seqidno：5)、cmv启动子(seqidno：3)、teton3g基因(seqidno：6)、sv40poly(a)signal基因(seqidno：7)、kanr元件(seqidno：8)。

本发明有益效果：

本发明技术方案为了生物安全的考量，在构建的逆转录病毒载体中引入tet-on3g系统，构建一种可控永生化的脐带间充质干细胞，对永生化因子tert实施精确的调控，建立可控永生化humscs细胞，在基因功能研究或是疾病治疗中都具有十分重要的意义。

tet-on3g系统优化了启动子和rtta。研究表明ptre3g启动子背景表达低5-20倍，目的基因的表达量可提高数千倍；反式转录活化因子通过转入人类免疫缺陷病毒hiv后，长期过度培养引起病毒演化，获得高效的反式转录活化因子突变体。

逆转录病毒载体能装载外源基因容量最大达8kb，具有较高的感染效率，能够整合入宿主细胞基因组而无病毒蛋白表达。tet-on3g系统在不存在诱导物的情况下没有检测到反式转录活化因子与ptre3g的结合，没有背景表达。本发明将tet-on3g系统联合逆转录病毒系统，从而实现永生化基因在靶细胞内可控、稳定、高效的表达，具有较高的永生化效率，克服了现有永生化脐带间充质干细胞构建的缺陷，较好地解决永生化因子tert连续不可控的表达带来的不安全性。

附图说明

图1为构建的重组逆转录病毒载体pclxsn-teton3g-tert图谱。

图2不同浓度嘌呤霉素对humscs(p3)药筛，其中图2：(a)0μg/ml；(b)0.01μg/ml；(c)0.1μg/ml；(d)0.2μg/ml；(e)0.3μg/ml；(f)0.4μg/ml。

图3不同浓度强力霉素对humscs(p3)药筛，其中图3：(a)0μg/ml；(b)0.01μg/ml；(c)0.1μg/ml；(d)0.2μg/ml；(e)0.3μg/ml；(f)0.4μg/ml。

图4是humscs、ihumscs-tert(-)、ihumscs-tert(+)细胞形态学比较，其中图4：(a)p5代humscs；(b)p10代ihumscs-tert(-)；(c)p35代ihumscs-tert(+)；

图5添加强力霉素的ihumscs-tert(+)细胞的增殖活性。

图6为qpcr检测humscs、ihumscs-tert(+)、ihumscs-tert(-)细胞中tert基因mrna水平的表达。

图7为细胞中端粒酶活性结果。

图8为ihumscs-tert(+)细胞通过添加或撤销强力霉素诱导实现可控永生化。

图9是ihumscs-tert(+)多向诱导染色，其中图9：(a)成骨诱导组茜素红染色；(b)成脂肪诱导组油红“o”染色；(c)成软骨诱导组甲苯胺蓝染色。

具体实施方式

为了更好地说明本发明所解决的问题、所采用的技术方案和所达到的效果，现结合具体实施例和相关资料进一步阐述。需要说明的是，本发明内容包含但不限于以下实施例及其组合实施方式。

本发明实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购等途径获得的常规产品。

实施例一可控永生化脐带间充质干细胞的构建

1、脐带间充质干细胞系的原代分离与培养

取2-3cm的脐带，置于100mm培养皿中，用含双抗的pbs(双抗，tbd，ps2004hy；dpbs粉剂，博士德，pyg14190)洗净脐带表面后，无菌镊子剥离脐静脉和脐动脉，剔除血凝块，去除表皮，将剩下的组织转移到无菌平皿中，用剪刀剪碎成1-2mm的组织块，用ultraculture无血清培养基培养，细胞密度达到80-90％时，按照1：2-1：3传代，细胞密度不易过稀，否则细胞容易老化。

细胞群体倍增数(pd)计算公式如下：

pd＝△t×lg2/(lgnt-lgn0)

△t:为计数间隔天数；

lgnt:为对数生长期任一点的理论观察值；

lgn0:为对数生长期理论初始值。

2、pclxsn-teton3g-htert逆转录病毒载体的构建与鉴定

pclxsn-teton3g-tert载体的构建方式如图1所示，该载体携带了ptre3g启动子序列、tert元件、tet3g元件,puror元件,sv40poly(a)signal元件，kanr元件。

本发明可控永生化逆转录病毒载体的构建：

(1)重组质粒puc19-ptre3g的构建及鉴定

以质粒pteton-egfp(addgene，货号：89453)为模板，利用引物p1，p2扩增ptre3g启动子序列，并在上、下游引物中分别引入sphⅰ和bamhⅰ位点，引物序列如下：

ptre3g-f(p1)：5’-gcatgcgagtttactccctatcagtgataga-3’

ptre3g-r(p2)：5’-ggatcctttacgagggtaggaagtggtacgg-3’

pcr反应体系如下：

引物p1,p2扩增条件为：98℃变性30s后进入循环；循环参数为：98℃10s，58℃15s，72℃1min；33个循环后4℃保存。将pcr产物回收并用sphⅰ和bamhⅰ限制性内切酶双酶切，再用sphⅰ和bamhⅰ限制性内切酶双酶切载体质粒puc19，纯化回收后，用重组酶将ptre3g启动子序列亚克隆到线性表达载体puc19，转化e.colidh5a感受态细胞，获得载体质粒puc19-ptre3g。通过pcr和重组质粒测序鉴定携带ptre3g启动子序列，鉴定结果证实构建正确。

(2)重组质粒puc19-ptre3g-tert的构建及鉴定

以质粒plox-tert-tk(addgene，货号：12245)为模板，利用引物p3，p4扩增tert基因，并在上、下游引物中分别引入bamhⅰ和kpnⅰ位点，引物序列如下：

tert-f(p3)：5’-ggatccgccaccatgccgcgcgctccccgctg-3’

tert-r(p4)：5’-ggtacctcagtccaggatggtcttga-3’

pcr反应体系如下：

引物p3,p4扩增条件为：98℃变性30s后进入循环；循环参数为：98℃10s，58℃15s，72℃3min；33个循环后4℃保存。将pcr产物回收并用bamhⅰ和kpnⅰ限制性内切酶双酶切，再用bamhⅰ和kpnⅰ限制性内切酶双酶切步骤(1)中获得的重组质粒puc19-ptre3g，纯化回收后，用重组酶将tert基因亚克隆到线性表达载体puc19-ptre3g，转化e.colidh5a感受态细胞，获得重组质粒puc19-ptre3g-tert。通过pcr和重组质粒测序鉴定携带tert基因，鉴定结果证实构建正确。

(3)重组质粒pcmv-puror-t2a-tet3g的构建及鉴定

以质粒plv.o为模板，利用引物p5，p6扩增puror-t2a序列，并在上、下游引物中分别引入sacⅰ和ecorⅰ位点，引物序列如下：

puror-t2a-f(p5):5’-gagctcatgaccgagtacaagcccac-3’

puror-t2a-r(p6):5’-gaattctggaccagggttttcttcaa-3’

pcr反应体系如下：

引物p5,p6扩增条件为：98℃变性30s后进入循环；循环参数为：98℃10s，58℃15s，72℃1min；33个循环后4℃保存。将pcr产物回收并用sacⅰ和ecorⅰ限制性内切酶双酶切，再用sacⅰ和ecorⅰ限制性内切酶双酶切载体质粒pcmv-tet3g(clontech，货号：631335)，纯化回收后，用重组酶将puror-t2a基因亚克隆到线性表达载体pcmv-tet3g，转化e.colidh5a感受态细胞，获得载体质粒pcmv-puror-t2a-tet3g。通过pcr和重组质粒测序鉴定携带puror-t2a序列，鉴定结果证实构建正确。

(4)重组质粒pclxsn-ptre3g-tert的构建及鉴定

以步骤(2)中获得的重组质粒puc19-ptre3g-tert为模板，利用引物p7，p8扩增ptre3g-tert序列，并在上、下游引物中分别引入notⅰ和hindⅲ位点，引物序列如下：

ptre3g-tert-f(p7):5’-gcggccgcgagtttactccctatcagtg-3’

ptre3g-tert-r(p8):5’-aagctttcagtccaggatggtcttgaagtct-3’

pcr反应体系如下：

引物p7,p8扩增条件为：98℃变性30s后进入循环；循环参数为：98℃10s，58℃15s，72℃1min；33个循环后4℃保存。将pcr产物回收并用notⅰ和hindⅲ限制性内切酶双酶切，再用notⅰ和hindⅲ限制性内切酶双酶切载体质粒pclxsn(addgene，货号：12343)，纯化回收后，用重组酶将ptre3g-tert基因亚克隆到线性表达载体pclxsn，转化e.colidh5a感受态细胞，获得重组载体质粒pclxsn-ptre3g-tert。通过pcr和重组质粒测序鉴定携带ptre3g-tert序列，鉴定结果证实构建正确。

(5)重组质粒pclxsn-teton3g-tert的构建及鉴定

以步骤(3)中获得的重组质粒pcmv-puror-t2a-tet3g为模板，利用引物p9，p10扩增cmv-puror-t2a-tet3g-sv40poly(a)signal序列，并在上、下游引物中分别引入hindⅲ和rsrⅱ位点，引物序列如下：

p9:5’-aagcttgacattgattattgactagttatta-3’

p10:5’-cggaccgaacttgtttattgcagcttataatg-3’

pcr反应体系如下：

引物p9,p10扩增条件为：98℃变性30s后进入循环；循环参数为：98℃10s，58℃15s，72℃1min；33个循环后4℃保存。将pcr产物回收并用hindⅲ和rsrⅱ限制性内切酶双酶切，再用hindⅲ和rsrⅱ限制性内切酶双酶切步骤(4)中获得的重组质粒pclxsn-ptre3g-tert，纯化回收后，用重组酶将cmv-puror-t2a-tet3g-sv40poly(a)signal基因亚克隆到线性表达载体pclxsn-ptre3g-tert，转化e.colidh5a感受态细胞，获得重组载体质粒pclxsn-teton3g-tert。通过pcr和重组质粒测序鉴定携带cmv-puror-t2a-tet3g-sv40poly(a)signal序列，鉴定结果证实构建正确，如图1所示。

3、携带htert基因的逆转录病毒包装及滴度测定

提前一天将293t细胞接种到100mm的培养皿中，待细胞密度达到80-90％，利用阳离子脂质体介导转染法，将上述得到的重组质粒质粒pclxsn-teton3g-tert和包装质粒pumvc(addgene,货号：8449),pcmv-vsv-g(addgene,货号：8454)共转染293t细胞，于37℃培养。转染后分别于24h、48h收获病毒上清，1000rpm离心5min，用0.22μm滤器过滤病毒液后，病毒上清，2000rpm，4℃离心20min，弃除上清后，病毒沉淀用300μl无血清的脐带间充质干细胞培养基重悬,病毒悬液分装后用于病毒滴度检测或冻存于-80℃。

按照quicktiter^tmretrovirusquantitationkit(cellbiolabs，货号：vpk-120)说明书检测逆转录病毒的滴度。病毒滴度结果显示，浓缩后的逆转录病毒滴度可以达到2.8×10⁹。

4、脐带间充质干细胞药筛浓度优化

将生长良好的p3代脐带间充质干细胞以5-8×10⁴cells/孔，铺足够量的孔以进行后续的梯度实验，待细胞密度达到70-80％时，分别加入嘌呤霉素至终浓度为0μg/ml，0.01μg/ml，0.1μg/ml，0.2μg/ml，0.3μg/ml，0.4μg/ml处理48h后细胞全部死亡的最低药物浓度为后续实验拟用的浓度。当加入嘌呤霉素浓度大于0.2μg/ml时，培养48h后，目的细胞全部死亡，因此，目的细胞的嘌呤霉素最低致死浓度为0.2μg/ml，结果如图2所示。

将生长良好的p3代脐带间充质干细胞以5-8×10⁴cells/孔，铺足够量的孔以进行后续的梯度实验，待细胞密度达到70-80％时，分别加入强力霉素至终浓度为0μg/ml、0.01μg/ml、0.1μg/ml、0.2μg/ml、0.3μg/ml、0.4μg/ml处理48h后细胞全部死亡的最低药物浓度为后续实验拟用的浓度。当加入强力霉素浓度大于0.2μg/ml时，培养48h后，目的细胞全部死亡，因此，目的细胞的强力霉素最低致死浓度为0.2μg/ml，结果如图3所示。

5、可控永生化脐带间充质干细胞株构建

将生长良好的p3代脐带间充质干细胞接种于6孔板中，接种密度为2×10⁵个，待细胞密度达到40-50％时，将逆转录病毒以20moi感染目的细胞，另外设一组不感染病毒的野生型细胞作为对照，放入培养箱中继续培养，感染8h细胞换液并观察细胞状态，无明显毒性则继续培养，待细胞密度达90％以上时，加入含嘌呤霉素(0.2μg/ml)的完全培养基筛选至野生型细胞全部死亡。

6、强力霉素诱导tert基因表达

将步骤5中获得的细胞扩大培养后传代接种于6孔板中，接种密度为2×10⁵个，待细胞密度达到70％-80％时，加入适宜浓度(0.2μg/ml)的强力霉素诱导tert表达，另外设不加强力霉素的细胞及野生型细胞作为对照。细胞状态如图4所示，细胞增殖能力如图5所示：第5代humscs细胞株和第35代ihumscs-tert(+)细胞形态无明显差异，呈现长梭形，增殖能力良好，然而ihumscs-tert(-)逆转录病毒感染后未添加强力霉素诱导，细胞传代至第10代出现分化、细胞形态变大等衰老症状。

实施例三pcr及rt-pcr检测

为了检测tert基因能否在humscs细胞中表达，通过添加或不添加强力霉素诱导培养7天后，分别收集humscs，强力霉素诱导组ihumscs-tert(+)，未加强力霉素诱导组ihumscs-tert(-)细胞沉淀，提取3组细胞总rna，利用引物p11，p12扩增tert，以gapdh为内参，检测tert的mrna表达水平，引物序列如下：

tert-f(p11):5’-atgccgcgcgctccccgctg-3’

tert-r(p12):5’-tcagtccaggatggtcttga-3’

gapdh-f(p11):5’-gaaggtgaaggtcggagtc-3’

gapdh-r(p11):5’-gaagatggtgatgggatttc-3’

mrna水平上荧光定量pcr结果显示，ihumscs-tert(+)组细胞中tert基因在mrna水平上表达量较高，ihumscs-tert(-)和ihumscs细胞中没有检测到tert基因表达，结果如图6所示。

实施例四端粒酶活性检测

按照端粒酶活性检测试剂盒(rttelomerasedetectionkit，millipore，货号：s7710)说明书检测humscs、ihumscs-tert(-)和ihumscs-tert(+)细胞端粒酶活性。

ihumscs-tert(+)细胞不仅检测到tert的表达，而且具有端粒酶活性，然而humscs、ihumscs-tert(-)细胞没有检测到端粒酶活性，结果如图7所示。

实施例五强力霉素诱导ihumscs-tert实现可控永生化

为了检测tert基因在humscs-tert细胞中可控表达对细胞实现永生化的影响。在pd42,撤销了ihumscs-tert细胞培养基中的强力霉素，随后细胞分为2组：一组恢复强力霉素诱导组；另一组为不添加强力霉素组，tert基因的表达被关闭。

结果显示：撤销强力霉素后细胞增殖下降4-7pd,tert基因的表达被关闭，细胞开始出现衰老；当培养基中添加强力霉素诱导后，ihumscs-tert细胞回复原来的增殖状态结果如图8所示。

实施例六诱导分化能力

逆转录病毒感染的humscs细胞，通过添加强力霉素诱导tert基因表达，从而实现可控永生化。对ihumscs-tert(+)细胞系50代细胞接种9块爬片，选择3块爬片用于成骨诱导，成骨诱导培养基(弗元生物，货号：fy200006)培养14天后，进行染色鉴定；再选择3块爬片用于成脂诱导，成脂诱导培养基(弗元生物，货号：fy200007)培养12天后，进行染色鉴定；最后3块爬片用于成软骨诱导，成软骨诱导培养基(弗元生物，货号：fy200008)诱导培养后进行染色鉴定。结果如图9所示：ihumscs-tert(+)细胞传至第3代时在成骨、成脂、成软骨条件培养基中诱导培养后，仍然具有诱导分化细胞的能力。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110>广州辉园苑医药科技有限公司

<120>一种可控永生化的逆转录病毒载体和人脐带间充质干细胞及其构建方法

<130>cnp201810354

<160>8

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>379

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

gagtttactccctatcagtgatagagaacgtatgaagagtttactccctatcagtgatag60

agaacgtatgcagactttactccctatcagtgatagagaacgtataaggagtttactccc120

tatcagtgatagagaacgtatgaccagtttactccctatcagtgatagagaacgtatcta180

cagtttactccctatcagtgatagagaacgtatatccagtttactccctatcagtgatag240

agaacgtataagctttaggcgtgtacggtgggcgcctataaaagcagagctcgtttagtg300

aaccgtcagatcgcctggagcaattccacaacacttttgtcttataccaactttccgtac360

cacttcctaccctcgtaaa379

<210>2

<211>3405

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

gccaccatgccgcgcgctccccgctgccgagccgtgcgctccctgctgcgcagccactac60

cgcgaggtgctgccgctggccacgttcgtgcggcgcctggggccccagggctggcggctg120

gtgcagcgcggggacccggcggctttccgcgcgctggtggcccagtgcctggtgtgcgtg180

ccctgggacgcacggccgccccccgccgccccctccttccgccaggtgtcctgcctgaag240

gagctggtggcccgagtgctgcagaggctgtgcgagcgcggcgcgaagaacgtgctggcc300

ttcggcttcgcgctgctggacggggcccgcgggggcccccccgaggccttcaccaccagc360

gtgcgcagctacctgcccaacacggtgaccgacgcactgcgggggagcggggcgtggggg420

ctgctgctgcgccgcgtgggcgacgacgtgctggttcacctgctggcacgctgcgcgctc480

tttgtgctggtggctcccagctgcgcctaccaggtgtgcgggccgccgctgtaccagctc540

ggcgctgccactcaggcccggcccccgccacacgctagtggaccccgaaggcgtctggga600

tgcgaacgggcctggaaccatagcgtcagggaggccggggtccccctgggcctgccagcc660

ccgggtgcgaggaggcgcgggggcagtgccagccgaagtctgccgttgcccaagaggccc720

aggcgtggcgctgcccctgagccggagcggacgcccgttgggcaggggtcctgggcccac780

ccgggcaggacgcgtggaccgagtgaccgtggtttctgtgtggtgtcacctgccagaccc840

gccgaagaagccacctctttggagggtgcgctctctggcacgcgccactcccacccatcc900

gtgggccgccagcaccacgcgggccccccatccacatcgcggccaccacgtccctgggac960

acgccttgtcccccggtgtacgccgagaccaagcacttcctctactcctcaggcgacaag1020

gagcagctgcggccctccttcctactcagctctctgaggcccagcctgactggcgctcgg1080

aggctcgtggagaccatctttctgggttccaggccctggatgccagggactccccgcagg1140

ttgccccgcctgccccagcgctactggcaaatgcggcccctgtttctggagctgcttggg1200

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