一种白地霉Y069及其在白酒调味中的应用的制作方法

本发明属于酒类调味技术领域，具体涉及一种白地霉y069及其在白酒调味中的应用。

背景技术：

二锅头酒属于清香型白酒，白酒中98%的成分是乙醇和水，其余约2%为微量的风味物质，如酸类、酯类、醇类、醛酮类及芳香族化合物，这些仅占2%的微量有机化合物成为二锅头酒的呈香呈味物质，决定了二锅头白酒的风格特点和产品质量，同时各种风味物质之间协调的量比关系也是优质白酒的基本保证。在白酒的生产过程中，基础酒经过陈酿、勾兑后，主体风味物质已基本协调，而调味则是对基础酒所进行的最后一道精细加工，利用少量或微量的调味酒来弥补基础酒在香气和口感方面的不足，使其酒体优雅醇厚，回味悠长，具有画龙点睛的作用。

目前用于改善白酒风味的主要手段是通过特殊工艺制作调味酒或食品添加剂进行调味，基本可分为酸味调味酒、酯味调味酒、长酵调味酒、陈味调味酒等。而调味酒的生产工艺较为复杂，生产周期较长，且需要经过长期的储藏过程使其老熟以达到最好的调味效果，这大大降低了生产效率，而单独使用食品添加剂调味则会给酒体带来不自然、不协调的感官特征，降低了清香型白酒作为自然发酵产品的消费者预期价值。利用微生物发酵液对基础酒进行合理调味则无上述弊端，菌种来源于清香型白酒发酵酒醅，即满足了改善风味的需求，又符合食品安全要求，同时具有创新口味和不可复制性。

技术实现要素：

基于上述问题，本发明的目的在于通过梯度稀释法结合平板涂布法从酿造酒醅中分离获得一种白地霉菌株，以及利用该菌株生产调味液来改善白酒口感，有效提升产品质量。

本发明采用的技术方案是：

一种白地霉（geotrichumcandidum）y069，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期2018年10月12日，保藏编号：cgmccno.16581。

本发明所述白地霉调味液添加入白酒中混匀，在白酒调味中应用。

进一步的，所述的调味液添加量为0.25‱。

进一步的，所述的白酒为清香型白酒。

进一步的，所述的清香型白酒为二锅头白酒。

本发明所述的白地霉的筛选及调味液的制备方法，包括如下步骤：

（1）白地霉y069分离鉴定：称取10g大茬发酵酒醅溶解于40ml无菌水中，振荡器震荡混匀，制成微生物菌悬液，标记浓度为10^-1，依次稀释梯度为10^-2、10^-3、10^-4、10^-5，吸取0.1ml不同梯度菌悬液涂布ypd平板中，28~32℃培养48~72h，根据形态挑取差异菌落进行菌种鉴定；提取不同酵母dna后，利用pcr扩增酵母菌d1/d2区，测序后进行序列矫正比对；

（2）白地霉y069培养：接种环挑取一环白地霉菌体接种于ypd平板中，25~30℃培养48h活化菌体，挑取一环新鲜菌体接种于种子培养液中，28℃，180r/min条件下培养48h；

（3）白地霉y069扩大培养：吸取1~5%的步骤1中液体转入新配制的种子培养液中扩大培养，培养条件为25~28℃、转速180r/min培养8~9d；培养结束后，8000rpm转离心获得上清液，备用；

（4）调味液处理：步骤（3）制备的上清液真空抽滤过0.25滤膜后即可得到白地霉调味液，备用。

进一步的，所述的步骤（2）和（3）中的种子培养液为用10%豆芽汁配制的20g/l的葡萄糖溶液，115℃灭菌30min。

本发明白地霉y069的筛选方法操作简单、所选菌种易于分离、成本较低，利用白地霉调味液提高白酒的质量，可控性强、节能环保。

本发明所利用的白地霉y069调味液不会破坏酒体骨架成分，并能有效提升白酒口感，并且持续时间长，在储存18个月后仍能达到较好的改善效果，具有很好的实际应用效果。

附图说明

图1为白地霉y069的鉴定发育树

图2为在40×100倍下白地霉y069的形态。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的技术内容进行详细的说明。

实施例1

白地霉y069分离鉴定

称取10g大茬发酵酒醅溶解于40ml无菌水中，振荡器震荡混匀，制成微生物菌悬液，标记浓度为10^-1，依次稀释梯度为10^-2、10^-3、10^-4、10^-5，吸取0.1ml不同梯度菌悬液涂布ypd平板中，28~32℃培养48~72h，根据形态挑取差异菌落进行菌种鉴定。

提取不同酵母dna后，利用pcr扩增酵母菌d1/d2区，测序后进行序列矫正比对（详见附图1）。

利用mega5.10软件将模式菌株和鉴定菌株的基因序列进行比对，该菌种与菌galactomycescandidumcbs357.86相似度为100%，因此确定为geotrichumcandidum，标记为y069。

挑取白地霉y069菌体进行显微观察，如附图2所示，发现y069不产生有性孢子，以分生孢子进行繁殖，孢子梗外露，子实体无明显界限，菌落呈绒毛状，分生孢子和孢子梗无色。初步认定为半知菌类、丛梗孢目、丛梗菌科。分生孢子梗短，直，顶端分生孢子串生，为丛梗菌孢目中的卵形孢霉族。分生孢子近乎方形或长方形，短两端平切，由菌丝断裂而形成。属于卵形孢霉族、地霉属。同时由于其菌丝为丛白色粉状，分生孢子5~10×4μm。

结合分子鉴定结果，确定y069属于半知菌类、丛梗孢目、丛梗菌科、孢霉族、地霉属、白地霉（geotrichumcandidum）。

实施例2

白地霉y069调味液的制备

（1）用10%豆芽汁配制的20g/l的葡萄糖溶液，115℃灭菌30min，作为种子培养液备用；

（2）接种环挑取一环白地霉菌体接种于ypd平板中，25℃培养48h活化菌体，挑取一环新鲜菌体接种于100ml种子培养液中，28℃，180r/min条件下培养48h；

（3）吸取1~5%的步骤（2）中液体转入新配制的500ml种子培养液中扩大培养，培养条件为25℃、转速180r/min摇床培养8d；培养结束后，8000rpm转离心15min，收集上清液，0.25滤膜真空抽滤，所得液体即可用于酒体添加。

实施例3

白地霉y069调味液的制备

（1）用10%豆芽汁配制的20g/l的葡萄糖溶液，115℃灭菌30min，作为种子培养液备用；

（2）接种环挑取一环白地霉菌体接种于ypd平板中，28℃培养48h活化菌体，挑取一环新鲜菌体接种于100ml种子培养液中，28℃，180r/min条件下培养48h；

（3）吸取1~5%的步骤（2）中液体转入新配制的500ml种子培养液中扩大培养，培养条件为26℃、转速180r/min摇床培养9d；培养结束后，8000rpm转离心15min，收集上清液，0.25滤膜真空抽滤，所得液体即可用于酒体添加。

实施例4

白地霉y069调味液的制备

（1）用10%豆芽汁配制的20g/l的葡萄糖溶液，115℃灭菌30min，作为种子培养液备用；

（2）接种环挑取一环白地霉菌体接种于ypd平板中，30℃培养48h活化菌体，挑取一环新鲜菌体接种于100ml种子培养液中，28℃，180r/min条件下培养48h；

（3）吸取1~5%的步骤（2）中液体转入新配制的500ml种子培养液中扩大培养，培养条件为28℃、转速180r/min摇床培养9d；培养结束后，8000rpm转离心15min，收集上清液，0.25滤膜真空抽滤，所得液体即可用于酒体添加。

实施例5

白地霉调味液差异风味分析

1、白地霉调味液挥发性成份检测

（1）检测设备

agilent7890b气质连用仪氢火焰离子化检测器（fid），分流/不分流进样口，agilentopenlab工作站

（2）检测条件

色谱柱：db-ffap(60m×0.25mmi.d.×0.25um，j&wscientific

进样口温度：250℃

进样量：1μl

进样方式：不分流

检测器温度：280℃

柱流速：2ml/min

升温程序：50℃恒温2min，以4℃/min的速度升温至230℃，保持15min

ms条件：ei电离源，电子能量70ev，离子源温度230℃，扫描范围30.00～350.00amu

（3）检测结果

对照样品为未添加菌体的种子培养液，处理方法与调味液处理方法一致。如表1所示，白地霉调味液中22种酯、4种酸、5种醇及2种其他物质，共33种挥发性微量成分峰图面积高于对照样品的峰图面积。

表1调味液酯、酸、醇共33种挥发性微量成分与对照样品的峰图面积对比

2、白地霉调味液不挥发性成份检测

（1）检测设备

watersxevog2-xsq-tof；acquityuplci-class（waters）

（2）检测条件

acquityuplchsst3column；2.1×100mm；

流动相为乙腈/水=5/95（v/v），1mins；

乙腈/水=5~80/95~20（v/v），8mins；乙腈/水=95/5（v/v），1mins；

流速为0.3ml/min；柱温为25°c；离子源：电喷雾离子源（esi+）；

扫描模式：灵敏度模式；毛细管电压：1.0kv；源温度：120℃；

雾化气温度：550℃；雾化气流速：1000l/h；锥孔气流速：50l/h；

（3）检测结果

对照样品为未添加菌体的种子培养液，处理方法与调味液处理方法一致。如表2所示，白地霉调味液中共检测出18种不挥发微量成分的峰图面积高于对照组的峰图面积。

表2调味液中检测出18种不挥发微量成分与对照样品的峰图面积对比

实施例6

调味液添加量的优化

将制备好的新鲜调味液添加到38%vol二锅头成品酒中，添加量分别为0.25‱、0.5‱、0.75‱，随后由5位国家级评酒师进行品评（详见表3）。

表3调味液添加量的优化结果

表3品评结果表明，不同添加量对白酒口感均有改善，综合3种添加量评语，0.25‱添加量可有效改善38%vol二锅头白酒口感，提升酸爽感，因此确定0.25‱添加量为最优添加比例。

实施例7

调味液储存实验

10斤38%vol二锅头白酒按最优添加比例0.25‱，添加新鲜制备白地霉调味液125μl，混匀后密封室温储藏9个月后，以同样储藏9个月标样为对照组，由5位国家级评酒师进行品评（详见表4）。

表4调味液储存实验结果

表4所示，添加调味液酒样经过9个月储藏后，调味液能够有效提升成品酒后味，对储存后白酒质量仍有改进作用。

实施例8

调味液在38%vol二锅头白酒中大规模应用

将白地霉菌体利用种子培养液28℃、180r/min摇床培养9d，8000g离心15min后收集上清液过0.25滤膜真空抽滤，按照最优添加量0.25‱，将600ml调味液添加到24吨38%vol二锅头清香型白酒灌中，混匀后取样及留样，由5位国家级品酒师对添加样品进行样品品评并汇总结果（详见表5）。

表5调味液在38%vol二锅头白酒中大规模应用结果

表5所示，大规模添加效果与小试结果一致，调味液改善了38%vol二锅头口感，有效提升了酒体酸爽感。

储藏样品于室温密封储藏，18个月后以未添加样品为对照组，由5位国家品酒师进行品评汇总及骨架成份测定方法。

（1）测定仪器

agilent7890b气相色谱仪，氢火焰离子化检测器（fid），分流/不分流进样口，agilentopenlab工作站。

（2）测定条件

色谱柱：cpwax5750m*0.25mm*0.2μm；

进样口温度：250℃；

进样量：0.8μl；

进样方式：分流，分流比=30；

控制方式：流量；

检测器温度：280℃；

柱流速：1ml/min；

空气流量：300ml/min；

氢气流量：30ml/min；

尾吹气流量：25ml/min；

柱箱温度：35℃保持3min，以1℃/min升至50℃，再以20℃/min升至200℃，保持15min。

（3）测定结果

经过18个月储藏后，调味液可以有效提升38%vol二锅头酸爽感，改善口感，提高质量（详见表6）。

表6储藏后感官结果

表7所示，经过18个月储藏后，对照组和调味液添加组在骨架成份上差异不大，说明调味液的添加属于微量组分间的风味平衡作用，不会影响成品酒骨架成份，从口味酸爽感，香气口味复合感方面提升了白酒的品质。

表7骨架成份结果

实施例9

调味液在46%vol二锅头清香型白酒中大规模应用

将白地霉菌体利用种子培养液28℃、180r/min摇床培养9d，8000g离心15min后收集上清液过0.25滤膜真空抽滤，按照最优添加量0.25‱，将600ml调味液添加到24吨46%vol二锅头清香型白酒罐中，混匀后取样及留样，由5位国家级品酒师对添加样品进行样品品评并汇总结果。

表8储藏后感官结果

表8所示，调味液对46%vol二锅头改善效果明显，改善了酒体柔和度，使后味醇厚有余味，有效的提升了46%vol二锅头质量。

储藏样品于室温密封储藏，18个月后，以未添加样品为对照组，由5位国家品酒师进行品评汇总及骨架成份测定。

表9储藏18个月后感官结果

表9所示，经过18个月储藏后，调味液仍然可以改善酒体，提高酒的后味。

表10骨架成份结果

表10所示，经过18个月储藏后，对照组和调味液添加组在骨架成份上差异不大，说明调味液的添加属于微量组分间的风味平衡作用，不会影响成品酒骨架成份，从口味柔和度方面提升了白酒的品质。

本领域的普通技术人员将会意识到，这里所述的实施例是为了帮助读者理解本发明的实施方法，应被理解为本发明的保护范围并不局限于这样的特别陈述和实施例。本领域的普通技术人员可以根据本发明公开的这些技术启示做出各种不脱离本发明实质的其它各种具体变形和组合，这些变形和组合仍然在本发明的保护范围内。