一种鉴定不结球白菜速俊316种子纯度的引物及应用的制作方法

本发明属于生物技术领域，涉及一种鉴定不结球白菜速俊316杂交种种子纯度的引物序列及应用。

背景技术：

不结球白菜（brassicarapal.ssp.chinensismakino）属十字花科芸薹属作物，又名小白菜、青菜、油菜（我国北方地区），原为我国长江中下游及以南地区的一种全年四季种植和供应的蔬菜，现已成为一种重要的全国性绿叶蔬菜，并且在日本、韩国等国外的种植面积也越来越大。

不结球白菜传统的种子纯度鉴定方法，一般采取田间种植，待生长到特定时期，观察生长特性，鉴定种子的纯度，具有周期长、用工量大、易受环境影响等缺点。随着分子生物学的发展，分子标记辅助育种技术在农业育种中的应用越来越广，利用indel分子标记，可以直接鉴定样品间基因组dna水平的差异，用于鉴定种子的纯度，具有用时短、重复性好、不受环境影响等优点。

速俊316是天津科润农业科技股份有限公司蔬菜研究所育成的不结球白菜系列杂交种之一，具有生长速度快，束腰早，株型美观，产量高，适收期长，品质佳等特点。该品种叶色鲜绿，叶柄较短，宽厚亮泽，无蜡粉，抗病性强，适应性广。该品种一直采用传统的田间方法鉴定种子纯度，经常造成种子纯度鉴定时间与销售周期相冲突。需要开发一种快速、准确的种子纯度鉴定方法，以适应速俊316的推广及用种量的增加。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种用于检测速俊316不结球白菜杂交种种子纯度的indel标记的引物序列及应用，为实现该目的，本发明采用以下技术方案：

一种用于检测速俊316不结球白菜杂交种种子纯度的特异性引物，其特征在于它为seqidno:1-2所示的核苷酸序列：

atgcttggagatgagacatggatcaagseqidno:1

ttgctcatatcaccatcatacagatagggseqidno:2。

本发明进一步公开了采用所述的特异性引物检测速俊316不结球白菜杂交种种子纯度的方法，其特征在于按如下的步骤进行：

（1）提取速俊316杂交种待测样品的基因组dna；

（2）以上述样品的基因组dna为模板，以标记引物为特异性引物进行pcr扩增；反应体系为：10µl体系，包括：10×pcrbuffer，1.0µl；2.5mmdntp，0.2µl；10µmol·l-1primers，0.4µl；5u·µl-1taq，0.2µl；50ng·µl-1dna，1.5µl；ddh2o，6.7µl。采用的扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，57℃复性30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃终延伸5min；所述的特异性引物为：

atgcttggagatgagacatggatcaagseqidno:1

ttgctcatatcaccatcatacagatagggseqidno:2；

（3）将上述pcr扩增获得的产物，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分离、银染；

（4）统计上述银染的结果：同时含有父本和母本双亲材料条带的种子为杂交种的种子，只含有母本或父本材料条带的为非杂交种的种子，所检测速俊316杂交种纯度（%）=（检测种子总粒数-非杂交种粒数）/（检测种子总粒数）×100%。

本发明更进一步公开了检测方法在用于快速准确速俊316不结球白菜杂交种种子纯度方面的应用。实验结果显示：本发明可以快速、准确地鉴定速俊316不结球白菜杂交种种子纯度。

本发明主要解决了速俊316不结球白菜杂交种种子纯度传统田间鉴定方法用时长、易受环境影响等缺点，主要的难点在于开发速俊316不结球白菜杂交种种子父本与母本间具有多态性、稳定性好、易区分的分子标记引物。

本发明公开的用于检测速俊316不结球白菜杂交种种子纯度的特异性引物及应用与现有技术相比，所具有的积极效果在于：

通过本发明提供的特异性引物及应用，可在实验室内3-5小时完成速俊316杂交种的种子纯度鉴定，具有快速、稳定、不受环境影响等优点，能替代传统田间种子纯度鉴定方法，有利于速俊316商品种种子高效准确的质量控制及该品种的进一步推广。

附图说明

图1为indel引物a10-2在津研快绿1号父本、母本及杂交种样品的电泳图；

m表示dnamarker，1-3为速俊316父本的三个重复材料，4-5为速俊316母本材料的三个重复材料，7-9为速俊316杂交种的三个重复材料；

图2为利用indel引物检测速俊316杂交种46个样品纯度的电泳图；

m表示dnamarker，p1表示父本材料，p2表示母本材料，其余为杂交种材料，其中三角所在位置表示该材料为非杂交种材料，其余都为杂交种材料。

具体实施方式

除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。以下实施例中所使用的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所用的仪器、材料和试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。所用到的父本材料ns07、母本材料kr08可向天津科润农业科技股份有限公司蔬菜研究所大白菜课题组索取，速俊316不结球白菜杂交种有市售。

实施例1

一、纯度鉴定indel引物的筛选

根据大白菜基因组重测序数据，设计多对引物，对速俊316、父本、母本各三个单株进行多态性检测，筛选出具有共显性差异的引物对a10-2，序列如下:

f:5’-atgcttggagatgagacatggatcaag-3’(seqidno:1)

r:5’-ttgctcatatcaccatcatacagataggg-3’(seqidno:2)

该标记重复性好、条带清晰，以该引物为特异性引物，以待测样品的基因组dna为模板进行pcr扩增，对扩增产物进行电泳分离并染色检测，结果显示：在父本材料中可扩增出133bp的特异性条带，在母本材料中能够扩增出104bp的特异性条带，速俊316杂交种材料中同时扩增出133bp和104bp的特异性条带，如图1所示。

二、速俊316种子纯度鉴定

1.待测样品基因组dna的提取

材料为父本、母本材料，以及来源于制种基地5户签约农户生产的速俊316杂交种。利用ctab法提取母本材料、父本材料，以及速俊316杂交种待测样品92株的叶片基因组dna，具体步骤如下：取幼嫩叶片0.2g入1.5ml离心管中，加50μl2%ctab提取缓冲液，研磨，后补齐至400μl，65℃水浴30min；加入400μl氯仿：异戊醇（24:1），轻摇5min。12000rpm离心5min；取上清200μl，加入预冷的异丙醇200μl混匀，-20℃放置20min；12000rpm离心10min；弃上清，加入150μl预冷乙醇，轻轻混匀洗净，10,000rpm离心5min；弃上清，晾干或吹干；加蒸馏水100μl溶解dna，室温放置1h；用蒸馏水将dna稀释到50ng/μl，作为pcr模板使用或-20℃保存备用。

2.pcr扩增：以上述待测样品的基因组dna为模板，以本发明提供的indel引物为特异性引物进行pcr扩增，获得扩增产物。采用的反应体系为：10µl体系，包括：10×pcrbuffer，1.0µl；2.5mmdntp，0.2µl；10µmol·l-1primers，0.4µl；5u·µl-1taq，0.2µl；50ng·µl-1dna，1.5µl；ddh2o，6.7µl。采用的扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，57℃复性30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃终延伸5min.

3.扩增结果的电泳分离与染色：利用8%的非变性聚丙型酰胺凝胶电泳对上述pcr产物进行电泳分离，利用银染显色，统计电泳条带的大小。

4.结果分析与统计：待测样品pcr扩增产物的电泳条带同时含有父本和母本材料扩增产物的条带，为速俊316杂交种；只含有父本或母本材料扩增产物的条带，为父本或母本材料自交的种子，如图2所示。

经统计，来源于制种基地5户签约农户的速俊316杂交种的种子纯度如表1所示，其中农户1生产的速俊316种子纯度为94.6%，农户2生产的速俊316种子纯度为98.9%，农户3生产的速俊316种子纯度为100%，农户4生产的速俊316种子纯度为97.8%，农户5生产的速俊316种子纯度为100%。

通过与传统的田间鉴定结果比较，发现利用本发明提供的indel分子标记对速俊316杂交种纯度的鉴定结果与田间鉴定结果一致，说明该发明可以快速、准确地鉴定速俊316不结球白菜商品种的种子纯度。

表1速俊316制种基地5户农户生产的种子纯度鉴定结果

实施例2

传统鉴定方法比较试验：将制种基地5户签约农户生产的速俊316商品种待检测样品，每户随机取种约100粒，田间露地开沟，按每平方米约200株的密度播种，播种后大约3天出齐苗，待生长到7叶1心阶段，根据待检测样品的株高、叶色、叶形，叶柄颜色及长度、宽度等表现性状是否符合速俊316商品种的统一性和一致性，判断待检测样品是否为津研快速1号商品种，统计待检测样品的种子纯度。

结论：利用本发明鉴定速俊316不结球白菜杂交种种子纯度的结果，和通过传统的田间鉴定种子纯度的结果一致，同时该发明具有快速、不受环境影响等优点，说明本发明可以替代传统的田间鉴定方法，用于鉴定速俊316不结球白菜商品种的种子纯度。

熟悉本技术领域的技术人员应当理解，上述具体实施例只是说明性的，而不是用于对本发明的范围的限定，熟悉本领域的技术人员在依照本发明的精神所做的等效的修饰以及改变，都应该涵盖在本发明的权利要求所保护的范围内。

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<110>天津科润农业科技股份有限公司

<120>一种鉴定不结球白菜速俊316种子纯度的引物及应用

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