一种复制缺陷型猪圆环病毒、其制备方法及应用与流程

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种复制缺陷型猪圆环病毒（pcv）、其制备方法及应用。

背景技术：

猪圆环病毒及其相关疾病：猪圆环病毒（porcinecircovirus，pcv）是迄今发现的一种最小的动物病毒。pcv病毒为单链dna病毒，现已知pcv有3个亚型，即pcv1、pcv2和pcv3，其中pcv1为非致病性的病毒，pcv3为刚才出现的新型pcv病毒，其致病性目前未知，而pcv2是断奶仔猪多系统衰竭综合症（postweaningmμltisystemicwastingsyndrome，pmws）的主要病原。pcv2引起的pmws最早发现于加拿大（1991），很快在欧美及亚洲一些国家包括我国发生和流行。后来大量的研究发现，除pmws外，pdns（猪皮炎与肾病综合征）、pnp（增生性坏死性肺炎）、prdc（猪呼吸道疾病综合征）、繁殖障碍、先天性颤抖、肠炎等疾病亦与pcv2感染有重要关联。pcv2感染相关的猪病死亡率为10%～30%不等，感染严重的猪场甚至高达40%，给养猪业造成重大的经济损失。此外，大量研究表明pcv2感染能引起猪严重的免疫障碍，从而引起其它继发性传染病（如猪瘟、蓝耳病、链球菌病等）。因此pcv2已被各国公认为对养猪业威胁最大的病毒之一。

猪圆环病毒感染的免疫防治技术：与大多数病毒病一样，猪圆环病毒感染目前没有的特异的治疗药物，疫苗是控制猪圆环病毒感染最有效的手段。现在已有多种pcv2全病毒灭活疫苗、原核表达的pcv2-cap亚单位疫苗和以杆状病毒为载体的真核表达pcv2-cap亚单位疫苗用于生产实践。但猪圆环病毒感染在世界范围内、特别是在中国仍然是给养猪业造成最大经济损失的传染病，说明这些现有pcv2疫苗的临床防控效果依然欠佳。

现有病毒疫苗技术的不足：现有的病毒疫苗按照技术原理的不同主要包括3类，即灭活病毒疫苗、弱毒活疫苗和基因工程亚单位疫苗。灭活疫苗为用灭活的病原体制备的疫苗，安全性很高，但由于灭活过程会导致疫苗的免疫原性改变，且抗原递呈效率低，故免疫防治效果欠佳。弱毒活疫苗是用毒力较低的病毒株制备的疫苗，尽管其因较好的免疫原性和抗原递呈效率而具较好的免疫效果，但是由于弱毒活疫苗在动物体内仍能进行复制传代，而传代过程中病毒可能发生无法预测的突变、进化从而恢复毒力甚至产生毒力更强的毒株，因此弱毒活疫苗的疫苗安全性和生物安全性较低。基因工程亚单位疫苗是用基因工程技术表达的病原体的部分蛋白抗原，安全性虽然较好，但其免疫原性不完整，故其免疫效果也不理想。

技术实现要素：

为解决上述问题，本发明提供一种复制缺陷型猪圆环病毒的制备方法，该制备方法得到的复制缺陷型pcv病毒具有与野生型pcv病毒完全相同的病毒蛋白一级结构和高级结构以及大小和形状完全相同的病毒粒子，因此具有与野生型pcv病毒具完全有相同的感染能力和免疫原性，且该制备方法得到的复制缺陷型pcv病毒不能在正常的宿主细胞（包括动物活体细胞）内复制传代。

本发明提供的复制缺陷型猪圆环病毒的制备方法包括以下步骤：

（1）pcv反式互补转基因细胞株的构建：通过稳定转染或慢病毒转导技术将野生型pcv的cap基因或rep基因的真核表达质粒插入任一可复制pcv的细胞株的基因组中即得，优选地，所述任一可复制pcv的细胞株为pk-15细胞株或vero细胞株；

（2）复制缺陷型pcv感染性克隆的构建：通过pcr扩增所选pcv毒株的基因组全长dna，克隆入质粒载体中，然后通过dna定点突变技术（site-directedmutagenesis）构建复制缺陷型pcv感染性克隆。优选的，所述dna定点突变技术是以下三种中的任意一种：①在野生型pcv的cap基因或rep基因的orf序列中引入一个或多个提前终止密码子（tag、taa或tga）；②在野生型pcv的cap基因或rep基因的orf序列的5’端引入单碱基或双碱基的插入突变或删除突变；③用外源基因整码（in-frame）插入置换cap基因或rep基因的部分或全部orf序列；

（3）复制缺陷型pcv感染性克隆的转染和病毒拯救与培养：用复制缺陷型pcv感染性克隆通过脂质体转染技术转染上述相应的pcv反式互补转基因细胞株，即可拯救获得复制缺陷型pcv病毒，并通过所述pcv反式互补转基因细胞株培养和制备复制缺陷型pcv。

当复制缺陷型感染克隆是通过dna定点突变cap获得时，所述相应的pcv反式互补基因细胞株是通过稳定转染或慢病毒转导技术至少将cap的真核表达质粒转入可复制pcv的细胞株获得的；当复制缺陷型感染克隆是通过dna定点突变rep获得时，所述相应的pcv反式互补基因细胞株是通过稳定转染或慢病毒转导技术至少将rep的真核表达质粒转入可复制pcv的细胞株获得的。

上述复制缺陷型pcv病毒能在上述相应pcv反式互补转基因细胞株中复制传代并得以大量制备复。

上述复制缺陷型pcv的基因组为功能缺陷型基因组（其基因组复制所必须的rep基因或子代病毒包装所必须的cap基因无法正常表达），当其感染正常宿主细胞（指上述pcv反式互补转基因细胞株以外的其它宿主细胞）后不能完成病毒基因组复制或子代病毒粒子的包装而不能产生子代病毒，所以其对正常宿主细胞来说是一种复制缺型病毒（即不能形成有感染能力的子代病毒）。但是，所述复制缺陷型pcv具有与野生型pcv完全相同的病毒衣壳，从而具有与野生型pcv完全相同的感染能力和免疫原性。因此，所述复制缺陷型pcv可以用作预防或治疗猪圆环病毒感染的新型活病毒疫苗，还可作为用作检测pcv抗体的检测抗原。

本发明所述复制缺陷型猪圆环病毒作为治疗性疫苗可能的机制如下：（1）所述复制缺陷pcv病毒进入已感染野生型pcv的细胞后，其功能缺陷的基因组将与野生型病毒的正常基因组在基因组dna复制环节发生竞争，从而竞争性抑制野生型病毒基因组的复制效率。（2）其功能缺陷的基因组将与野生型病毒的正常基因组在子代病毒包装环节发生竞争，从而竞争性抑制野生型病毒的子代病毒包装效率。

若用外源抗原基因整码（in-frame）插入置换cap基因的部分orf序列构建敲除cap的复制缺陷pcv病毒；该复制缺陷pcv病毒感染进入正常宿主细胞后，虽然不能形成子代病毒颗粒，但其基因组dna仍能正常进行复制并表达插入的外源抗原基因，从而呈递给免疫系统，激发针对外源抗原的免疫反应，因此，其具有作为表达其它病原微生物抗原基因的重组疫苗载体的潜力。

本发明所述复制缺陷猪圆环病毒作为表达其它病原微生物抗原基因的重组疫苗载体可能的机制如下：用外源抗原基因整码（in-frame）置换cap基因的部分或全部orf序列构建敲除cap的复制缺陷pcv病毒；该复制缺陷pcv病毒感染进入正常宿主细胞后，虽然不能形成子代病毒颗粒，但其基因组dna仍能正常进行复制，并表达插入的外源抗原基因，从而呈递给免疫系统，激发针对外源抗原的免疫反应。

本发明提供的复制缺陷型猪圆环病毒的制备方法也可以应用于圆环病毒科的其它圆环病毒以制备相应的复制缺陷型圆环病毒疫苗。

本发明中所述猪圆环病毒（pcv）包括pcv1、pcv2、pcv3或将来可能出现的其它亚型的pcv病毒。

本发明的有益效果在于：

与上述3种传统病毒疫苗相比，本发明所述复制缺陷pcv用作预防性疫苗时具有下述技术优势：（1）其具有与野生型病毒相同的感染能力，能高效感染动物的抗原递呈细胞（apcs）从而高效激发宿主的免疫反应，因此比灭活病毒疫苗和基因工程亚单位疫苗具有更好的免疫保护效果。（2）其具有与野生型病毒完全相同的免疫原性，能激发动物产生完整的、针对野生型病毒感染的免疫力，因此比灭活病毒疫苗和基因工程亚单位疫苗具有更好免疫保护效果。（3）其为复制缺陷型病毒，作为疫苗进入动物体内后无法复制、传代，即无法在动物体内发生进化，因此与传统的弱毒活疫苗相比具有更高的疫苗安全性和生物安全性。

本发明所述的复制缺陷pcv病毒用作检测pcv抗体的检测抗原的优势在于：（1）其具有与野生型病毒完全一致的病毒衣壳（capsid）蛋白，用作pcv抗体检测抗原时，与重组表达的检测抗原相比免疫原性更完整，因此其对pcv抗体检测的结果更真实和准确。（2）其为复制缺陷病毒，因此与用野生型病毒或弱毒株病毒用作检测抗原相比具有极高的生物安全性。

本发明提供的复制缺陷型猪圆环病毒的制备方法操作简单，可快速和大批量的生产复制缺陷型猪圆环病毒，有助于实现复制缺陷型猪圆环病毒的产业化生产。

具体实施方式

以下结合实施实例对本发明进行进一步的说明。

本发明所采用的试剂和材料若非特殊说明，均可通过商业渠道获得。

实施实例1：基于cap反式互补转基因细胞株制备pcv2复制缺陷病毒及其免疫效力验证

1、cap反式互补转基因pk-15细胞株构建

1）pcv2基因组dna提取：用市售pcv2灭活疫苗（dbn-sx07株）1ml，加入等体积氯仿，高速震荡4分钟，12000rpm离心10分钟，吸取上层水相，用病毒dna提取试剂盒提取pcv2基因组dna。

2）cap真核表达载体构建：以上一步获得的pcv2基因组dna为模板，设计上游引物含kozak序列的引物对（5'gctagcgccaccatgacgtatccaaggaggcgt3'，5'ggatccttaagggttaagtggggggtct3'，下划线部分为模板结合区序列），通过pcr扩增、t-a克隆、nhei和bamhi双酶切亚克隆将pcv2的cap基因完整编码序列克隆入通用真核表达质粒pcdna3.1⁺,得到pcdna-cap质粒。

3）cap真核表达载体的瞬时转染验证：用pcdna-cap质粒通过脂质体转染技术转染pk-15细胞株，36小时后用pcv2阳性血清进行间接免疫荧光试验（ifa），转染的细胞呈现绿色荧光，说明pcdna-cap质粒能在pk-15细胞中正确表达cap蛋白。

4）pk-15细胞的稳定转染：用内切酶mfei将40μgpcdna-cap质粒线性化，然后通过脂质体转染技术转染pk-15细胞株，转染后24小时传代，当细胞融合度达到50-70%时更换为含合适浓度g418的培养基进行加压筛选，每3天换一次含合适浓度g418的培养基，直到有g418抗性的细胞簇生长。

5）cap反式互补转基因细胞株单克隆筛选：通过无限稀释法对上一步获得的g418抗性pk-15细胞簇进行单克隆化筛选，结合上述ifa试验获得能稳定表达pcv2-cap的cap反式互补转基因pk-15单克隆细胞株。

2、pcv2感染性克隆的构建及其cap敲除突变

1）pcv2感染性克隆构建：根据dbn-sx07-2株基因组序列在其rep基因和cap基因尾端间区设计引物对（5’ttttttatcacttcgtaatggtttt3’，5’gactcagtaatttatttcatatggaaat3’），以前述提取的pcv2基因组dna为模板，用q5高保真dna聚合酶扩增pcv2基因组全长dna，然后采用t-a克隆技术克隆入puc-t载体，即得pcv2的野生型感染性克隆puc-pcv2。

2）cap敲除突变：以pcv2的野生型感染性克隆puc-pcv2为模板，设计引物对（5'tagtgataaactatcaagcgaaccacagtc3'，5'ggtgcgggagaggcgggt3'，上游引物的下划线部分为对应cap53-55位氨基酸的3个连续终止密码子），采用大连宝生物的dna突变试剂盒mutanbestkit并按其说明书操作，即得敲除cap的pcv2感染性克隆puc-pcv2^δcap。

、pcv2野生型病毒及cap敲除病毒的拯救

1）用pcv2的野生型感染性克隆puc-pcv2质粒20μg转染正常pk-15细胞株，盲传3代后用ifa测定病毒滴度（tcid50），并收获野生型pcv2病毒。

2）用敲除cap的pcv2感染性克隆puc-pcv2^δcap质粒20μg转染上述cap反式互补转基因pk-15细胞株，盲传3代后用ifa测定病毒滴度（tcid50），并收获敲除cap的突变病毒pcv2^δcap。

4、突变病毒pcv2^δcap的复制缺陷验证

1）离体培养细胞验证：用10^4.0tcid50突变病毒pcv2^δcap感染正常pk-15细胞，同时设相等感染剂量的同株野生型病毒感染对照，盲传3代后进行ifa检测，结果表明：pcv2^δcap感染的正常pk-15细胞传代3次后无法检测到病毒，而同株野生型病毒感染的正常pk-15细胞传代3次后有大量病毒存在，说明cap敲除的突变病毒pcv2^δcap不能在正常pk-15细胞复制传代。

2）小鼠活体动物验证：在spf实验环境下，用两组各6只spf级balb/c小鼠分别腹腔内接种0.2*10^5.0tcid50突变病毒pcv2^δcap和同株野生型病毒，每天一次连续接种3天。最后一次接种2周后分别无菌采集两组小鼠的静脉血、脾脏、淋巴结组织样本，提取病毒dna，用pcv2的rep基因特异引物（5'tgttggcgaggagggtaatgag3'，5'tcccaccacttgtttctaggcg3'）进行pcr检测。结果表明：6只接种了pcv2^δcap小鼠的三种组织样本的特异性pcr检测均为阴性，而6只接种了同株野生型pcv2病毒小鼠的三种组织样本的特异性pcr检测均为阳性，说明cap敲除的突变病毒pcv2^δcap不能在小鼠体内复制。

3）仔猪活体动物验证：在清洁级动物实验环境下，用两组各6只pcv2抗原和抗体检测均为阴性的3周龄仔猪分别鼻腔内接种突变病毒pcv2^δcap和同株野生型病毒，接种剂量均为2*10^6.0tcid50，每天一次连续接种3天。最后一次接种2周后分别无菌采集两组仔猪的静脉血、脾脏、淋巴结组织样本，提取病毒dna，用pcv2的rep基因特异引物进行pcr检测。结果表明：6只接种了突变病毒pcv2^δcap仔猪的三种组织样本的特异性pcr检测均为阴性，而6只接种了同株野生型pcv2病毒仔猪的三种组织样本的特异性pcr检测均为阳性，说明cap敲除的突变病毒pcv2^δcap不能在仔猪体内复制。

pk-15细胞感染、小鼠和仔猪活体感染实验均证实所构建的突变病毒pcv2^δcap不能在其正常宿主细胞内复制传代，因此其对正常宿主细胞来说是一种复制缺陷病毒。

、复制缺陷病毒pcv2^δcap的免疫效力验证

1）pcv2^δcap实验性疫苗的制备：用复制缺陷病毒pcv2^δcap感染上述cap反式互补转基因pk-15细胞株，培养至病毒滴度达到10^6.5tcid50以上时反复冻融三次，4000rpm离心10分钟；含病毒的上清液通过0.45um滤膜过滤后，用peg-6000浓缩病毒。用适量pbs重悬浓缩后的病毒，使病毒滴度不低于10^7.0tcid50，即得pcv2^δcap实验性疫苗。

2）pcv2^δcap实验性疫苗的免疫效力测定：在清洁级动物实验环境下，将pcv2抗原和抗体检测均为阴性的3周龄仔猪16头随机分为2组，每组8头，试验组颈部肌肉注射10^7.0tcid50pcv2^δcap实验性疫苗，对照组颈部肌肉注射市售同株pcv2灭活疫苗1ml（10^7.0tcid50）。免疫6周后采集两组仔猪的静脉血样本，用市售pcv2elisa抗体检测试剂盒检测各血清样本的pcv2抗体。结果表明：试验组8个血清样本均为阳性，而对照组8个血清样本中5个为阳性，3个为阴性。证明所述cap敲除的pcv2复制缺陷病毒实验性疫苗在单次免疫情况下的免疫效力明显高于同株野生型pcv2灭活疫苗。

实施实例2：基于rep反式互补转基因细胞株制备pcv2复制缺陷病毒

1.rep反式互补转基因pk-15细胞株构建

1）rep真核表达载体构建：以实施实例1中提取的pcv2基因组dna为模板，设计上游引物含kozak序列的引物对（5'gctagcgccaccatgcccagcaagaagaatgga3'，5'ggatcctcagtaatttatttcatatggaaattcagg3'，下划线部分为模板结合区序列），通过pcr扩增、t-a克隆、nhei和bamhi双酶切亚克隆将pcv2的rep基因完整编码序列克隆入通用真核表达质粒pcdna3.1⁺，得到pcdna-rep质粒。

2）rep真核表达载体的瞬时转染验证：用pcdna-rep质粒通过脂质体转染技术转染pk-15细胞株，36小时后用pcv2阳性血清进行间接免疫荧光试验（ifa），转染的细胞呈现绿色荧光，确认pcdna-rep质粒能在pk-15细胞中正确表达rep蛋白。

3）pk-15细胞的稳定转染：用内切酶mfei将40μgpcdna-rep质粒线性化，然后通过脂质体转染技术转染pk-15细胞株，转染后24小时传代，当细胞融合度达到50-70%时更换为含合适浓度g418的培养基进行加压筛选，每3天换一次含合适浓度g418的培养基，直到有g418抗性的细胞簇生长。

4）rep反式互补转基因细胞株筛选：通过无限稀释法对上一步获得的g418抗性pk-15细胞簇进行单克隆化筛选，结合上述ifa试验获得能稳定表达pcv2-rep的rep反式互补转基因pk-15细胞株单克隆。

敲除的pcv2感染性克隆构建及突变病毒拯救

1)pcv2感染性克隆的rep敲除突变：以实施实例1中构建的pcv2的野生型感染性克隆puc-pcv2为模板，设计引物对（5'taatgatagacacctcacctccaggggttc3'，5'ctcattaccctcctcgccaac3'，上游引物的下划线部分为对应rep52-54位氨基酸的3个连续终止密码子），采用大连宝生物的dna突变试剂盒mutanbestkit并按其说明书操作，即得rep敲除的pcv2感染性克隆puc-pcv2^δrep。

2)rep敲除突变病毒的拯救：用rep敲除的pcv2感染性克隆puc-pcv2^δrep转染上述rep反式互补转基因pk-15细胞株，盲传3代后用ifa测定病毒滴度（tcid50），并收获rep敲除的复制缺陷pcv2突变病毒pcv2^δrep。

突变病毒pcv2^δrep的复制缺陷验证：

1)离体培养细胞验证：用10^4.0tcid50突变病毒pcv2^δrep感染正常pk-15细胞，同时设相等感染剂量的同株野生型病毒感染对照，盲传3代后进行ifa检测，结果表明：突变病毒pcv2^δrep感染的正常pk-15细胞传代3代后无法检测到病毒，而同株野生型病毒感染的正常pk-15细胞传代3次后有大量病毒存在，说明rep敲除的突变病毒pcv2^δrep不能在正常pk-15细胞复制。

2)小鼠活体动物验证：在spf实验环境下，用两组各6只spf级balb/c小鼠分别腹腔内接种0.2*10^5.0tcid50突变病毒pcv2^δrep和同株野生型病毒，每天一次连续接种3天。最后一次接种3周后分别无菌采集两组小鼠的静脉血、脾脏、淋巴结，提取各组织样本中病毒dna，用pcv2的cap基因特异引物（5'ggaaaaatggcatcttcaacacc3'，5'cgggaggagtagtttacatagggg）进行pcr检测。结果表明：6只接种了突变病毒pcv2^δ(rep)的小鼠三种组织样本的pcv2特异性pcr检测均为阴性，而6只接种了同株野生型病毒的小鼠三种组织样本的pcv2特异性pcr检测均为阳性，说明rep敲除的突变病毒pcv2^δrep不能在活体小鼠体内复制。

3)仔猪活体动物验证：在清洁级动物实验环境下，用两组各6只pcv2抗原和抗体检测均为阴性的三周龄仔猪分别鼻腔内接种突变病毒pcv2^δrep和同株野生型病毒，接种剂量均为2*10^6.0tcid50，每天一次连续接种3天。最后一次接种3周后分别无菌采集两组仔猪的静脉血、脾脏、淋巴结，提取组织样本中病毒dna，用pcv2的cap基因特异引物进行pcr检测。结果表明：6只接种了突变病毒pcv2^δrep的仔猪三种组织样本的pcv2特异性pcr检测均为阴性，而6只接种了同株野生型病毒的仔猪三种组织样本的pcv2特异性pcr检测均为阳性，说明rep敲除的pcv2突变病毒pcv2^δrep不能在活体仔猪体内复制。

pk-15细胞感染、小鼠和仔猪活体感染实验均证实突变病毒pcv2^δrep不能在其正常宿主细胞内复制传代，因此其对正常宿主细胞来说是一种复制缺陷病毒。

实施实例3：复制缺陷型pcv2病毒用作pcv2抗体检测抗原

1）pcv2复制缺陷病毒包被抗原制备

将实施实例1中用cap反式互补转基因pk-15细胞株增殖、收获的复制缺陷病毒pcv2^δcap经peg-6000浓缩，用适量50mm碳酸盐缓冲液（ph9.6）重悬，使病毒滴度为10^7.0tcid50，即得pcv2抗原包被液。

2）pcv2复制缺陷病毒抗原包被

将上述pcv2抗原包被液加入elisa板条中，每孔100ul，置4℃过夜，倒掉、吸净包被液。

3）pcv2elisa抗体检测验证

用市售某进口品牌的pcv2elisa抗体检测试剂盒（以重组表达的pcv2cap蛋白为检测抗原）作为对照，分别用试剂盒自带的抗原包被板条和上一步制备的pcv2复制缺陷病毒抗原包被板条对试剂盒中提供的阳性标准血清和阴性标准血清进行elisa抗体检测，阳性标准血清和阴性标准血清均设3个重复孔，其余检测步骤均按该试剂盒说明书进行。结果表明：试剂盒自带的包被抗原对阳性标准血清和阴性标准血清的检测od值分别为2.3±0.25和0.31±0.08，pcv2复制缺陷病毒包被抗原对阳性标准血清和阴性标准血清的检测od值为2.8±0.28和0.32±0.10。pcv2复制缺陷病毒包被抗原对阳性标准血清的检测od值比试剂盒自带的包被抗原对阳性标准血清的检测od值高21.7%，说明pcv2复制缺陷病毒包被抗原比该试剂盒自带的重组表达包被抗原的检测灵敏度更高；同时，二者对阴性标准血清的检测od值基本相当，说明pcv2复制缺陷病毒作为包被抗原在提高elisa检测灵敏度的同时不会明显降低检测的准确度。