本发明属于微生物培养领域，具体地，涉及一种利用猪粪提取菌种的方法。
背景技术：
近年来，我国畜牧业的集约化发展迅猛，养殖方式产生了大量的禽畜粪便。统计至2010年，我国畜牧养殖粪便排放总量为19亿吨，平均每公顷耕地的污染量近2吨，据估计，到2020年全国禽畜粪便总排放量将上升至30亿吨。2010年我国《全国第一次污染源普査公报》结果显示：我国畜禽粪便无害化、资源化及商品化处置率仅占29％，排放的化学需氧量占到农业面源污染的95.78％、总氮占到37.89％、总磷占到56.30％，畜禽养殖污染已经成为农业面源污染的首因。
猪粪本身是一种优良的营养源，猪饲料中70％的氮通过粪和尿排出，植物饲料中2/3的磷以植酸磷形态存在而不能被猪利用。彭丽(2017)等采集杨凌地区不同养殖场粪便测定养分结果表明：粪便中氮的含量达0.71％-3.56％，全磷的含量达0.43％-7.42％，全钾的含量达1.2％-8.93％。在猪粪厌氧发酵的过程中，猪粪不仅能够作为基质为多种益生菌提供生长、增殖的场所，也能够作为营养来源为益生菌提供丰富的物质条件。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种利用猪粪提取菌种的方法，以解决上述技术问题中的至少一个。
根据本发明的一个方面，提供一种利用猪粪提取菌种的方法，包括以下步骤:步骤(1)，配制发酵底物，发酵底物包括茶叶渣10-18份、小麦秸秆12-20份、污泥20-40份、猪粪20-50份；步骤(2)，密封厌氧发酵，控制发酵温度为30-34℃，并使从发酵体系排出的消化液回流至发酵体系；步骤(3)，使用生理盐水浸提步骤(2)所得产物，得到猪粪混合物浸出液，利用浸出液提取菌株。
优选地，发酵底物还包括磁铁粉1-5份。
优选地，发酵底物还包括蚕沙生物炭2-10份。
优选地，发酵底物包括茶叶渣15份、小麦秸秆15份、污泥31份、猪粪28份，还包括磁铁粉3份和蚕沙生物炭8份。
优选地，配制发酵底物前，使用6-12％的氨水对小麦秸秆进行预处理。
优选地，在步骤(2)过程中，使消化液按照65％的回流比回流至发酵体系。
优选地，在步骤(1)中，按照4：2-5的料水比加水调节发酵底物的含水量，并调节发酵底物的ph值至ph＝6-7.5。
优选地，发酵温度为32±0.5℃。
优选地，厌氧发酵的过程中采取间歇搅拌，每搅拌3小时停30分钟，转数为40-60r/min。
优选地，预处理的用时为4-8天。
本发明以污泥和猪粪作为发酵底物的主要组分，按照合理的比例搭配小麦秸秆、茶叶渣、磁铁粉和蚕沙生物炭，多种原料的搭配互补，使发酵底物能够为其中的微生物提供搭丰富、平衡的营养物质，另外，组成丰富的发酵底物能够及时地稀释、缓冲发酵过程中产生的酸化产物，减少了酸化产物造成的酸化抑制作用，为其中的微生物提供稳定的生长增殖环境。此外，发酵底物中的磁铁粉提高了基质中的微生物的代谢能力，促进了微生物的生长增殖。另外，本发明通过平衡料水比、起始ph值、回流比和发酵温度多个工艺因素对光合细菌、酵母菌、乳酸菌、枯草芽孢杆菌和放线菌的生长增殖所产生的影响，设计出恰当的工艺参数搭配方案，由此，使光合细菌、酵母菌、乳酸菌、枯草芽孢杆菌以及放线菌在发酵基质中保持较强的生理活性，从而培养得到种群丰度高、活菌数目多的微生物群落。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。
实施例1
本实施例利用猪粪作为培养原料，培养并分离光合细菌、酵母菌、乳酸菌、枯草芽孢杆菌以及放线菌，具体操作步骤如下。
1.发酵体系的准备
利用10％的氨水对小麦秸秆进行浸泡预处理，预处理时间为6天，预处理结束后弃去滤液，使小麦秸秆自然风干，切碎，备用。准确称量茶叶渣15份、经过预处理的小麦秸秆15份、污泥31份、猪粪28份、磁铁粉3份和蚕沙生物炭8份。将上述原料混合，搅拌均匀，完成发酵底物的配制。将发酵底物转移至有机玻璃材质的连续搅拌反应器中，按照4：3.5的料水比加水调节发酵底物的含水量，并调节发酵底物的ph值至ph＝6.8。
2.密封厌氧发酵
厌氧发酵过程中，利用双层水浴加热，使发酵温度保持32±0.5℃，发酵期间，使发酵体系产生并排除的消化液按照65％的回流比回流至发酵体系，采取间接搅拌方式，转速为50r·min-1，每搅拌3小时停30分钟。回流厌氧发酵进行30天。
3.样品采集
厌氧发酵结束后，取10g猪粪混合物，加入0.8％无菌生理盐水100ml，30℃条件下169rpm振荡活化30分钟，2000rpm离心处理15分钟后保留上清液，上清液即为猪粪混合物浸出液，保留备用。
4.培养基的配制
(1)猪粪浸提液培养基：新鲜猪粪(含水率约60～70％)与蒸馏水混合，混合比率为1:4(w/v)，25℃条件下振荡30分钟，2000rpm离心15分钟，取上清液分装于300ml三角瓶，每瓶装100ml，0.103mpa下121℃高压蒸汽灭菌30分钟，备用。
(2)光合细菌分离培养基：采用酵母膏培养基，酵母膏3g，蛋白胨3g，碳酸钙0.3g，硫酸镁0.5g，蒸馏水1000ml，琼脂20g，自然ph。0.103mpa下121℃下高压蒸汽灭菌20分钟。
(3)酵母菌分离培养基：采用马铃薯葡萄糖培养基。20％马铃薯浸汁的配制：将去皮马铃薯200g切成小块，加入蒸馏水1000ml，80℃水浴浸泡1小时后用纱布过滤，补足失水至所需体积即可，贮存备用。配制培养基时，首先按照每100ml马铃薯浸汁加入2g葡萄糖，加热煮沸，加入2g琼脂，继续加热融化，补足失水至所需体积，分装、加塞、包扎，0.103mpa下121℃高压蒸汽灭菌20分钟。
(4)乳酸菌分离培养基：采用番茄汁培养基：牛肉膏10g，酵母膏10g，蛋白胨10g，葡萄糖10g，碳酸钙20g，番茄汁20％，吐温800.05％，溴甲酚绿0.01％，琼脂20g，蒸馏水1000ml，ph＝6.5，0.103mpa下121℃高压蒸汽灭菌20分钟。
(5)枯草芽孢杆菌分离培养基：采用牛肉膏蛋白胨培养基，葡萄糖20g，蛋白胨15g，牛肉膏0.5g，氯化钠0.5g，蒸馏水1000ml，琼脂20g，自然ph。0.103mpa下121℃高压蒸汽灭菌20分钟。
(6)放线菌分离培养基：采用高氏合成一号培养基，可溶性淀粉20g，氯化钠0.5g，硝酸钾1.0g，七水合硫酸镁0.5g，三水合磷酸氢二钾0.5g，七水合硫酸亚铁0.01g，琼脂20g，蒸馏水1000ml，ph＝7.2～7.4。0.103mpa下121℃高压蒸汽灭菌20分钟。
5.接种培养
将猪粪混合物浸出液接种于已配制好的猪粪浸出汁培养基，160rpm振荡培养48小时得到接种液。对接种液采取梯度稀释法稀释到10-4，选取三个稀释浓度梯度10-2、10-3、10-4的接种液分别采用平板涂布法接种于光合细菌分离培养基、酵母菌分离培养基、乳酸菌分离培养基和枯草芽孢杆菌分离培养基，采用倾注法接种至放线菌分离培养基。各菌种对应的培养条件为：光合细菌，接种后的光合细菌分离培养基置于30℃恒温培养箱，光照，培养48小时；酵母菌，种后的酵母菌分离培养基置于30℃恒温培养箱，培养24-48小时；乳酸菌，种后的乳酸菌分离培养基置于30℃恒温培养箱，培养24-48小时；枯草芽孢杆菌，种后的枯草芽孢杆菌分离培养基置于37℃恒温培养箱，培养24小时；放线菌，种后的放线菌分离培养基置于30℃恒温培养箱，培养24-48小时。每个稀释度的接种液做3个重复实验。培养完成后，挑取性状良好的单菌落于相应的分离培养基进行划线分离培养，直到菌落纯化，将菌落移至斜面于4℃冰箱低温保存。
对比实施例1
1.处理组设置方式
本实施例以发酵底物的原料组成作为变量，设置若干处理组进行猪粪的密封厌氧发酵，除了发酵底物的原料组成外，发酵底物的含水量、ph值以及密封发酵工艺参数均与实施例1保持一致。各处理组对应的发酵底物具体组成如下：
对照处理：与实施例1保持一致；
处理1：10％氨水预处理的小麦秸秆15份、污泥31份、猪粪43份、磁铁粉3份、蚕沙生物炭8份；
处理2：茶叶渣15份、10％氨水预处理的小麦秸秆15份、污泥31份、猪粪31份、蚕沙生物炭8份；
处理3：茶叶渣15份、10％氨水预处理的小麦秸秆15份、污泥31份、猪粪36份、磁铁粉3份；
处理4：茶叶渣15份、小麦秸秆(未经10％氨水预处理)15份、污泥31份、猪粪28份、磁铁粉3份和蚕沙生物炭8份。
2.指标测试
密封厌氧发酵结束时取1ml消化液样品于盛有9ml无菌pbs缓冲液试管中进行10-2稀释，振荡5分钟，并依次进行10-3-10-6倍稀释，采用平板计数法计数测定经过稀释的消化液中的光合细菌、酵母菌、乳酸菌、枯草芽孢杆菌以及放线菌。每个处理组重复取样测试3次。
3.测试结果
厌氧发酵结束后，本实施例各处理组的消化液的菌种计数结果如表1所示。对应对照处理的消化液样品中的光合细菌、酵母菌、乳酸菌、枯草芽孢杆菌、放线菌的活菌数都达到了本实施例设置的所有处理组的对应指标的最大值。
表1本实施例各处理组对应的菌种计数统计结果
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对其限制，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细的说明，所属领域的普通技术人员应当理解，技术人员阅读本申请说明书后依然可以对本发明的具体实施方式进行修改或者等同替换，但这些修改或变更均未脱离本发明申请待批权利要求保护范围之内。