全细胞催化生产5-氨基戊酸的工程菌及5-氨基戊酸的制备方法与流程

本发明总地涉及生物技术领域，具体涉及全细胞催化生产5-氨基戊酸的工程菌及5-氨基戊酸的制备方法。

背景技术：

5-氨基戊酸(5-aminovalerate,5ava)是一种奇数碳的功能单体原料，可通过分子内脱水环化生产δ-戊内酰胺(2-piperidone)，进一步加工成为生物基尼龙-5和尼龙-65。

聚酰胺(polyamide,pa)俗称尼龙(nylon)，包括由同一种分子形成的单聚物及由二元胺或二元酸为单体形成的共聚物等不同形式，在纺织、汽车、电子电器、生物塑料和医药等行业有广泛的应用。世界上主要通过石化原料生产聚酰胺，全球每年需要消耗约700万吨的聚酰胺产品，且呈现逐年增长的趋势，造成能源资源短缺、生态环境恶化等问题。目前，广泛使用的聚酰胺pa6和pa66产品是由己二酸和己二胺聚合而成，其中己二酸可以通过微生物法合成，而己二胺依赖于传统的石油化工合成。研究发现以五碳平台化合物(5-氨基戊酸、5-氨基戊酸和戊二酸等)为主要原料生产的新型尼龙pa5x系列产品，具有良好的流动性、较高的力学和热学性能以及本质阻燃性，可以替代pa66。因此，利用可再生的物质资源，开展其它的五碳平台化合物的生物合成研究，对于开发新型的生物基聚酰胺、聚氨酯等高分子聚合物具有重要的经济学和生态学意义。

目前工业上制备5-氨基戊酸主要使用化学法合成，一般采用戊内酰胺或戊内酰胺聚合物(尼龙6的熔块、废丝、废弃织物、渔网等)水解后精制而得，其反应条件苛刻，能耗大，设备腐蚀大，效率低，分离复杂。为取代化学合成法，研究人员积极探索开发条件温和，转化高效的5-氨基戊酸的生物合成路线。生物法合成目前主要有发酵法和催化法两种。

发酵法生产5-氨基戊酸主要通过在大肠杆菌或者谷氨酸棒杆菌中构建5-氨基戊酸合成途径实现从葡萄糖合成5-氨基戊酸。park等人在大肠杆菌中人工构建了由davb-dava催化的5-氨基戊酸合成途径，利用代谢工程改造胞内代谢途径，解除天冬氨酸激酶和二氢吡啶二羧酸的反馈抑制作用，敲除cada基因阻断赖氨酸到5-氨基戊酸的转化，能够合成0.86g/l5-氨基戊酸，首次建立了从葡萄糖转化为5-氨基戊酸的合成路线。通过进一步优化代谢网络和培养条件，构建的大肠杆菌工程菌通过添加20g/l葡萄糖发酵能够产生3.6g/l5-氨基戊酸。shin等人通过对来源于恶臭假单胞菌的davb和dava基因的密码子进行优化，利用具有不同转录强度的启动子共表达的方式，在谷氨酸棒杆菌中实现了摇瓶发酵产6.9g/l5-氨基戊酸。进一步阻断5-氨基戊酸转化为戊二酸，5l发酵罐的5-氨基戊酸产量提高到33g/l。jorge等人通过在谷氨酸棒状杆菌中引入大肠杆菌的赖氨酸脱氢酶(ldcc),戊二胺转氨酶(pata),γ-氨基丁醛脱氢酶(patd)，将对应的基因ldcc,pata,patd整合至谷氨酸棒状杆菌的染色体上，通过发酵法生产5-氨基戊酸，最终产量达到5.1g/l。

与发酵法相比，全细胞催化的5-氨基戊酸生物合成是利用赖氨酸作为底物，直接转化生产5-氨基戊酸。这样的生物合成路线更具有竞争力和经济性。全细胞催化法目前在大肠杆菌中通过异源表达来源于恶臭假单胞菌kt2440的davb基因编码的赖氨酸2-单加氧酶和dava基因编码δ-戊酰胺酶，全细胞催化12小时可以将30g/l赖氨酸催化转化为20.8g/l的5-氨基戊酸。通过高密度发酵培养，可以将60g/l赖氨酸催化转化生成47.96g/l的5-氨基戊酸。目前，5-氨基戊酸生物催化的现有技术存在工程菌细胞催化性能低，产量水平与实现工业化应用存在较大差距。挖掘不同催化性能的酶，利用大肠杆菌作为宿主细胞，组建不同的催化途径，构建新的全细胞催化工程菌催化生产5-氨基戊酸，有助于5-氨基戊酸生物催化的工业化生产。

技术实现要素：

本发明提供了一种工程菌，其中，所述工程菌与出发菌相比，具有γ-氨基丁醛脱氢酶abd基因、赖氨酸脱氢酶cada基因和丁二胺氧化酶puo基因的表达。

可选地，根据前述工程菌，其中，i.所述工程菌具有至少一个abd基因和/或所述工程菌abd基因的表达由高转录或高表达活性的调控元件介导。ii.所述工程菌具有至少一个cada基因和/或所述工程菌cada基因的表达由高转录或高表达活性的调控元件介导。iii.所述工程菌具有至少一个puo基因和/或所述工程菌puo基因的表达由高转录或高表达活性的调控元件介导。

可选地，根据前述工程菌，其中，所述工程菌包括重组质粒，所述重组质粒包括选自abd基因、cada基因和puo基因中的一种或多种。其中cada基因优选自大肠杆菌escherichiacoli，puo基因和abd基因优选自红球菌rhodococcusjostii，rhodococcusopacus，rhodococcuserythropolis，防腐分支杆菌mycobacteriumdioxanotrophicus，耐辐射动球菌kineococcusradiotolerans，亚黄霍约斯菌hoyosellasubflava，阿尔巴诺卡氏菌nocardiopsisalba，金黄色葡萄球菌agromycesaureus，裸杆菌cnuibacterphyscomitrellae和微黄棒杆菌corynebacteriumflavescens中的一株细菌。更优选地，所述abd基因如seqidno.1所示，所述cada基因如seqidno.2所示，所述puo基因如seqidno.3所示。

本发明所使用的质粒载体可以是pet系列载体，如pet28a，pet32b，pet3a，petduet等；也可以是pqe系列载体或其它大肠杆菌表达载体。

通常将获得的目的基因和载体通过限制内切酶酶切和neb组装酶连接方式构建重组载体(即重组质粒)。重组载体可以通过分子生物学实验中常规的氯化钙化学转化或电穿孔转化的方法转化至宿主细胞中，获得可用于5-氨基戊酸全细胞催化的工程菌。

可选地，根据前述工程菌，其中，所述调控元件为顺反子，所述顺反子如seqidno.5、seqidno.6或seqidno.7所示。

可选地，根据前述工程菌，其中，所述出发菌为大肠杆菌。优选为大肠杆菌b株或其衍生株。更优选选自bl21(de3)、bl21-codonplus(de3)、origami(de3)、rosetta-gammi(de3)中任一菌株。与5-氨基戊酸全细胞催化现有技术所使用的大肠杆菌k12衍生系列菌株相比，大肠杆菌b株及其衍生株具有以下优点：更高的蛋白表达水平；较低的蛋白降解水平；在无机盐培养基中更快的生长速率；更高的细胞膜透性《systemsbiologyandbiotechnologyofescherichiacoli》(springerscience+businessmediab.v.2009)。

本发明还提供了一种5-氨基戊酸的制备方法，其中，包括：培养前述工程菌，所述培养包括生长培养和催化培养，所述生长培养包括诱导所述工程菌的abd基因、cada基因和puo基因表达。优选在工程菌在对数生长期时诱导所述工程菌的abd基因、cada基因和puo基因表达。所述催化培养包括加入赖氨酸、维生素b6。

用于工程菌生长的培养基可以是丰富培养基，也可以是是无机盐培养基。培养基包含碳源、氮源、无机离子、抗生素和其它的营养因子。作为碳源，可以使用葡萄糖、乳糖、半乳糖等糖类；也可以是甘油、甘露醇等醇类；也可以使用葡萄糖酸、柠檬酸、丁二酸等有机酸类。作为碳源，可以使用氨水、硫酸铵、磷酸铵、氯化铵等无机氮源；也可以使用玉米浆、豆粕水解液、毛发粉、酵母提取物、蛋白胨等有机氮源。无机离子包含铁、钙、镁、锰、钼、钴、铜、钾等离子中的一种或多种。其它营养因子还包括维生素b1、吡哆醛、生物素、黄素腺嘌呤二核苷酸。

可选地，根据前述的制备方法，其中，所述诱导所述工程菌的abd基因、cada基因和puo基因的表达为在生长培养基中加入选自iptg、乳糖、别乳糖中的至少一种诱导剂。优选地，生长培养所述工程菌3-6小时后，再加入选自iptg、乳糖、别乳糖中的至少一种诱导剂。更优选地，所述诱导剂的加入量为0.01-2mm，优选为0.5-2mm。诱导剂的加入方式可以是一次性、间歇或连续补加。

可选地，根据前述的制备方法，其中，生长培养所述工程菌7-14小时后，进行催化培养。i.优选地，在所述催化培养基中加入赖氨酸，其加入量为20g/l-200g/l。ii.

优选地，所述催化培养还包括在催化培养基中补加赖氨酸，更优选地，所述赖氨酸补加量为40g-100g或所述赖氨酸补加量使所述催化培养基中赖氨酸的终浓度为20g/l-50g/l。iii.优选地，所述赖氨酸为含有赖氨酸生产菌的赖氨酸发酵液、去除菌体的赖氨酸发酵液、去除菌体并脱色的赖氨酸发酵液、赖氨酸发酵液的离子交换洗脱液、游离赖氨酸、赖氨酸盐干粉或其溶液。赖氨酸的加入方式可以是一次性、间歇或连续补加。

可选地，根据前述的制备方法，其中，在所述催化培养基中加入维生素b6，所述维生素b6选自吡哆醛、磷酸吡哆醛和盐酸吡哆醛中的一种或多种，优选地，所述维生素b6的加入量为0.001-0.5mm。在所述催化培养基中加入黄素腺嘌呤二核苷酸，其加入量为0-1.0mm，优选为0.05-0.2mm。维生素b6和黄素腺嘌呤二核苷酸的加入方式可以是一次性、间歇或连续补加，

可选地，根据前述的制备方法，其中，i.所述生长培养温度为25℃-40℃，优选为30℃-40℃，更优选为30℃-37℃。ii.所述催化培养基ph值为4.0-9.0，优选为6.5-9.0，更优选为7.0-8.0。在赖氨酸反应生产5-氨基戊酸的过程中催化液的ph值持续升高，需要加入酸使ph维持在利于全细胞催化的范围，通常为4.0以上、优选为5.0以上、更优选为5.5以上，通常为8.0以下，最优选为7.5。此处所使用的酸可以是硫酸、盐酸、磷酸等无机酸；也可以是甲酸、乙酸、丁二酸、己二酸等有机酸。上述有机酸或无机酸可以采用固体粉末、悬浊液或溶液的形式补加；上述有机酸或无机酸可以间歇或连续补加维持ph在上述范围，也可以通过发酵罐ph电极信号反馈补加使ph维持在恒定值。iii.

所述催化温度为25℃-40℃，优选为28℃-34℃。生长或催化过程中的温度可是设为上述范围中的固定值，也可以是由低到高变化值。催化过程中当5-氨基戊酸浓度不再增加或增加速率极为缓慢时，催化过程结束，此时5-氨基戊酸浓度为20-300g/l。

rhodococciopacus能够利用赖氨酸的脱羧产物戊二胺、丁二胺、丁胺为氮源进行生长，其胞内存在多胺氧化降解途径。r.opacus含有两个不同的丁二胺氧化酶(puo)，黄素依赖的丁二胺氧化酶和依赖于cu离子的胺氧化酶,能够氧化丁二胺生成4-氨基丁醛。4-氨基丁醛在脱氢酶abd催化下转化为4-氨基丁酸。利用这条胺氧化途径，本发明建立了通过脱羧-氧化-还原三步反应的全细胞催化赖氨酸转化为5-氨基戊酸的生物催化法。该生物催化方法提供了γ-氨基丁醛脱氢酶，赖氨酸脱氢酶,丁二胺氧化酶的基因组合表达的新策略。该策略适用于重组蛋白高效表达的大肠杆菌宿主，开辟并且实践证明了新的工程菌培养和5-氨基戊酸催化连续进行的工艺方式，显著提高了5-氨基戊酸生物催化效率、降低生产成本，减少废水排放，从而在实践上可用于5-氨基戊酸大规模生产，便于推广应用。

本发明通过γ-氨基丁醛脱氢酶abd，赖氨酸脱氢酶cada，丁二胺氧化酶puo表达组合优化和最适宿主菌的选择，构建高催化速率和高催化浓度的5-氨基戊酸全细胞催化工程菌，以及提供使用该工程菌同时简化操作工序、降低生产成本和废水排放的全细胞催化工艺，为改进5-氨基戊酸生物催化生产提供新措施。

附图说明

图1为同时表达abd，cada，puo的质粒pwye6325示意图；

图2为利用his顺反子表达puo并且同时表达abd，cada的质粒pwye6326示意图；

图3为利用mbp顺反子表达puo并且同时表达abd，cada的质粒pwye6331示意图；

图4为利用bcd2顺反子表达puo并且同时表达abd，cada的质粒pwye6336示意图；

图5为实施例3sds-page蛋白胶电泳图；

图6为实施例4摇瓶种子生长曲线示意图；

图7为实施例4摇瓶菌体生长曲线示意图；

图8为实施例4四种不同表达质粒的5ava摇瓶催化产量图；

图9为实施例5菌体培养阶段的不同培养温度生长曲线；

图10为实施例5菌体培养阶段的不同培养温度产量；

图11为实施例5不同诱导温度催化产量；

图12为实施例5诱导剂不同浓度催化结果；

图13为实施例5催化培养阶段不同培养温度产量；

图14为实施例5fad不同浓度产量；

图15位实施例5催化培养阶段不同ph值催化结果；

图16为实施例6发酵罐产量示意图；

附图标记说明：

*表示两数据间p＜0.05。

具体实施方式

以下结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式进行更加详细的说明，以便能够更好地理解本发明的方案以及其各个方面的优点。然而，以下描述的具体实施方式和实施例仅是说明的目的，而不是对本发明的限制。

需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二、(1)、(2)、(3)等以及ⅰ、ⅱ、ⅲ等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。下述实施例中如未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段和市售的常用仪器、试剂，可参见《分子克隆实验指南(第3版)》(科学出版社)、《微生物学实验(第4版)》(高等教育出版社)以及相应仪器和试剂的厂商说明书等参考。

本文提及的“出发菌”是指用于本发明基因改造策略的初始菌株。该菌株可以是天然存在的菌株，也可以是通过诱变或遗传工程改造等方式选育的菌株。

在本发明的方法中，增加某基因的拷贝数可通过构建包含该基因的重组质粒，再将重组质粒导入出发菌中实现。这些方法都是本领域常用的，因此不再赘述。

另外，本发明引用了公开文献，这些文献是为了更清楚地描述本发明，它们的全文内容均纳入本文进行参考，就好像它们的全文已经在本文中重复叙述过一样。

高保真聚合酶kapahifi^tmhotstar购自北京阅微基因技术有限公司

吉布森组装试剂盒购自美国neb公司(nebuilderhifidnaassemblymastermix,neb#e2621)。色谱级乙腈和甲醇购自美国赛默飞世尔科技有限公司(fisherscienfitic)公司。

gibson组装反应体系

gibson组装反应条件：50℃水浴反应1h。

实验中所用到的培养基。

lb液体培养基：蛋白胨10.00g/l，酵母粉5.00g/l，氯化钠10.00g/l，ph7.00。

lb固体培养基：蛋白胨10.00g/l，酵母粉5.00g/l，氯化钠5.00g/l，琼脂20.00g/l，ph7.00。

微量元素混合液：feso4·7h2o，10.000g/l；cacl2，1.350g/l；znso4·7h2o，2.250g/l；mnso4·4h2o，0.500g/l；cuso4·5h2o，1.000g/l；(nh4)6mo7o24·4h2o，0.106g/l；na2b4o7.10h2o，0.230g/l；cocl2.6h2o，0.480g/l；35％hcl，10ml/l。

种子培养基：蛋白胨10.00g/l，酵母粉5.00g/l，nacl10.00g/l，氨苄青霉素100mg/l。

菌体生长阶段培养基(tb培养基)：酵母粉24.00g/l，蛋白胨20.00g/l，k2hpo4·3h2o16.43g/l，kh2po42.31g/l，氨苄青霉素100mg/l。

摇瓶催化培养基：mgso4·7h2o0.50g/l，(nh4)2so45.00g/l，kh2po41.36g/l，na2hpo45.67g/l，磷酸吡哆醛0.2mg/l，核黄素嘌呤二核苷酸(fad)0.1mm，赖氨酸20.00g/l，氨苄青霉素100mg/l。

发酵罐催化培养基：mgso4·7h2o0.50g/l，(nh4)2so45.00g/l，kh2po41.36g/l，na2hpo45.67g/l，磷酸吡哆醛0.2mg/l，核黄素嘌呤二核苷酸(fad)0.1mm，赖氨酸20.00g/l，氨苄青霉素100mg/l。

实施例15ava的检测方法

取稀释后的10μl样品加入990μl水中，有机系滤膜过滤后取1μl进样。

流动相a为10mmna2hpo4和10mmna2b4o7，ph8.2。如需配制1l流动相，称取1.4g无水na2hpo4和3.8gna2b4o7·10h2o，将其溶于1l水中。用1.2ml浓盐酸将ph调节为8.4左右，然后加入数滴酸，并将最终ph调节为8.2。在调节ph之前充分搅拌，使硼酸盐晶体完全溶解。用0.45m再生纤维素膜(部件号3150-0576)进行过滤。流动相b为乙腈:甲醇:水(45:45:10,v:v:v)。所有流动相溶剂均为hplc级。进样稀释剂为100ml流动相a和0.4ml浓h3po4。该溶液在100ml瓶中配制，并在4℃下储存。衍生化试剂(硼酸盐缓冲液、opa和fmoc)由安捷伦提供，是即拆即用的溶液。只需将这些试剂从其容器中转移至自动进样器样品瓶中即可。色谱分离条件：柱型为aaa柱(eclipseaaa，4.6lipsea，agilent，usa)；柱温为40℃；检测波长为338nm；流动相总流量为1ml/min。以5-氨基戊酸为标准品，5-氨基戊酸的浓度与hplc仪器测得峰面积在1-5g/l之间线性关系良好。以标准品的浓度为横坐标，标准品积分峰面积为纵坐标，制作标准曲线，得到标准曲线公式y＝2887.3x-56.951r²＝0.9999。以下实施例中的5-氨基戊酸浓度均由标准曲线公式计算得到。

实施例2γ-氨基丁醛脱氢酶abd，赖氨酸脱氢酶cada,丁二胺氧化酶puo表达载体和工程菌的构建

以携带有密码子优化合成的abd基因序列的载体为模板，以p1和p2为引物按如下方式进行pcr扩增：98℃变性30秒，65℃退火15s秒，以及72℃延伸150秒，26个循环，扩增abd-1基因，得到长1431bp的pcr产物(seqidno.1)；类似地以e.colimg1655基因组为模板，以p3和p4为引物扩增cada-1基因,得到2148bp的pcr产物(seqidno.2)；以携带有优化合成的puo基因序列的载体为模板，以p5和p6为引物扩增puo基因，得到长1362bp的pcr产物(seqidno.3)。

将上述三个pcr产物进行纯化。

以限制性内切酶ndei和aatii对质粒petduet-1(购自novagen公司)进行双酶切，得到长5420bp的酶切产物(seqidno.4)。将纯化后的puo片段和双酶切质粒所得片段进行gibson组装反应。将反应产物采用化学转化法转化至大肠杆菌ec135，在含氨苄霉素(100μg/ml)的lb平板上筛选转化子。转化子传代培养三代后，以p7和p8为引物，采用菌落pcr鉴定转化子，对鉴定正确的转化子提取质粒，并将质粒送去测序，测序正确的质粒命名为pwye6310(petduet-pt7-puo)。

以上一步扩增出的abd-1基因序列为模板，以p21和p22为引物扩增abd-2基因，得到长1431bp的pcr产物(seqidno.1)；以上一步扩增出的cada-1模板，以p23和p26为引物扩增pt7-cada-1基因,以pt7-cada-1为模板，以p24和p26为引物扩增pt7-cada-2基因，以pt7-cada-2为模板，以p25和p26为引物扩增pt7-cada-3基因，得到2204bp的pcr产物(seqidno.8)。

以限制性内切酶ncoi和bamhi对质粒pwye6310，得到长6743bp的酶切产物，将纯化后的abd-2片段和双酶切质粒所得片段分别进行gibson组装反应。将反应产物采用化学转化法分别转化至大肠杆菌ec135，在含氨苄霉素(100μg/ml)的lb平板上筛选转化子，转化子传代培养三代后，以p9和p10为引物，采用菌落pcr鉴定转化子，对鉴定正确的转化子提取质粒，并将质粒送去测序，测序正确的质粒命名为pwye6312(petduet-pt7-abd-pt7-puo)。

以限制性内切酶bamhi对质粒pwye6312，进行单酶切，得到长8144bp的pcr产物，将纯化后的pt7-cada-3片段和单酶切质粒所得片段分别进行gibson组装反应。将反应产物采用化学转化法分别转化至大肠杆菌ec135，在含氨苄霉素(100μg/ml)的lb平板上筛选转化子。转化子传代培养三代后，以p28和p27为引物，采用菌落pcr鉴定转化子，对鉴定正确的转化子提取质粒，并将质粒送去测序，测序正确的质粒命名为pwye6325(petduet-pt7-abd-pt7-cada-pt7-puo)。将pwye6325质粒分别化转进入bl21感受态中得到工程菌ec7009。

无需模板，以p11和p12为引物扩增得到92bp的产物his-1，以p13和p14为引物扩增得到65bp的产物his-2，以his-1，his-2为模板，以p11和p14为引物扩增得到137bp的his-3(seqidno.5)。无需模板，以p15和p16为引物扩增得到98bp的mbp(seqidno.6)。无需模板以p15和p16为引物扩增得到85bp的bcd2-1，以bcd2-1为模板以p17和p18为引物扩增得到161bp的bcd2-2(seqidno.7)。以限制性内切酶ndei对质粒pwye6310进行单酶切，得到长6743bp的酶切产物，将纯化后的his-3，mbp，bcd2片段和单酶切质粒所得片段分别进行gibson组装反应。将反应产物分别采用化学转化法转化至大肠杆菌ec135，在含氨苄霉素(100μg/ml)的lb平板上筛选转化子。转化子传代培养三代后，以p27为测序引物，将提取的质粒送去测序，测序正确的质粒命名为pwye6315(petduet-pt7-his-puo)，pwye6316(petduet-pt7-mbp-puo)，pwye6324(petduet-pt7-bcd2-puo)。

以携带有优化合成的abd基因序列的载体为模板，以p21和p22为引物扩增abd-2基因，得到长1431bp的pcr产物(seqidno.1)；以e.colimg1655基因组为模板，以p23和p26为引物扩增pt7-cada-1基因,以pt7-cada-1为模板，以p24和p26为引物扩增pt7-cada-2基因，以pt7-cada-2为模板，以p25和p26为引物扩增pt7-cada-3基因，得到2204bp的pcr产物(seqidno.8)。以限制性内切酶ncoi和bamhi对质粒pwye6315，pwye6316，pwye6324进行双酶切，得到长6820bp，6787bp，6828bp的酶切产物，将纯化后的abd-2片段和双酶切质粒所得片段分别进行gibson组装反应。将反应产物采用化学转化法分别转化至大肠杆菌ec135，在含氨苄霉素(100μg/ml)的lb平板上筛选转化子，转化子传代培养三代后，以p9和p10为引物，采用菌落pcr鉴定转化子，对鉴定正确的转化子提取质粒，并将质粒送去测序，测序正确的质粒命名为pwye6320(petduet-pt7-abd-pt7-mbp-puo)，pwye6321(petduet-pt7-abd-pt7-his-puo)，pwye6332(petduet-pt7-abd-pt7-bcd2-puo)。

以限制性内切酶bamhi对质粒pwye6320，pwye6321，pwye6332进行单酶切，得到长8100bp，8177bp，8185bp的酶切产物，将纯化后的pt7-cada-3片段和单酶切质粒所得片段分别进行gibson组装反应。将反应产物采用化学转化法分别转化至大肠杆菌ec135，在含氨苄霉素(100μg/ml)的lb平板上筛选转化子。转化子传代培养三代后，以p28和p27为引物，采用菌落pcr鉴定转化子，对鉴定正确的转化子提取质粒，

并将质粒送去测序，测序正确的质粒命名为，pwye6326(petduet-pt7-abd-pt7-cada-pt7-his-puo)，pwye6331(petduet-pt7-abd-pt7-cada-pt7-mbp-puo)，pwye6336(petduet-pt7-abd-pt7-cada-pt7-bcd2-puo)。将pwye6326，pwye6331，pwye6336，三个质粒分别化转进入bl21感受态中得到ec7010，ec7011，ec7012三株工程菌。

上述所用的引物序列如下(5’→3’)：

p1：gtttaactttaagaaggagatataccatgggcatgagcatcgacgtgctg(ncoi)；

p2：aatattgcaataacgttcatggatccctccttttagtcgttgctgctcata(bamhi)；

p3：tatgagcagcaacgactaaaaggagggatccatgaacgttattgcaatatt(bamhi)；

p4：tttctgttcgacttaagcattatgcggccgcttattttttgctttcttctttcaatac(noti)；

p5：gttaagtataagaaggagatatacatatgatgccgaccctgcaacgt(ndei)；

p6：ttaccagactcgagggtaccgacgtcttatttacccagacgcgccac(aatii)；

p7：gccagcaaccgcacct；

p8：cgattactttctgttcgac；

p9：gaacagaaagtaatcgtat；

p10：gtgctggcgttcaaat；

p11：agttaagtataagaaggagatatacatatgatgcataatcataaccataatcacaatca(ndei)；

p12：agaaaatacagattctcgccaccattatggttgtgattgtgattatggttatgattatg；

p13：ggcgagaatctgtattttcttaaggaggtaaactgatgccgaccctgcaacgtga

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实施例3诱导表达工程菌种的abd，cada，puo蛋白

将保存在-80℃的工程菌ec7009(e.colibl21(de3)/petduet-pt7-abd-pt7-cada-pt7-puo(图5中简写为pd^t7a^t7c^t7p))，ec7010(e.colibl21(de3)/petduet-pt7-abd-pt7-cada-pt7-his-puo)(图5中简写为pd^t7a^t7c^t7hisp))，ec7011(e.colibl21(de3)/petduet-pt7-abd-pt7-cada-pt7-mbp-puo(图5中简写为pd^t7a^t7c^t7mbpp))和ec7012(e.colibl21(de3)/petduet-pt7-abd-pt7-cada-pt7-bcd2-puo(图5中简写为pd^t7a^t7c^t7bcd2p))，分别划线接种于含有100mg/l氨苄青霉素的lb培养基平板，至于37℃培养箱中培养12h，刮取平板上培养好的菌苔转接入含有5ml液体lb(含有100mg/l氨苄青霉素)的50ml摇瓶中，置于37℃摇床200rpm培养10h。取培养好的菌液按3％的接种量(体积比)转接入含有50ml液体lb(含有100mg/l氨苄青霉素)的500ml摇瓶，置于37℃摇床200rpm培养，每隔2h取样检测600nm波长的吸光值(od600)。在3h后分别加入浓度0.5mm的诱导剂iptg,再诱导2h后。离心收集经iptg诱导培养的菌液1.50ml(od600约为1.00)，用1.00ml50.00mmol/ltris-hcl(ph8.00)重悬菌体细胞。超声细胞破碎仪按照每个循环为工作3s，间隔5s模式，超声破碎30个循环。破碎的样品10,000×g，4℃，离心10min，取上清液进行蛋白浓度测定。每个点样孔总蛋白上样量约50ng，加入loadingbuffer，95℃加热5min进行蛋白变性。将page胶放入电泳槽，加入阴极、阳极电泳缓冲液，拔出样品梳，将样品及蛋白marker缓慢加入胶孔进行电泳，80v电泳约30min后切换至120v继续电泳，直至考马斯亮蓝指示剂迁移出凝胶。小心取出凝胶，染色液染色12h，脱色液脱色4h后观察结果并采集图像。如图5所示。

由图5可知，工程菌ec7009的puo蛋白可能表达量过低，在凝胶上没有正常显示，而abd和cada蛋白正常表达，ec7010、ec7011和ec7012均诱导产生了abd，cada，puo蛋白。

实施例45ava的全细胞催化实验

种子培养阶段：将保存在-80℃的工程菌ec7009(e.colibl21(de3)/petduet-pt7-abd-pt7-cada-pt7-puo)，ec7010(e.colibl21(de3)/petduet-pt7-abd-pt7-cada-pt7-his-puo)，ec7011(e.colibl21(de3)/petduet-pt7-abd-pt7-cada-pt7-mbp-puo)和ec7012(e.colibl21(de3)/petduet-pt7-abd-pt7-cada-pt7-bcd2-puo)，分别划线接种于含有100mg/l氨苄青霉素的lb培养基平板，置于37℃培养箱中培养24h，刮取平板上培养好的菌苔转接入含有50ml液体lb(含有100mg/l氨苄青霉素)的500ml三角瓶中，在37℃摇床220rpm培养3-5h，od600为4-5(图6)。

菌体培养阶段：将培养好的种子液按3％的接种量(体积比)转接入含有100ml菌体生长阶段培养基的1l挡板三角瓶中，在37℃摇床220rpm培养4-6h，od600为15-20之间，培养5h加入浓度1mm的诱导剂iptg，37℃再继续培养3h，od600为25-40(图7)。

收集摇瓶培养的菌体，6,000×g离心6min，以清洗缓冲液进行重悬浮，再次6,000×g离心6min收集菌体。将收集的菌体全部接种到含有终浓度100.00μg/ml氨苄青霉素的摇瓶催化培养基中。每隔3～4h取样1ml。用磷酸、氨水调节发酵液的ph值，使其维持在7.00～8.00。

催化液样品置于离心机中，12,000×g，离心2分钟，取上清稀释后测定样品中5ava浓度，上清样品保存备用。摇瓶催化持续约72h。催化结果如图8所示。ec7009、ec7010、ec7011和ec7012的产量在60h达到最大值，产量分别为6.16±0.63g/l、7.70±0.03g/l、6.70±0.03g/l和6.10±0.29g/l。

实施例55ava的全细胞催化实验条件优化

下述优化实验的实验参数、条件等如无特别指明，均与实施例4保持一致。

1)菌体培养阶段的培养温度的优化

在菌体培养阶段，以tb培养基培养工程菌ec7010(bl21(de3)/petduet-pt7-abd-pt7-cada-pt7-his-puo)。同时分别选择5个的温度梯度培养菌体，分别是25℃、30℃、34℃、37℃和40℃。菌体培养曲线如图9所示，菌体培养不同温度的全细胞催化结果如图10所示，在37℃培养的菌体催化最高产量7.24±0.43g/l。

2)菌体培养阶段诱导蛋白表达的诱导温度的优化

针对工程菌ec7010选择四个诱导温度梯度，分别是25℃、30℃、34℃、37℃和40℃。全细胞催化结果如图11所示。在37℃诱导表达时有最高产量7.75±0.88g/l。

3)菌体培养阶段诱导蛋白表达的诱导剂剂量的优化

采用工程菌ec7010通过摇瓶发酵试验，分别考察不同iptg终浓度(0.5mmol/l、1mmol/l、1.5mmol/l和2mmol/l)对5-氨基戊酸的积累的影响。当菌体培养至对数中后期(od600约18.00～20.00)时添加不同浓度的iptg。催化过程中，对菌体生长及5-氨基戊酸合成情况进行检测。采用高效液相色谱法(hplc)检测催化液中的5-氨基戊酸含量。结果如图12所示，在iptg浓度为1mmol/l有最高产量8.08±0.70g/l。

4)全细胞催化过程温度的优化

在合适的温度维持蛋白活性对于催化结果具有重要的影响。采用工程菌ec7010通过摇瓶发酵试验，分别考察不同催化培养温度(25℃、28℃、30℃、32℃、34℃、37℃和40℃)对5-氨基戊酸的积累的影响。催化过程中，对菌体生长及5-氨基戊酸合成情况进行检测。采用高效液相色谱法(hplc)检测催化液中的5-氨基戊酸含量。结果如图13，在30℃催化时有最高产量8.88±0.23g/l。

5)全细胞催化辅因子fad添加浓度的优化

采用工程菌ec7010通过摇瓶发酵试验，分别考察不同浓度辅因子fad(0、0.05、0.08、0.1、0.12、0.15和0.2mmol/l)对5-氨基戊酸的积累的影响。催化过程中，对菌体生长及5-氨基戊酸合成情况进行检测。采用高效液相色谱法(hplc)检测催化液中的5-氨基戊酸含量。结果如图14所示在fad浓度为0.1mmol/l时催化有最高产量10.69±0.41g/l。

6)全细胞催化过程ph的优化

采用工程菌ec7010通过摇瓶发酵试验，分别考察催化培养过程中不同ph值(6.5、7.0、7.5、8.0和9.0)对5-氨基戊酸的积累的影响。催化过程中，对菌体生长及5-氨基戊酸合成情况进行检测。采用高效液相色谱法(hplc)检测催化液中的5-氨基戊酸含量。结果如图15所示，在ph为7.5时催化有最高产量为10.99±0.52g/l。

实施例65ava的全细胞催化发酵罐实验

将保存在-80℃的工程菌ec7010(e.colibl21(de3)/petduet-pt7-abd-pt7-cada-pt7-his-puo)划线接种于含有100mg/l氨苄青霉素的lb培养基平板，置于37℃培养箱中培养24h，刮取平板上培养好的菌苔转接入含有1000ml液体lb(含有100mg/l氨苄青霉素)的1l三角瓶中，在37℃摇床220rpm培养3-5h，od600为4-5。

按照3％的接种量，取90ml种子培养液接种至装有3l菌体生长阶段培养基的7.5-l发酵罐中，通过加热套和冷却水控制发酵液温度维持在37℃；通入空气提供溶氧，空气供应不足时，按1:1的比例通氧气和空气混合气，转速与溶氧信号级联控制溶氧维持在30％；补加25％氨水调控ph维持在6.90左右；手动设定7.5-115nbs发酵系统内置定速可编程控泵的转速，根据发酵过程的残糖浓度调节葡萄糖储液的恒速补加速率，使葡萄糖浓度维持在0.00～10.00g/l。培养5～6h，当od600约40.00时，加入iptg(终浓度为1mmol/l)诱导工程菌重组质粒携带的基因表达，继续培养2～3h，至od600约80.00。

收集发酵罐培养的菌体，6,000×g离心6min，以清洗缓冲液进行重悬浮，再次6,000×g离心6min收集菌体。

将收集的菌体全部接种到含有1.8l发酵罐催化培养基的7.5-l发酵罐中。通过加热套和冷却水控制催化液温度维持在30℃；通入空气提供溶氧，空气供应不足时，按1:1的比例通氧气和空气混合气，转速与溶氧信号级联控制溶氧维持在30％；补加磷酸和氨水调控ph维持在7.5左右；手动设定7.5-l115nbs发酵系统内置定速可编程控泵的转速，根据催化过程的残糖浓度调节葡萄糖储液的恒速补加速率，使葡萄糖浓度维持0.00～10.00g/l,催化时间维持42h，期间分时段流加终浓度为80g/l的赖氨酸。最终产量为45.28g/l,赖氨酸盐酸盐到5-氨基戊酸的摩尔转化率为70.36％。

催化结果如图16所示。菌株在32h催化达到最大产量45.28g/l,生产强度为1.42g/l/h。

最后应说明的是：显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之中。

序列表

<110>中国科学院微生物研究所

<120>全细胞催化生产5-氨基戊酸的工程菌及5-氨基戊酸的制备方法

<130>190258ci

<160>8

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1431

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

<221>gene

<222>(1)..(1431)

<400>1

atgagcatcgacgtgctggagaactacattaacggtgaatttgttgcgagcagcgcgacc60

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ggcgtggaagattatacccgtatcaaacacgttatgagcagcaacgactaa1431

<210>2

<211>2148

<212>dna

<213>大肠杆菌(escherichiacoli)

<220>

<221>gene

<222>(1)..(2148)

<400>2

atgaacgttattgcaatattgaatcacatgggggtttattttaaagaagaacccatccgt60

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atcgataagaccaaagcactgagcctgctgcgtgctctgactgactttaaacgtgcgttc1680

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gatggccgctataccgttaaggtattgaaagaagaaagcaaaaaataa2148

<210>3

<211>1362

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

<221>gene

<222>(1)..(1362)

<400>3

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<210>4

<211>5420

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

ggggaattgtgagcggataacaattcccctctagaaataattttgtttaactttaagaag60

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