基于FSHβ基因鉴定大白猪繁殖性状的分子标记及应用的制作方法

本发明属于动物分子标记育种领域，具体地说，涉及一种基于fshβ基因鉴定大白猪繁殖性状的分子标记及应用。

背景技术：

猪肉是当今世界上最主要的肉用经济动物之一，中国作为猪肉消费大国，猪的存栏量居世界第一。为提高生产效益，猪的繁殖性能一直是各大养殖企业关注的重要指标之一，其中猪的总产仔数和活产仔数尤为关键。

分子标记辅助选择作为现代家畜育种工程中的一种重要手段，有效地避免传统中以表型为基础的育种手段的弊端，缩短了遗传间隔期，提高的选择准确性。分子标记辅助选择的前提是确定与所需表型性状相关的候选基因，有目的地对这些基因进行检测从而确定育种方向。

猪的卵泡刺激素(fsh)是垂体前叶嗜碱性细胞分泌的一种糖蛋白激素，它与性腺靶细胞结合，经过次级信使ca²⁺及camp引起一系列生物反应，促进颗粒细胞增生，内膜细胞分化及卵液泡的分泌，诱导促黄体激素、催乳素的受体生成及芳香化酶的生成，并刺激雌二醇的合成和释放，从而协调控制配子细胞的发育和成熟，在动物繁殖过程中有很重要的作用。卵泡刺激素(fsh)由α和β两个亚基组成。其中α亚基为卵泡刺激素、促黄体素和促甲状腺素所共有，在同一种内甚至在所有的哺乳动物中，α亚基是极为保守的；β亚基对fsh的生物学特性起主导作用。

猪的卵泡刺激素β亚基(follicle-stimulatinghormonebetasubunit，fshβ)基因位于猪2号染色体上，全长为10.16kb，由3个外显子和2个内含子组成。促卵泡素β亚基(fshβ)主要是刺激卵泡的生长和发育，影响生长卵泡的数量，并在促黄体素的协同作用下，激发卵泡的最后成熟，诱发排卵。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明提供了一种基于fshβ基因鉴定大白猪繁殖性状的分子标记及应用。

为了解决上述技术问题，本发明公开了一种基于fshβ基因鉴定大白猪繁殖性状的分子标记，所述的分子标记位于猪fshβ基因第3号外显子上，即在3号外显子区域511、617、630、652、678、735、746、921处，记为g.511a>g、g.617a>g、g.630c>t、g.652c>t、g.678c>t、g.735c>t、g.746a>g和g.921a>g。

本发明还公开了一种用于检测上述的分子标记的引物对，包括fshβ-e3-f和fshβ-e3-r，其核苷酸序列分别如seqidno.2和seqidno.3所示。

本发明还公开了一种含有上述的引物对的试剂或试剂盒。

本发明还公开了一种检测上述的分子标记的方法，所述方法包括：以大白猪基因组dna为模板利用上述的引物对进行pcr扩增获得pcr产物；对所述pcr产物进行琼脂糖凝胶电泳。

可选地，pcr扩增反应体系为：2×taqmastermix15μl，dna1.5μl，10μm上游引物1.5μl，10μm下游引物1.5μl，ddh2o10.5μl。

可选地，pcr扩增反应程序为：94℃预变性1.5min；94℃变性20s,56.4℃退火20s，72℃延伸60s，循环30次；最后72℃再延伸5min，4℃保存。

本发明还公开了一种上述的分子标记在猪种选育中的应用。

与现有技术相比，本发明可以获得包括以下技术效果：

本发明fshβ基因的第3号外显子上存在8个突变位点，这8个突变位点与猪的繁殖性状尤其是总产仔数和活产仔数存在相关性，且容易检测。因此本发明提供了一个基于fshβ基因的与猪的繁殖性状相关的分子标记，并且提供了这种分子标记的检测方法以及其在繁殖性状选择中的应用，为猪的分子标记辅助选择提供了一种新的标记方法，为猪的分子育种提供了参考。

当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有技术效果。

附图说明

此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本发明的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

图1是本发明猪fshβ基因3号外显子区域a511g突变位点测序图；

图2是本发明猪fshβ基因3号外显子区域a617g突变位点测序图；

图3是本发明猪fshβ基因3号外显子区域c630t突变位点测序图；

图4是本发明猪fshβ基因3号外显子区域c652t突变位点测序图；

图5是本发明猪fshβ基因3号外显子区域c678t突变位点测序图；

图6是本发明猪fshβ基因3号外显子区域c735t突变位点测序图；

图7是本发明猪fshβ基因3号外显子区域a746g突变位点测序图；

图8是本发明猪fshβ基因3号外显子区域a921g突变位点测序图；

图9是本发明猪fshβ基因3号外显子pcr扩增产物凝胶电泳图；其中，第1-7孔以及第9-15孔均为大白猪的fshβ基因3号外显子区域扩增产物，片段大小为1022bp，第8孔为2000dnamarker；

图10是本发明所扩增得到的猪fshβ基因3号外显子核苷酸序列，片段大小为1022bp，图中阴影部分是内含子序列，方框内所显示的是碱基突变，下划线部分是引物序列。

具体实施方式

以下将配合实施例来详细说明本发明的实施方式，藉此对本发明如何应用技术手段来解决技术问题并达成技术功效的实现过程能充分理解并据以实施。

实施例1：猪esr基因片段的获得及snps检测

本发明所述的作为分子标记应用的与猪繁殖性状相关的fshβ基因3号外显子核苷酸序列，其核苷酸序列如seqidno.1所示，其中在序列的511bp、617bp、630bp、652bp、678bp、735bp、746bp、921bp处存在基因突变。以上snps与猪的繁殖性状(总产仔数、活产仔数)有一定相关性，且易于检测，可利用以上位点作为与猪繁殖性状相关的分子辅助标记选择。

从四川省乐山市天人农牧养殖场收集201头不同品系(美系、丹系、加系)大白猪的被毛样品及繁殖生产记录(初产和经产的总产仔数以及活产仔数)，并用试剂盒提取201头大白猪的全基因组dna。

根据genbank数据库中公布的fshβ基因核苷酸序列(nm_213875.1)，在线比对fshβ基因中3号外显子区域，使用primer5.0软件对以上三个区域进行特异性引物设计(详见表1)，并以基因组dna为模板进行pcr扩增反应。反应体系为：2×taqmastermix15μl，dna1.5μl，上游引物(10μm)1.5μl，下游引物(10μm)1.5μl，ddh2o10.5μl。反应程序：94℃预变性1.5min；94℃变性20s,56.4℃退火20s，72℃延伸60s,循环30次；最后72℃再延伸5min，4℃保存扩增产物。

表1fshβ基因引物信息表

每管pcr产物中取4μl进行琼脂糖凝胶电泳，照胶后将含有单一条带的pcr产物送至成都擎科生物公司进行测序。测序结果利用bioedit软件分别进行比对分析，找到目的片段中存在的突变位点，并记录每个个体中存在的相应位点(a511g、a617g、c630t、c652t、c678t、c735t、a746g、a921g)的突变类型(突变位点对应测序图如图1-8所示)。fshβ基因3号外显子核苷酸序列、对应引物及突变位点等信息分别如图10所示。

表2fshβ基因中8个snps位点的基因型频率与等位基因频率

由表2可知，fshβ基因的8个突变位点在201头大白猪中分别表现为三种基因型。其中，a511g位点的基因型频率在美系大白中呈现出gg>ag>aa的趋势，在丹系大白中呈现两种基因型gg>aa，在加系大白中呈现一种基因型gg，三种品系大白猪中g等位基因频率均大于a等位基因频率；a617g位点的基因型频率在美系大白和丹系大白中呈现出aa>ag>gg的趋势，在加系大白中呈现出aa>gg>ag的趋势，在三种品系大白猪中a等位基因频率均大于g等位基因频率；c630t位点的基因型频率在美系大白和丹系大白中呈现出cc>ct>tt的趋势，在加系大白中呈现出cc>tt>ct的趋势，在三种品系大白猪中c等位基因频率均大于t等位基因频率；c652t位点的基因型频率在美系大白和丹系大白中呈现出tt>ct>cc的趋势，在加系大白中呈现出tt>cc>ct的趋势，在三种品系大白猪中t等位基因频率均大于c等位基因频率；c678t的基因型频率在美系、丹系及加系大白中均呈现出cc>ct>tt的趋势，且c等位基因频率均大于t等位基因频率；c735t位点的基因型频率在美系大白和丹系大白中呈现出tt>ct>cc的趋势，在加系大白中呈现出tt>cc>ct的趋势，在三种品系大白猪中t等位基因频率均大于c等位基因频率；a746g位点的基因型频率在美系大白和丹系大白中呈现出aa>ag>gg的趋势，在加系大白中呈现出aa>gg>ag的趋势，在三种品系大白猪中a等位基因频率均大于g等位基因频率；a921g的基因型频率在美系、丹系及加系大白中均呈现出aa>ag>gg的趋势，且a等位基因频率均大于g等位基因频率。

实施例2：分子标记在大白猪繁殖性状的应用

为建立esr基因与大白猪繁殖性状间的关系，选取201头在产大白猪(四川乐山天人牧业)作为实验材料，采集201头大白猪生产繁殖记录，并采用实施例1中提到的snps检测方式对实验群体进行检测。采用sas8.0软件中的glm模型对每头大白猪的fshβ基因中存在的8个snps位点及其繁殖性状进行关联性分析，结果均以lsm±标准误表示。

对fshβ基因中存在snps位点及繁殖性状(初产和经产的总产仔数和活产仔数)进行关联分析，采用模型为：yij＝μ+gi+pj+eij，其中yij为繁殖性状记录值，μ为群体均值，gi为基因型效应，pj为胎次效应，eij为随机残差效应。

表3fshβ基因不同位点基因型对繁殖性状的影响

由表3可知，在201只大白猪群体中，fshβ基因3号外显子中的a617g、a746g、a921g位点处，gg基因型在美系个体中的经产活产仔数显著低于ag基因型和aa基因型(p<0.05)；在c630t位点处，tt基因型在美系个体中的经产活产仔数显著低于ct基因型和cc基因型(p<0.05)；在c652t、c735t位点处，cc基因型在美系个体中的经产活产仔数显著低于ct基因型和tt基因型(p<0.05)；在c678t位点处，ct基因型在美系个体中的经产活产仔数显著高于ct基因型(p<0.05)；而在其他性状间差异不显著(p>0.05)。

实施例3：单倍型分析

对从201个大白猪个体中检测出来的fshβ基因3号外显子中的8个snp进行单倍型分析，得出以下结果：

表4fshβ基因3号外显子单倍型类型及频率

由表4可知，检测到的8个突变位点构成了12种单倍型，其中频率最高的三个单倍型为h1、h2以及h3，分别为0.642、0.124以及0.086。

上述说明示出并描述了发明的若干优选实施例，但如前所述，应当理解发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离发明的精神和范围，则都应在发明所附权利要求的保护范围内。

序列表

<110>四川农业大学

<120>基于fshβ基因鉴定大白猪繁殖性状的分子标记及应用

<130>2019

<141>2019-04-26

<160>3

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1022

<212>dna

<213>卵泡刺激素β亚基(follicle-stimulatinghormonebetasubunit，fshβ)

<400>1

attcaatgcctgtctcattttgattaaatagaaacttctgtaatactttaacctaactct60

ctctctctcccctgaatcccttaggacctggtatacaaggacccagccaggcccaacatc120

cagaaaacatgtaccttcaaggagctggtgtacgagaccgtgaaagtacctggctgtgct180

caccatgcagactccctgtatacgtatccagtagccactgaatgtcactgtggcaagtgt240

gacagtgacagtactgactgcaccgtgagaggcctggggcccagctactgctccttcagt300

gaaatgaaagaataaagagcagtggacatttcatgcttcctacccttgtctgaaggacca360

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ctcatttggaaaccataagtttttcaaagtccgtgagtcagtatctactcagtcttatta720

ccttaaagacatgtgggtgttttctgtttaataatcttagaaatcctctcaagacaggga780

tatggacccagaggaaggaaatgggctaagaatgggtgaaaggactaaatgcagcattct840

cccactagacacagaagcctacaagagcagggccagtctctttgtcatgagtgtggcctc900

aatacctagcacagtgactagaattcagtaagaaactcaagaatggcttccttaaggaaa960

gtaagattggaaatgtagggggtaggaaaatactgaaagaagatgttggaggctatgtga1020

tg1022

<210>2

<211>17

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

attcaatgcctgtctca17

<210>3

<211>17

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

catcacatagcctccaa17