一种NPC培养基、外泌体的制备方法和应用与流程

本发明涉及治疗神经退行性疾病的药物，尤其是一种npc培养基、外泌体的制备方法和应用。

背景技术：

目前神经退行性疾病，包括阿尔兹海默症和帕金森症，主要采用药物治疗。阿尔茨海默症是一种原因未明的中枢神经系统退行性变性疾病，以渐进性记忆障碍及认知功能丧失伴随日常生活能力下降和行为改变为特征。65岁以上阿尔茨海默症患病率为6.6％，80岁以上超过22％。根据美国2018年的医学统计报告，前十大致死疾病中，阿尔茨海默症排名第六。易倍申、安理申、艾斯能和力益临是当前治疗阿尔茨海默症的主要药物。

帕金森病是继阿尔茨海默病后第二常见的老年慢性渐行神经退行性疾病，也是目前仅次于肿瘤、心脑血管病，严重威胁老年人群健康的疾病。帕金森氏病的治疗方式主要有药物治疗和外科手术，二者都可以达到一定程度上缓解症状的目的。在疾病的早期，药物可以较好地改善症状，最常用也是最有效的药物是左旋多巴制剂(商品名为美多巴或息宁)，自六十年代开始应用于临床治疗以来，一直到现在都是临床上最核心的药物。外科治疗主要有神经核团细胞毁损手术(细胞刀)与电刺激手术两种方式，原理都是为了抑制脑细胞的异常活动，达到改善症状的目的。前者是在异常活跃的神经核团上制造一个直径约3毫米的毁损灶，后者则是埋植刺激器通过高频电刺激达到类似毁损的效果。从外科手术操作技术上讲两者并没有太大的区别，均是将电极放在特定的脑内核团靶点上，之后进行刺激或毁损。神经核团细胞毁损手术最大的缺点是易复发，是不可逆治疗，而电刺激手术为可逆的、可调式治疗方式。

尽管目前对阿尔茨海默症研究已深入到分子水平和基因水平，但目前尚无任何药物或治疗方法能从根本上治愈，一旦发病只能通过药物缓解病情，这也只是在早中期可以，到了晚期，药物也没有办法，还会出现各种并发症。治疗帕金森症的药物必须长期服用，一旦停止治疗，病情则会复发。在最初几年药物治疗效果较佳，但在长期服用以后，病人会感到药物有效时间缩短，有些病人会产生″剂末″现象和″开、关″波动。药物治疗有一定的局限性，通常经过3-5年的治疗后病情会变得难以控制，药物的副作用与其疗效会功过相抵，病人感到日常生活能力受到很大限制。

由于阿尔茨海默症和帕金森症病人脑内病变的根源是神经细胞功能的减退，所以从理论上讲，神经干细胞(可以替代病人衰退的脑细胞)移植技术有很好的发展前景。干细胞，是一种未充分分化、尚不成熟的细胞，具有再生为各种组织器官和人体细胞的潜在功能。因此，干细胞及其分化产品为有效修复人体重要组织器官损伤及治愈神经系统疾病、心血管疾病、糖尿病、肿瘤、代谢性疾病、血液系统疾病、自身免疫性疾病等重要疾病提供了新的途径。但目前细胞治疗还面临着一系列的技术难点，包括细胞的储存运输、免疫排斥、致癌风险、手术难度高等，因此，细胞治疗目前的成本十分昂贵，在大规模临床应用以前还要做更细致的研究。例如，移植的干细胞可能经常从着床部位迁移，并经历一些细胞转化，导致畸胎瘤的形成。此外，由于它们的大小，干细胞通常被直接注射到中枢神经系统中，引起并发症。侵入性中枢神经系统手术由于分娩期间和分娩后发生的并发症，包括但不限于出血和水肿，使患者处于危险之中。系统地给药的干细胞通常会滞留在小毛细血管中，这可能会在肺中引起不可预计的效果。甚至可能造成疾病或损伤，干细胞治疗也能诱发不良的免疫反应。

外泌体是一种存在于细胞外的多囊泡体，可通过细胞内吞泡膜向内凹陷形成多泡内涵体，内涵体与细胞膜融合后释放其中的小囊泡。外泌体的直径在40-110nm之间其中包含rna、蛋白质、microrna、dna片段等多种物质，存在于血液、唾液、尿液、脑脊液和母乳等多种体液中。外泌体从发现至今已有30多年的历史，虽然最初被认为可能是细胞的″垃圾″，所以才被排出来，但是近年来研究表明外泌体内包含细胞因子和生长因子、信号脂质、mrna和调节mirna的内容物，具有功能活性并可参与细胞间传递、细胞信号传导、以及在体内短距离或长距离处改变细胞或组织代谢。如今，研究已经发现外泌体在抗原提呈细胞中呈递抗原程中、肿瘤细胞发生发展、神经细胞信号转导过程中都发挥着重要作用。相比传统药物手术治疗以及细胞治疗，外泌体亚(无)细胞具有费用低、安全、无免疫排斥、穿透血脑屏障、靶点准确、治疗手段简单，在无细胞再生医学拥有巨大潜力。

技术实现要素：

基于上述问题，本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种从干细胞制备外泌体的方法，所制备的外泌体用于治疗神经退行性疾病具有费用低、安全、无免疫排斥、穿透血脑屏障、靶点准确、治疗手段简单等优势。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案包括如下几个方面：

在第一个方面，本发明提供了一种神经始祖细胞培养基，包括以下组分：dmem/f12培养基，人转铁蛋白，重组人胰岛素，孕酮，皮质脂酮，t3(triodo-i-thyronine)，谷胱甘肽，过氧化氢酶，超氧化物歧化酶，乙酸维生素e，生育酚，亚油酸，硫辛酸，亚麻酸，左旋肉碱盐酸盐，腐胺，乙醇胺盐酸盐，亚硒酸钠，d-半乳糖，乳酸，丙酮酸钠，谷氨酰胺，维生素h，脂化牛血清白蛋白，抗坏血酸维生素c，氯化钠，dorsomorphin，碱性成纤维细胞生长因子和胰岛素。由此，通过向dmem/f12培养基中添加其它组份并混合均匀，即得神经始祖细胞培养基。

优选地，所述培养基以1l计算，包括以下组分：

需要说明的是，采用上述配比的神经始祖细胞培养基都能有效地诱导神经干细胞分化为神经干细胞。

在第二个方面，本发明提供了一种制备外泌体的方法，包括如下步骤：

(1)提供诱导多能干细胞，然后采用权利要求1或2的神经始祖细胞培养基诱导分化为神经干细胞，得到含有神经干细胞和外泌体的培养基；

(2)收集步骤(1)所得培养基进行纯化即得所述外泌体。

优选地，所述步骤(2)中纯化包括如下步骤：步骤(1)所得培养基用0.22um无菌过滤器过滤，过滤的培养基离心，然后将上清转移到试管中，在10000×g中离心并将上清收集到另一个试管中，然后将上清分装，使用sorvllt880固定角转子100000×g高速离心，离心后将上清液移除，并用pbs将颗粒状材料悬浮、转移到一个untrocrimp管，再经100000×g离心，再次将上清移除，并用100ulpbs将颗粒状材料悬浮，直径30～110纳米的悬浮颗粒状材料即为纯化后的外泌体。

在第三个方面，本发明提供了采用上述方法制备的外泌体。需要说明的是，本发明制备的外泌体为亚细胞结构，即外泌体的尺寸相比细胞更加细小。

在第四个方面，本发明提供了上述的外泌体在制备治疗神经退行性疾病的药物中的应用。

优选地，所述神经退行性疾病为阿尔兹海默症或帕金森症。

在第五个方面，本发明提供了一种治疗神经退行性疾病的药物，所述药物中含有上述的外泌体。

综上所述，本发明的有益效果为：

本发明提供了一种从人类诱导多能干细胞分化为神经干细胞并制备高纯度高活性外泌体的方法；本发明的外泌体亚(无)细胞具有费用低、安全、无免疫排斥、穿透血脑屏障、靶点准确、治疗手段简单等优势，在无细胞再生医学拥有巨大潜力。

附图说明

图1为本发明的实施例4中人ips细胞表达特异标记物nanog、oct4、ssea3、ssea4、tra-1-60及tra-1-81的检测结果图；

图2为本发明的实施例5中人ips分化神经干细胞表达特异标记物nestin及sox2的检测结果图；

图3为本发明的实施例6中人ips分化神经干细胞分泌的外泌体形态及表达特异物的检测结果图；

图4为本发明的实施例7中人ips分化神经干细胞分泌的外泌体在帕金森小鼠模型的行为学检测结果图；

图5为本发明的实施例8中人ips分化神经干细胞分泌的外泌体在阿尔兹海默症小鼠模型的行为学检测结果图。

具体实施方式

本发明提供了一种从干细胞提取纯化外泌体的方法，其使用基于干细胞来源的亚(无)细胞治疗方案为治疗神经退化性疾病提供了新的途径。

为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。如无特别说明，本申请中的实验方法均为常规方法。如无特别说明，本申请中的试剂、培养基或材料均可以从市场等公开渠道获得。

实施例1

本发明中npc(神经始祖细胞)培养基的一种实施例，包括dmem/f12培养基，人转铁蛋白(humantransferrin)，重组人胰岛素(humanrecombinantinsulin)，孕酮(progesterone)，皮质脂酮(corticosterone)，t3(triodo-i-thyronine)，谷胱甘肽(glutathione)，过氧化氢酶(catalase)，超氧化物歧化酶(superoxidedismutase)，乙酸维生素e(dlalphatocopherolacetate)，天然维生素e油(生育酚，dlalpha-tocopherol)，亚油酸(linoleicacid)，硫辛酸(lipoicacid)，亚麻酸(linolenicacid)，左旋肉碱盐酸盐(l-carnitinehcl)，腐胺(putrescine2hcl)，乙醇胺盐酸盐(ethanolaminehcl)，亚硒酸钠(sodiumselenite)，d-半乳糖(d-galactose)，乳酸(lacticacid)，丙酮酸钠(sodiumpyruvate)，谷氨酰胺(glutamax，赛默飞细胞培养添加剂)，维生素h(biotin)，脂化牛血清白蛋白(lipidatedbsa)，抗坏血酸维生素c(ascorbicacid)，氯化钠(nacl)，dorsomorphin，碱性成纤维细胞生长因子(bfgf)和胰岛素(insulin)；

以1lnpc培养基计算，其中各组分的含量分别为：

其中，dmem是神经细胞培养基，f12培养基成分含有多种微量元素，和dmem以1∶1结合，即称为dmem/f12培养基；

t3(triodo-i-thyronine)是gibcob-27神经细胞培养无血清添加剂其中一个配方；dorsomorphin是细胞渗透性的\可逆的和atp竞争性的amp激活蛋白激酶(ampk)抑制剂。

实施例2

本发明的npc(神经始祖细胞)培养基的一种实施例，与实施例1的npc培养基相比，区别仅在于每1l培养基中各组分的含量分别为：

实施例3

本发明的npc(神经始祖细胞)培养基的一种实施例，与实施例1的npc培养基相比，区别仅在于每1l培养基中各组分的含量分别为：

实施例4人类诱导多能干细胞(ipsc)的培养

实验方法：ipsc在使用stemadhere基底膜基质培养条件下用tesr^tm2或e8无血清无动物来源细胞培养液培养。细胞培养基每天替换并收集，并从培养基中纯化外泌体。细胞每7天使用relesr进行传代(传代比例为1∶6)。

检测结果如图1所示，通过免疫荧光染色进行检测鉴定，未分化多能干细胞表达ssea3、ssea4、tra-1-60、tra-1-81、oct4、nanog。

实施例5人类ipsc分化制备神经干细胞

实验方法：ipsc在tesr^tm2或e8培养基中增殖7天，然后使用实施例1的npc培养基诱导神经干细胞分化。7天后使用流式细胞仪对cd184+/cd271-/cd44-/cd24+神经干细胞进行细胞筛选纯化。纯化的神经干细胞重新传代于新的vitronectin基质。细胞培养基每天替换并收集，并从培养基中纯化外泌体。细胞每4天使用accutase进行传代(传代比例为1∶3)。

实验结果如图2所示，神经干细胞表达特异标记物nestin及sox2。

实施例6外泌体的纯化制备

实验方法：收集实施例5所得培养基冷冻在-20摄氏度。纯化外泌体前，培养基在4摄氏度条件下解冻，并使用0.22um无菌过滤器过滤。过滤的培养基在300×g中离心10分钟。然后将上清转移到一个新鲜的试管中，在10000×g中离心30分钟并将上清收集到一个新鲜的管子里。然后将上清分装到11.5mlsorvallultracrimp管，使用sorvllt880固定角转子100000×g4摄氏度高速离心70分钟。离心后将上清液小心移除，并用pbs将颗粒状材料悬浮和转移到另一个untrocrimp管，再100000×g4摄氏度离心70分钟。再次将上清小心移除，并用100ulpbs将颗粒状材料悬浮。纯化的外泌体产物储存在零下20摄氏度，并用nanoparticletrackinganalysis(nta)、电镜(tem)及western生化实验进行鉴定。

实验结果如图3所示，其中图3a为nanoparticletrackinganalysis(nta)分析结果的图；图3b为电镜(tem)分析结果的图；图3c为western生化分析结果的图。由图3a、3b和3c可知外泌体直径为30-110纳米，并表达外泌体特异标记物alix、cd63、cd9及cd81。

实施例7外泌体在帕金森症小鼠模型的使用及鉴定

实验方法：将实施例6制备的纯化外泌体(10，20，40，60，80，100，120，140，160，180，200，220，240，260，280，300μl)静脉注射到mptp帕金森症小鼠模型，并对旷场实验和滚轴实验行为学进行评估。

旷场实验(openfieldtest)：旷场试验用于评估旷场内的一般运动和探索活动，是一种装有自动红外光束跟踪系统的方形空间。简言之，将一只小鼠置于旷场中央，允许其在旷场中探索共30分钟。利用与设备相连的计算机中安装的光束活动系统(pas)软件，记录6段5分钟——共30分钟内的小鼠活动。每次测试前后，用70％的乙醇清洁旷场表面。利用30分钟内光束中断总数评估小鼠总体运动活动。

滚轴实验(rotarodtest)：利用装有光束和传感器的rotamexv仪器的加速旋转轴来自动检测老鼠跌倒情况，从而测量小鼠的运动协调能力，在实际滚轴试验开始之前，在滚轴上以4.0rpm的速度训练小鼠5分钟，并允许其至少休息30分钟。训练和休息后，将4只小鼠置于不同的滚轴上，由安装在与仪器相连的计算机上的软件自动记录小鼠在加速旋转轴上的停留时间。滚轴设置如下起始速度4.0rpm最大速度40rpm加速间隔30秒加速阶段4rpm。测试重复三次，记录每只小鼠的平均停留时间和结束速度。

实验结果：与20个月大的野生型小鼠相比，同龄mptp小鼠显示其自发自主活动显著减少(p＜0.01，图4a)，外泌体治疗在很大程度上增加了mptp小鼠的旷场活动(图4a)。与野生型小鼠相比，20个月的mptp小鼠运动协调严重受损(p＜0.0001，图4b)，外泌体治疗也在很大程度上增加了mptp小鼠的运动协调能力(图4b)。

实施例8外泌体在阿尔兹海默症小鼠模型的使用及鉴定

实验方法：将实施例6制备的纯化外泌体(10，20，40，60，80，100，120，140，160，180，200，220，240，260，280，300μl)静脉注射到5xfad阿尔兹海默症小鼠模型，并应用旷场实验和新奇物识别实验检测神经干细胞外泌体对5xfad小鼠学习记忆影响的情况。

旷场实验(openfieldtest)：旷场试验用于评估旷场内的一般运动和探索活动，是一种装有自动红外光束跟踪系统的方形空间。简而言之，将一只小鼠置于旷场中央，允许其在旷场中探索共30分钟。利用与设备相连的计算机中安装的光束活动系统(pas)软件，记录6段5分钟——共30分钟内的小鼠活动。每次测试前后，用70％的乙醇清洁旷场表面。利用30分钟内光束中断总数评估小鼠总体运动活动。

新奇物识别实验(novelobjectrecognitiontest)：新奇物识别(nor)任务包括一个适应阶段，随后是第二天进行的训练和测试阶段。训练前24小时，小鼠用5分钟熟悉并习惯开放的测试场地(40cm长×40cm宽×35cm高)，在此期间计算总距离(cm)、在中央的时间(s)和速度(cm/s)(tse系统)。在训练过程中，将小鼠放置于同一个盒子里，将两个相同物体放在相对的角落里。留给小鼠共20s的物体互动时间(最长10分钟内)，然后另其立即离开场地。采用训练期间同样的程序，但用一个新的物体代替原物体，在1小时后测试小鼠的物体记忆。当小鼠用鼻子接触任意一个物体时，记录物体探测情况，利用识别指数计算，识别指数＝时间新奇/(时间新奇+时间熟悉)，其中，时间新奇和时间熟悉分别表示与新的和熟悉的物体一起度过的时间。

实验结果：与20个月大的野生型小鼠相比，同龄5xfad小鼠显示其自发自主活动显著减少(p＜0.01，图5a)，外泌体治疗在很大程度上增加了5xfad小鼠的旷场活动(图5a)。我们接着评估了在20个月大的5xfad小鼠中，外泌体治疗对海马体依赖的学习和记忆能力的影响(图5a)。在进行新奇物识别实验(nor)前24小时——该实验利用识别指数测量了对于特定环境中物体的识别记忆——令小鼠熟悉并习惯行为空间。在经外泌体治疗后，5xfad小鼠在nor中表现出明显较高的物体识别指数(图5b)。

最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。