一株浅黄霉素基因簇敲除的须糖多孢菌工程菌株及其应用的制作方法

文档序号：18213983发布日期：2019-07-19 22:30阅读：130来源：国知局

本发明涉及一株浅黄霉素基因簇敲除的须糖多孢菌工程菌株及其应用。

背景技术：

使传统化学农药是当前控制农业病虫害的主要方法，但是，长期依赖和大量使用化学农药，对环境造成了严重的破坏，食品安全也无法得到保障。随着人们环保意识的增强和生活品质的提高，生物农药因其选择性强、不伤害天敌、无污染和不易产生抗性等优点，越来越受到人们的关注。

丁烯基多杀菌素(butenyl-spinosyn)是由须糖多孢菌(saccharopolysporapogona)产生的一类与多杀菌素结构类似的大环内酯类抗生素。到目前为止，丁烯基多杀菌素组分共检测到31种，这类化合物具有很好的防治农林害虫、卫生害虫和线虫的作用，是当今世界上最具发展前景的新型生物农药之一。然而，现有丁烯基多杀菌素产生菌的发酵产量低，生长周期长，限制了这一绿色生物农药的工业化生产和推广应用。因此，提高丁烯基多杀菌素产量对于农业害虫防治及生物安全具有重要的意义。

2018年，li等人首次通过基因工程技术完成对须糖多孢菌聚核苷酸磷酸激酶基因(pnp)研究，并获得高产突变株，使得利用基因工程技术对须糖多孢菌基因组进行定向遗传修饰成为提高丁烯基多杀菌素产量的有效方法（impactonstraingrowthandbutenyl-spinosynbyoverexpressionofpolynucleotidephosphorylasegeneinsaccharopolysporapogona,lil等，102（18）：8011-8021，2018）。但效果尚欠理想。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是，克服现有技术的不足，提供一株浅黄霉素基因簇敲除的须糖多孢菌工程菌株，旨在利用该浅黄霉素基因簇敲除的须糖多孢菌工程菌株进行丁烯基多杀菌素的生物合成，提高丁烯基多杀菌素生物合成的产量，降低丁烯基多杀菌素生产成本。

本发明解决其技术问题采用的技术方案是，一株该浅黄霉素基因簇敲除的须糖多孢菌工程菌株，即12号基因簇敲除的工程菌株，也即须糖多孢菌s.pogona-△cluster12，saccharopolysporapogona-△cluster12，于2019年1月22日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称cctcc，地址：中国武汉武昌区，武汉大学)，菌种保藏编号为cctccno:m2019070。

所述浅黄霉素基因簇，为须糖多孢菌基因组聚酮合成基因簇，其基因簇序列如序列表seqid№.1所示。

本发明之浅黄霉素基因簇敲除的须糖多孢菌工程菌株的构建方法如下：

（1）提取须糖多孢菌nrrl30141基因组，分别扩增1kb大小的浅黄霉素基因簇上下游同源臂；

（2）将sgrna与上下游同源臂进行融合，与质粒pkccas9do进行酶连，获得重组质粒pkccas9-sgrna-uha-dha;

（3）接合转移构建工程菌株s.pogona-△cluster12及其pcr鉴定；

（4）对构建的须糖多孢菌12号基因簇敲除工程菌（s.pogona-△cluster12）进行生理特性分析。

比较蛋白质组学分析浅黄霉素基因簇敲除后对须糖多孢菌蛋白表达水平的影响。

本发明在构建好重组质粒pkccas9-sgrna-uha-dha的基础上，利用原生质体转化的方法将外源重组质粒转入须糖多孢菌中，获得了浅黄霉素基因簇敲除的工程菌株s.pogona-△cluster12。

pcr鉴定结果表明，外源质粒已成功导入须糖多孢菌中；生长曲线测定结果显示，本发明工程菌株s.pogona-△cluster12在培养6天后进入稳定期，相对于原始菌晚2天左右，培养至第10天后，本发明工程菌s.pogona-△cluster12菌体密度是原始菌株的76.3%左右；扫描电镜观察结果发现，本发明工程菌s.pogona-△cluster12在合成发酵培养基培养至第4天后菌丝体较长，菌丝体有结状凸起；利用比较蛋白质组技术对本发明工程菌s.pogona-△cluster12和原始菌株第6天全蛋白进行分析，发现浅黄霉素基因簇敲除能够引起至少803个基因差异表达，go(geneontology)和keggpathway分析显示，这些差异表达的基因涉及糖酵解、三羧酸循环、脂肪酸代谢、氧化磷酸化等多个生物学过程。

hplc检测结果表明，利用本发明浅黄霉素基因簇敲除的须糖多孢菌工程菌株s.pogona-△cluster12进行丁烯基多杀菌素的生物合成，与利用原始菌株s.pogona进行丁烯基多杀菌素的生物合成相比，丁烯基多杀菌素的产量提高6.36倍。

微生物保藏情况说明

本发明之须糖多孢菌浅黄霉素基因簇敲除工程菌，（12号基因簇敲除工程菌株），即s.pogona-△cluster12，saccharopolysporapogona-△cluster12，于2019年2月15日保藏于中国典型培养物保藏中心，(简称cctcc，地址：中国武汉武汉大学)，保藏号为cctccno:m2019070。

附图说明

图1原始菌浅黄霉素基因簇核心基因的qrt-pcr分析；

图2重组质粒pkccas9d-sgrna-uha-dha的构建流程图；

图3本发明工程菌株s.pogona-△cluster12pcr鉴定图；

图4本发明工程菌株s.pogona-△cluster12生长曲线测定及葡萄糖消耗分析；

图5本发明工程菌株s.pogona-△cluster12菌丝形态图；

图6本发明工程菌株s.pogona-△cluster12丁烯基多杀菌素产量分析及质谱鉴定；

图7本发明工程菌株s.pogona-△cluster12蛋白表达差异及功能分析；

图8本发明工程菌株s.pogona-△cluster12差异表达蛋白调控网络分析。

具体实施方式

以下结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细说明。

（一）具体培养基配方和培养条件

（1）s.pogona种子活化培养基csm(completesyntheticmedium)：trypticsoybroth4.5g/l，glucose0.9g/l，yeastextract0.3g/l，mgso4^.7h2o0.22g/l。接种单克隆或2%菌种保藏液加入装有20mlcsm的150ml摇瓶中，30°c，200r/min培养48h;

（2）s.pogona合成发酵培养基sfm(syntheticfermentationmedium)：glucose20.0g/l，yeastextract4.0g/l，tryptone4.0g/l，kno31.0g/l，k2hpo4·3h2o0.5g/l，mgso4·7h2o0.5g/l，feso4·7h2o0.01g/l。接种2%的菌种活化液加入装有50mlsfm的300ml摇瓶中，30°c，250r/min培养12d。

（3）原生质体转化采用r5培养基：蔗糖103g/l，葡萄糖10g/l，酪蛋白氨基酸0.1g/l，yeastextract5g/l，k2so40.25g/l，mgcl2·6h2o10.12g/l，tes5.73g/l，微量元素溶液2ml(zncl240mg/l，fecl3·6h2o200mg/l,cucl2·2h2o10mg/l,mncl2·4h2o10mg/l,na2b4o7·10h2o10mg/l,(nh4)6mo7o4·4h2o10mg/l)，琼脂粉15-20g/l，使用之前在培养基中分别加入已过滤除菌的kh2po3(0.5%)2.5ml/l，l-脯氨酸(20%)3.75ml/l和cacl2·2h2o(5m)1ml/l。

（4）e.colidh5α液体培养基lb(luria-bertani)：tryptone1g/l，yeastextract0.5g/l和nacl1g/l。在上述液体中加入15-20g/l的琼脂粉可配制成lb固体培养基。

二)实时荧光定量pcr检测

将在csm活化培养基中活化好的原始菌s.pogona转接至合成发酵培养基中，30℃，280r/min培养，分别取第2、4、6、8天的菌液1ml，进行总rna提取，rna提取方法采用trizol试剂盒法(sangon)，并严格参照说明书步骤进行。

以16srrna为内参，对原始菌株中浅黄霉素基因簇核心基因的mrna表达水平进行分析，设定原始菌株培养2天时浅黄霉素基因簇核心基因mrna与其内参mrna的比值为1，每个样品设4个重复。由图1可知，与原始菌株第2天相比，其核心基因在不同时期表达水平发生了显著的变化，说明该基因簇的相关蛋白存在一定水平的表达（图1）。

（三）重组质粒pkccas9-sgrna-uha-dha构建

以s.pogona基因组为模板，设计两对引物fuha/ruha和fdha/rdha扩增浅黄霉素基因簇上下游1kb大小的同源臂，并利用pkccas9do为模板，设计一对引物fsgrna/rsgrna扩增sgrna序列，引物序列见表1。同时引物fsgrna和rdha5’分别带有spei和hindiii酶切位点，用于与质粒pkccas9进行连接。

常规pcr反应体系：2×gcbuffer10µl，正向引物（uha-f、dha-f、sgrna-f）1.0µl，反向引物（uha-r、dha-r、sgrna-r）1.0µl，dntp1.6µl，模板（pkccas9do、s.pogona)1.0µl，ddh2o5.2µl，primerstardna聚合酶0.2µl。pcr反应程序：95℃5min；95℃30s，58℃30s，72℃60s(sgrna为30s)，30个循环；72℃延伸10min。

融合pcr第一阶段反应体系：2×gcbuffer10µl，dntp1.6µl，sgrna与浅黄霉素基因簇上、下游同源臂模板各0.5µl，ddh2o6.7µl，primerstardna聚合酶0.2µl。pcr反应程序：95℃5min；95℃30s，58℃30s，72℃2.5min，10个循环；72℃10min。

融合pcr第二阶段反应条件：10个循环的常规pcr之后加入sgrna-f/dha-r各1µl。pcr反应程序：95℃3min；95℃30s，58℃30s，72℃2.5min，30个循环；72℃10min。

将上述融合pcr产物进行回收、纯化，并利用spei和hindiii对其进行双酶切，同时，对质粒pkccas9do也进行相同的双酶切用于构建重组质粒。回收、纯化后产物在t4dna连接酶的作用下与线性化质粒pkccas9do进行酶连。将连接产物热转入e.colidh5α感受态细胞中，并在lb抗性平板(阿泊拉霉素)上进行转化子筛选和验证，获得重组质粒pkccas9d-sgrna-uha-dha（图2）。

（四）重组菌株s.pogona-△cluster12的构建及验证

将构建的重组质粒pkccas9d-sgrna-uha-dha电转入供体菌e.colis17，经阿泊拉霉素筛选转化子，提取质粒进行酶切鉴定，获得阳性转化子e.coils17（pkccas9d-sgrna-uha-dha）。以e.colis17作为供体菌，以本实验室的须糖多孢菌作为受体菌进行接合转移。将长出的单克隆在csm固体培养基上纯化2次，然后挑取转化子转接至50mlcsm培养基（含阿泊拉霉素）中，30℃、280r/min培养3～5d。取1ml阳性克隆子的菌液，提取基因组dna，以野生型菌株基因组为对照，以uha-f/dha-r为引物，pcr扩增浅黄霉素基因簇上下游同源臂。将鉴定到的阳性接合子，命名为s.pogona-△cluster12，-80℃保藏。扩增上下游同源臂基因pcr反应条件：94℃5min；94℃30s，59℃30s，72℃120s，30个循环；72℃10min。pcr反应体系：2×gcbuffer10µl，uha-f1.0µl，dha-r1.0µl，dntp1.6µl，dna模板1.0µl，ddh2o5.2µl，primerstardna聚合酶0.2µl（图3）。

（五）浅黄霉素基因簇敲除对s.pogona生长发育的影响

（1）对菌株生长曲线的影响

分别将活化好的本发明工程菌株s.pogona-△cluster12和原始菌株等量转入合成发酵培养基中，每12小时取样进行菌体od600值测定(测定值在0.2~08之间，以保证测定结果的准确性，否则对样品进行稀释)，取样周期为12天。如图4所示，本发明工程菌株s.pogona-△cluster12与原始菌株相比，生长曲线有显著变化，其在液体发酵培养基的最大生物量略低于原始菌，且稳定期相较于原始菌株缩短（图4）。

（2）对合成发酵培养基中葡萄糖消耗的影响

分别将活化好的本发明工程菌株s.pogona-△cluster12和原始菌株等量转入合成发酵培养基中，每24h取样进行发酵液上清中葡萄糖含量测定。实验结果如图2所示，本发明工程菌株s.pogona-△cluster12在合成发酵培养基中葡萄糖消耗与原始菌株有着明显差异，后者培养至第6天时培养基中葡萄糖基本消耗完毕，但是s.pogona-△cluster12工程菌株的葡萄糖消耗相较于野生型速度较慢，直到衰亡期才基本消耗完毕，说明浅黄霉素基因簇敲除后极大影响了菌株对葡萄糖的利用（图4）。

（3）对菌丝体形态的影响

分别将活化好的本发明工程菌s.pogona-△cluster12和原始菌株等量接种至20mltsb培养基，300r/min培养2天，各取1ml样品用pbs洗10遍，后经2.5%的戊二醛固定过夜以及不同浓度梯度乙醇(30%、50%、70%、90%、95%和100%)脱水处理后，可使用日立su8010冷场发射扫描电子显微镜进行本发明工程菌株s.pogona-△cluster12与原始菌株菌丝体形态观察。如图5所示，本发明工程菌株s.pogona-△cluster12菌丝体相较于原始菌细长，分支减少，表面皱缩更加明显，可看到菌丝体有略微的结状凸起（图5）。

（4）对丁烯基多杀菌素生物合成的影响

分别将活化好的本发明工程菌株s.pogona-△cluster12和原始菌株等量转入合成发酵培养基中，取每天的发酵液进行丁烯基多杀菌素产量检测。具体操作步骤为，取500µl发酵液于1.5ml的ep管中，并加入等体积的乙酸乙酯进行混匀，50℃浸提1h；12000r/min离心10min，取上清液(含有丁烯基多杀菌素)，冷冻干燥后加入50µl甲醇溶解；即可使用agilent1290超高效液相色谱系统测定上清液中丁烯基多杀菌素含量。hplc1290仪器参数设置为：色谱柱型号(zorbaxsb-c18)，柱温：室温，流动相：a相为10%乙腈，b相为90%乙腈，流速：1.0ml/min，上样体积：20µl，检测波长：250nm。通过仪器自带的分析软件计算丁烯基多杀菌素峰面积。

hplc1290检测结果如图所示，在13.1min左右的色谱峰最大吸收波长约为250nm，质谱鉴定证实该色谱峰为丁烯基多杀菌素。经软件分析后发现，本发明工程菌株s.pogona-△cluster12在13.1min的平均峰面积为2175.81±128.87，而原始菌株在此外的平均峰面积为295.63±22.96，工程菌株s.pogona-△cluster12丁烯基多杀菌素产量相比原始菌株提高了约6.36倍（图6）。

（六）工程菌株s.pogona-△cluster12差异蛋白质组分析

为了分析浅黄霉素基因簇敲除后对须糖多孢菌全蛋白质组的影响，采用比较蛋白质组技术对本发明工程菌株s.pogona-△cluster12与原始菌株菌体蛋白进行分析。生长曲线及多杀菌素累积曲线分析结果显示，原始菌和工程菌株s.pogona-△cluster12在第六天处于稳定生长期且丁烯基多杀菌素处于快速累积阶段，因此，选择第6天的菌体进行差异蛋白质组分析。通过分析，可帮助解析浅黄霉素基因簇敲除对菌体生长变化以及丁烯基多杀菌素提高的原因。首先，将活化好的本发明工程菌株s.pogona-△cluster12和原始菌株等量转入合成发酵培养基中，取培养至第6天的发酵液进行菌体总蛋白提取及酶解(重复样品三个)。总蛋白提取及酶解步骤可参考文献（yangq,dingxz,liuxm,etal.differentialproteomicprofilingrevealsregulatoryproteinsandnovellinksbetweenprimarymetabolismandspinosadproductioninsaccharopolysporaspinosa.microbialcellfactories2014,13:27）。对制备好的样品进行itraq试剂盒标记以及质谱鉴定，搜库后即可获得鉴定到的蛋白质信息。

本次分析鉴定到野生型和突变菌株共有蛋白2910种，其中具有表达差异的蛋白803种。对蛋白的表达差异进行go和kegg功能分析。结果显示，在鉴定到的443个差异蛋白中，大部分具有显著变化差异的蛋白属于初级代谢和基因信息过程功能类别（图7）。我们集中对糖酵解、三羧酸循环、丁烯基多杀菌素前体合成等代谢过程进行分析并建立起它们之间的联系，详细阐述了参与葡萄糖代谢和丁烯基多杀菌素合成相关酶类所体现出的蛋白表达变化（图8）。从图8可以看出，参与丁烯基多杀菌素合成以及相关前体合成代谢的生物学过程中，蛋白表达得到加强，而三羧酸循环，糖酵解等过程的蛋白表达却受到抑制，再加上本发明工程菌株培养至第6天时培养基中还存留有大量葡萄糖，使得s.pogona-△cluster12工程菌株能够促使胞外葡萄糖继续通过糖酵解途径代谢产生acetyl-coa及其它重要前体，供菌体继续生长；同时减少三羧酸循环对前体acetyl-coa的利用，所形成的前体最终流向丁烯基多杀菌素生物合成途径，从而促进丁烯基多杀菌素生物合成。

表1菌株、质粒和引物

注：限制性内切酶斜体加粗，重叠序列用下划线表示

表2s.pogona与s.pogona-δcluster12杀虫活性比较

序列表

<110>湖南师范大学

<120>一株浅黄霉素基因簇敲除的须糖多孢菌工程菌株

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>40985

<212>dna

<213>须糖多孢菌(saccharopolysporapogona)

<400>1

gtggtcgagtttccggcagtggtggggatcgcggtggtggcgctgggcctggtgctcacg60

cccggaccgaacatgttctacctggtgtctcggtcgctgacgcaggggcggcgggccggg120

ctggtgtcgctgttgggggtggcggtggggttcctggtgtacgccgcggccgccaccgcc180

ggcatcgccacagtgttcgccctggtgcccgcgctgtacatggtgttgcagatcgccggt240

gcggcgtacctgctgtggttggcgtggcaggcggtgcggccgggcggggtgtcggtgttc300

gcgccggtaccaaatcccgactacgggccggggcggttgttcgcgatgggtttggtgacc360

aacctgctcaacccgaagatcgcggttctctacgtgtcgttgctgccgcagttcatcgac420

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cgttccagcgctgccgcagccagcggtcgtggctggcgacgacgatggcgccgcaagcgg4620

tgtgcagggcgtcttcgagttcgctgacgagggtcagcgacaggtggttggtgggttcgt4680

ccagcaacaacacctgtggtgggtcgccgagcaccagggccagggccagtcggcggcgct4740

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