一种光控稳健基因振荡系统的制作方法

文档序号：18702561发布日期：2019-09-17 23:08阅读：1217来源：国知局

本发明涉及基因调控技术领域，尤其涉及一种光控稳健基因振荡系统。

背景技术：

现在有很多种类型的基因振荡器和光控基因表达系统，但据我们所知，利用光控系统控制基因振荡器的研究还没有。

由于生物系统内部的复杂性，直接研究生物振荡器是比较困难的，所以近年来，科学家们常常通过人为设计更加简单的基因回路，构建基因振荡器，来研究生命振荡行为。但如果只从生物元件本身入手进行改进，可控性比较差，很难做到精确调节。此外，目前人们对这些元件的定量化理解还不够深入，无法实现灵活调控。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种光控稳健基因振荡系统。本发明利用光遗传学方法，通过整合光遗传学基因表达控制模块并施加光控来增加基因振荡器的可控性和稳健性。

本发明以两套光控稳健基因振荡系统为例，进行了演示。首先，在大肠杆菌中分别构建了两套受到光照调控的群体同步基因振荡器——蓝光光控基因振荡器和红光光控基因振荡器。同时，还在计算机中编写了能够根据光控基因振荡器的振荡观测值实时调节光源照射强度和照射时间的计算机程序，以“群体同步基因振荡器模拟程序”(命名为：虚拟振荡器)为例。两种光控基因振荡器(红光和蓝光)受到虚拟振荡器的调控，构成了两种光控稳健振荡系统。在每套光控稳健振荡系统中，利用虚拟振荡器对光控基因振荡器进行实时调控，即，通过虚拟振荡器使光照强度和时间呈现稳定的振荡，借助稳定振荡的光照调控光控基因振荡器中相关基因的表达水平，最终使基因振荡器的振荡行为更加稳健和可控。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：

一种光控稳健基因振荡系统，包括光控基因振荡器和调控光源；所述光控基因振荡器是由光控元件与基因振荡元件在细胞中整合而成；所述调控光源包含计算调控部件和光源，其中，所述计算调控部件能够基于所述光控基因振荡器的振荡观测值实时发出调控信号，调节所述光源的照射强度和照射时间；所述光控基因振荡器根据调节的光源照射强度和照射时间，调整其振荡行为。

进一步地，所述光控元件为光遗传学基因表达控制模块。

进一步地，所述光源是能够引起光遗传学分子响应的特定波长的光源。

进一步地，所述计算调控部件包括具有逻辑运算和逻辑处理功能的计算机程序、智能移动设备、嵌入式硬件系统、数字电路、数字光路、模拟运算电路或模拟运算光路中的任意一种或其组合。

进一步地，所述光控基因振荡器包括但不限于蓝光光控基因振荡器和红光光控基因振荡器，所述蓝光光控基因振荡器受到蓝光的调控，所述红光光控基因振荡器受到红光的调控，其中蓝光光控基因振荡器的荧光报告蛋白为mtagbfp2，红光光控基因振荡器的荧光报告蛋白为sfgfp。

进一步地，所述蓝光光控基因振荡器的光控元件是如序列seqno:1所示的质粒。

进一步地，所述蓝光光控基因振荡器的基因振荡元件是如序列seqno:2所示的质粒。

进一步地，所述红光光控基因振荡器的光控元件是如序列seqno:3所示的质粒。

进一步地，所述红光光控基因振荡器的基因振荡元件是如序列seqno:4所示的质粒。

进一步地，所述蓝光光控基因振荡器的光控元件包括el222基因和luxi启动子；所述el222基因序列位于启动子pluxi的-10区下游；或el222基因序列替换启动子pluxi的-35区和-10区的间隔序列，同时在-10区的下游也插入el222基因序列；或el222基因序列位于启动子pluxi的-35区和-10区的间隔序列。

本发明的有益效果：本发明通过添加光源调控机制，对基因振荡行为进行精确调控，使其更为稳健和可控。本发明有助于加深对基因振荡回路的理解，对生命系统中振荡的调控以及构建稳健的大型合成生物学系统有一定的理论指导意义。实际应用方面，稳健的光控基因振荡系统可以整合到细胞中，使其根据需求周期性地表达某种基因，节约生产成本，提高生产效率。

附图说明

图1为实施例4中虚拟振荡器对光控基因振荡器的调控机制示意图(其中a为光照强度函数；b为虚拟振荡器的数学模型；c为虚拟振荡器振荡行为模式图)。

图2为实施例4中蓝光光控基因振荡器稳健性分析示意图(其中a为调控前荧光振荡现象及每个振荡的周期、振幅变化分析示意图；b为调控后荧光振荡现象及每个振荡的振幅、周期变化分析示意图)。

图3为实施例4中红光光控基因振荡器稳健性分析示意图(其中a为调控前荧光振荡现象及每个振荡的周期、振幅变化分析示意图；b为调控后荧光振荡现象及每个振荡的振幅、周期变化分析示意图)。

具体实施方式

为了更加简洁明了地展示本发明的技术方案、目的和优点，下面结合具体实施例及其附图对本发明做进一步的详细描述。

实施例1蓝光光控基因振荡器的构建

1.蓝光光控元件的构建

1.1蓝光光控质粒的构建

(1)将合成的el222基因片段，插入到ptd103aiia(cm)质粒中，得到甘油菌和质粒干粉(ptd103aiia_el222)。

(2)细菌活化及菌株的保藏

①取含有ptd103aiia_el222质粒的甘油菌于cm抗性的lb固体培养皿上进行平板划线活化(分区划线法)，过夜培养。

②在平板上挑取单个菌落，接种于5ml、cm抗性的lb液体培养液中，并于恒温摇床中，37℃、180r/min过夜培养。

③保菌：转接30μl过夜菌液于3ml、cm抗性的lb液体培养液中培养至对数中期(大概3-4h)，再于甘油管中，按照1:1的比例将菌液和50％的灭菌甘油混合均匀，分别于-20℃和-80℃冰箱中短期和长期保存。

(3)质粒抽提(质粒小量提取试剂盒)

①富集。取2ml离心管，向其中加入2ml含有ptd103aiia_el222质粒的菌液，12000×g离心1min,弃上清后，加入2ml菌液再次离心弃上清，以此重复。

②重悬。向离心管中加入200μlsolutioni,置于涡旋仪上充分混匀至无菌块。

③裂解。加入200μlsolutionii,轻柔混匀5次左右，使得溶液变为澄清状态。

④中和。加入200μlsolutioniii,轻柔颠倒混匀5次左右，此时出现大量白色絮状沉淀。

⑤离心沉淀。将离心管置于离心机中，12000×g离心8-10min,直至白色絮状沉淀沉到管底或管壁。

⑥取吸附柱插入收集管中，吸取白色沉淀以外的上清液(不要吸到白色沉淀)于吸附柱中，12000×g离心1min。

⑦倒尽滤液，往吸附柱中加入500μl的washsolutiona,12000×g离心1min。

⑧倒尽滤液，往吸附柱中加入700μl的washsolutionb,12000×g离心1min，弃滤液，重复该步骤一次。

⑨倒尽滤液，将离心管置回离心机中,12000×g空甩5min。

⑩取一干净的1.5ml离心管，将吸附柱插入其中，加入50-100μlelutionsolution,静置1-2min后，12000×g离心1min,即可获得质粒。最后用超微量分光光度计测量ptd103aiia_el222质粒的浓度并进行记录。

(4)酶切

提取ptd103aiia_el222质粒后，用speⅰ限制性核酸内切酶进行酶切验证。预计目标质粒在speⅰ内切酶酶切后会形成两个线性片段，长度分别为1005bp和3581bp。按照表1反应体系配制好酶切体系后混匀，离心，37℃酶切30min。

表1：酶切反应体系

(5)琼脂糖凝胶电泳验证

①取宽型有机玻璃制胶板，水平放入制胶槽中，插入梳子。

②取3g琼脂糖和30ml浓度为1×的tae溶液加入250ml锥形瓶中，置于微波炉中加热至完全融化，制得1％的分离胶。

③待胶液冷至60℃左右时，加入1μl的goldenview混合均匀，倒入制胶板后，放置于水平桌面室温冷却，形成均匀水平的胶面。

④待胶凝固后，小心地拔起梳子，将制胶板周围的凝胶清理干净后，放入电泳槽中，并向电泳槽中倒入1×的tae溶液至覆盖过胶面。

⑤将样品加入loadingbuffer混匀后，注入加样孔中，并向另外的加样孔中注入5000bp的marker作为参照。

⑥接通电泳仪和电泳槽，80v电压电泳约30-40min，待溴酚蓝的带(蓝色)跑到三分之二时关闭电泳仪。

(6)琼脂糖凝胶电泳鉴定呈阳性后，将质粒送到测序公司测序鉴定。

1.2蓝光光控元件启动子的构建

本实验采用gibsonassembly方法进行构建。

(1)设计并合成引物，以实现在pluxi的-10区下游、-35区和-10区之间以及两者的区域同时插入el222靶定序列。此实验所用的模板质粒为ptd103aiia_el222。pcr反应引物、扩增片段、反应体系及反应程序分别见表2-5。

表2：pcr反应引物

表3：pcr扩增片段

表4：pcr反应体系

表5：pcr反应程序

(2)琼脂糖凝胶电泳分离目标dna片段

(3)回收目标dna片段

①在紫外灯下切下含有目标dna片段的琼脂糖凝胶，置于2ml离心管中。计算凝胶重量并以该重量作为一个凝胶体积。

②加入3个凝胶体积的bufferde-a,混合均匀后75℃水浴加热，间断混合直至凝胶块完全融化。

③加入0.5个bufferde-a体积的bufferde-b，混匀。

④吸取上一步的混合液，转移到dna制备管中，12000×g离心1min，弃滤液。

⑤将制备管置回离心管，加入500μl的bufferw1，12000×g离心30s，弃滤液。

⑥将制备管置回离心管，加入700μl的bufferw2，12000×g离心30s，弃滤液。再重复一次。

⑦将制备管置于2ml离心管中，12000×g离心1min。

⑧将制备管置于洁净的1.5ml离心管中，在dna制备膜正中央加30μleluent，室温静置2min。12000×g离心1min，洗脱dna，得到dna样品。

(4)重组反应

按gibsonassembly反应体系加样(反应体系见表6)，50℃温浴30min。

表6：gibsonassembly反应体系

(5)转化

①将-80℃保存的t1感受态细胞置于冰中融化10min。

②在超净台中，将上一步得到的质粒加入到100μl的t1感受态中，轻轻混匀后冰中放置30min。

③42℃水浴热激90sec后，立即于冰中放置2min，注意该过程中不要剧烈晃动离心管。

④加入500μl的37℃预温的lb培养基，抽吸混匀。

⑤复苏菌液，37℃，180r/min培养45min。

⑥取100μl菌液加到cm抗性的lb固体培养基平板上，用涂布棒涂抹均匀后，将平板倒置于37℃恒温培养箱中过夜培养。

(6)挑选重组受体菌、保藏菌株

此实验构建的启动子质粒为ptd103aiia_el222_10eb、ptd103aiia_el222_35eb10、ptd103aiia_el222_35eb10eb质粒。

(7)酶切检验、送测

用psti内切酶酶切，酶切后三种质粒的长度大概为4600bp，琼脂糖凝胶电泳检测呈阳性后，将质粒送到测序公司测序鉴定。

1.3蓝光光控效果检验质粒的构建

为了直观检验三种光控启动子的光控效果，本实验需要将光控启动子后面的aiia基因替换为sfgfp荧光报告蛋白基因。

(1)提质粒(ptd103aiia_el222_10eb、ptd103aiia_el222_35eb10、ptd103aiia_el222_35eb10eb、ptd103luxi_sfgfp)。

(2)设计并合成引物，进行pcr反应，再通过重组反应将ptd103aiia_el222_10eb、ptd103aiia_el222_35eb10、ptd103aiia_el222_35eb10eb三种质粒的aiia元件换成sfgfp元件。pcr反应引物及扩增片段见表7、表8。

表7：pcr反应引物

表8：pcr扩增片段

(3)琼脂糖凝胶电泳分离目标dna片段、回收目标dna片段

步骤同上。

(4)重组反应

按表9反应体系加样，50℃水浴，30min。

表9：重组反应体系

(5)转化：

使用mg1655感受态细胞进行转化，步骤同上。

(6)挑选重组受体菌、保藏菌株。

(7)pcr、琼脂糖凝胶电泳检测呈阳性后，将质粒送到测序公司测序鉴定。构建好的质粒即为ptd103aiia_el222_10eb_sfgfp、ptd103aiia_el222_35eb10_sfgfp、ptd103aiia_el222_35eb10eb_sfgfp。

1.4群体同步基因振荡器的改进

1.4.1荧光蛋白的获取

(1)mtagbfp荧光蛋白的获取

①在igem2015kitplate119i孔中加10μl的无菌ddh2o，质粒干粉溶解后溶液变为红色。(元件来源：igem2015kitplate119i，质粒骨架为psb1c3，抗性为cm。)

②取5μl质粒转化到t1感受态中，摇菌培养、保藏菌株备用。

③将质粒或菌液送到测序公司测序鉴定，确定序列正确后进行后续操作。

(2)mtagbfp2的获取

①设计并合成引物进行pcr反应，以更改mtagbfp序列为mtagbfp2(mtagbfp的第一、二个氨基酸更换为mvskge六个氨基酸，第174位的氨基酸i更换为a)。pcr的模板质粒为psb1c3-mtagbfp。pcr反应引物及扩增片段见表10-11。

表10：pcr反应引物

表11：pcr扩增片段

②琼脂糖凝胶电泳分离目标dna片段

③回收目标dna片段

④重组反应

按照表12反应体系加样，50℃水浴，30min。

表12：重组反应体系

⑤转化

使用t1感受态细胞进行转化，步骤同上。

⑥挑选重组受体菌、保藏菌株

⑦pcr、琼脂糖凝胶电泳检测呈阳性后，将质粒送到测序公司测序鉴定。

1.4.2荧光蛋白性能比较

为了比较mtagbfp荧光蛋白、mtagbfp2荧光蛋白的蛋白亮度，选取更加合适的荧光蛋白，本实验将荧光蛋白基因前的启动子更换为pbad，使蛋白表达能够受到阿拉伯糖浓度的控制。同时，本实验以sfgfp荧光蛋白作为对照。

(1)荧光蛋白性能检测质粒构建

先通过pcr扩增得到连接片段，再琼脂糖凝胶电泳分离目标dna片段、回收后进行gibsonassembly反应，然后进行转化、涂平板等操作，实验步骤大致同上，最终得到pbad_sfgfp、pbad_mtagbfp、pbad_mtagbfp2质粒。pcr反应引物及扩增片段见表13-14。

表13：pcr反应引物

表14：pcr扩增片段

(2)荧光蛋白性能比较

①将三种性能检测菌体加入到含有1％阿拉伯糖溶液的lb液体培养基中，培养至对数期。

②进行大肠杆菌群体荧光显微观测，比较三种荧光蛋白的亮度情况。

2.基因振荡元件的构建

2.1群体同步基因振荡元件荧光蛋白的替换

以mtagbfp2为报告蛋白的群体同步基因振荡元件质粒(ptd103luxi_mtagbfp2)构建需要三步，需先构建ptd_luxr_mtagbfp2质粒，再通过插入luxi片段构建ptd103luxi_mtagbfp2v质粒，最后在mtagbfp2元件的cds区后加入快速降解标签。

实验方法为gibsonassembly，实验步骤大致同上。质粒构建完成后用p1、m2-pv引物扩增和ecori内切酶酶切(酶切后片段长度为1864bp、3675bp)后，进行琼脂糖凝胶电泳检验。pcr扩增片段及反应引物见表15-16。

表15：pcr扩增片段

表16：pcr反应引物

3.蓝光光控基因振荡器的整合

将ptd103luxi_mtagbfp2质粒和ptd103aiia_el222_35eb10(cm)质粒共转化到mg1655菌株中，形成蓝光光控基因振荡器。

(1)质粒供体菌培养、提质粒

将含有ptd103luxi_mtagbfp2、ptd103aiia_el222_35eb10(cm)质粒的菌株过夜摇菌后提质粒。

(2)转化

将上述两质粒共转化到mg1655感受态细胞中。

(3)挑选目标菌落、保藏菌株

实验步骤同上。

(4)酶切、测序检验

①酶切检验：用bglⅱ限制性内切酶酶切，其在ptd103luxi_mtagbfp2和ptd103aiia_el222_35eb10质粒中都为单酶切位点，酶切后分别形成5539bp和4589bp的线性片段。

②测序检验

测序反应引物序列见表17。

表17：测序反应引物

实施例2红光光控基因振荡器的构建

1.红光光控元件的构建

1.1ptd103aiia_ho1_pcya_aiia质粒的构建

将不同质粒上的光控元件和振荡器元件进行整合，主要分两步进行。

1.1.1peo100c_aiia质粒的构建

(1)质粒供体菌培养、提质粒：将含有peo100c质粒和ptd103aiia(cm)质粒的菌株过夜摇菌后提质粒。

(2)设计引物进行pcr扩增，得到插入片段和载体片段，以进行后续的gibsonassembly反应。pcr扩增片段及反应引物见表18-19。

表18：pcr扩增片段

表19：pcr反应引物

(3)琼脂糖凝胶电泳分离目标dna片段并进行回收

实验步骤同上。

(4)gibsonassembly

按照表20反应体系加样，50℃温浴30min。

表20：gibsonassembly反应体系

(5)转化

将gibsonassembly得到的质粒转入到t1感受态中。

(6)挑选重组受体菌、保藏菌株

(7)酶切、测序鉴定

将peo100c_aiia质粒用pstⅰ限制性内切酶酶切后得到长度为5372bp的线性片段，琼脂糖凝胶电泳检测呈阳性后，将质粒送到测序公司测序鉴定。

1.1.2目标质粒的构建

将上述peo100c_aiia质粒与ptd103aiia_ho1_pcya质粒进行整合。

(1)插入片段pcr

模板dna为peo100c_aiia，pcr后形成pompc+aiia片段，长度为2193bp，所用pcr反应引物见表21。

表21：pcr反应引物

(2)载体片段酶切

酶切载体质粒为ptd103aiia_ho1_pcya，speⅰ限制性内切酶酶切后得到长度为5372bp的线性片段。

表22：酶切反应体系

向pcr管中，按照先加大体系再加小体系的原则，分别加入表24所示的反应体系，混匀后轻弹去除气泡，低速离心。于37℃温浴1h酶切。

(3)琼脂糖凝胶电泳分离目标dna片段、回收目标dna片段

将插入片段和载体片段分别进行琼脂糖凝胶电泳分离目标dna片段后，回收目标dna片段。

(4)重组反应

于pcr管中加入表25所示反应体系，混匀后低速离心。50℃，温浴30min。

表23：重组反应体系

(5)转化、涂平板

转化到t1感受态中，步骤同上。

(6)挑选重组受体菌、保藏菌株

(7)酶切检验、送测

将目标质粒用pst1内切酶进行酶切，预计质粒被切成两部分，长度分别为4625bp和2918bp，琼脂糖凝胶电泳检测呈阳性后，将质粒送到测序公司测序鉴定。

2基因振荡元件的构建

ptd103luxi_sfgfp_cph8(amp)质粒的构建：

因为ptd103luxi_sfgfp_cph8(kan)质粒的抗性与宿主菌株jt2自带的抗性相同，培养过程中容易造成质粒丢失，所以需要将kan基因更换为amp基因。

(1)以peo100c_aiia为模板，以amp-fwd、amp-rev为引物，进行目的片段扩增，为amp基因片段两端添加bglⅱ和speⅰ两个酶切位点。目的片段长度1172bp，pcr反应体系和反应程序同上，反应引物见表24。

表24：pcr反应引物

(2)pcr产物纯化(easypurepcrpurificationkit)

①取50μl的amp基因片段pcr产物，加入250μl溶液bb，混匀后加入离心柱，静置1min后，10000×g离心1min，弃去流出液。

②加入650μl溶液wb，10000×g离心1min，弃去流出液。

③10000×g离心2min，彻底去除残留的wb。

④将离心柱置于干净的离心管中，在柱的中央加入30μl溶液eb。室温静置1min，10000×g离心1min，洗脱dna，得到pcr纯化产物。

(3)酶切反应

将amp基因片段的pcr纯化产物和ptd103luxi_sfgfp_cph8(kan)质粒都进行speⅰ和bglⅱ双酶切。因为两个酶工作的最适buffer不同，所以先用bglⅱ酶切后，进行产物纯化，再用speⅰ酶切。

bglⅱ酶切：向pcr管中，按照先加大体系再加小体系的原则，分别加入表25所示反应体系，混匀后轻弹去除气泡，低速离心。于37℃温浴15min酶切。

表25：酶切反应体系

②酶切产物纯化(步骤同pcr产物纯化)

speⅰ酶切：于pcr管中加入表26所示反应体系，于37℃温浴1h酶切。

表26：酶切反应体系

(4)琼脂糖凝胶电泳分离目标dna片段、回收目标dna片段

步骤同上。amp基因片段酶切后长度为1155bp，ptd103luxi_sfgfp_cph8(kan)载体片段酶切后长度为7129bp。

(5)酶连反应(dnaligationkitver.2.1)

于离心管中按照表27所示反应体系进行加样，16℃反应30min。

表27：dna连接反应体系

(6)转化、涂平板

转化到t1感受态中，步骤同上。

(7)挑选目标菌株、保藏菌株

(8)pcr、送测检验

以表26所示的amp-fwd、amp-rev和cph8-fwd、cph8-rev为引物分别进行pcr反应，形成amp和cph6片段，预计分别为1197、2235bp。然后进行琼脂糖凝胶电泳检测，检测呈阳性后，将质粒送到测序公司测序鉴定。

3红光光控基因振荡器的整合

(1)将ptd103luxi_sfgfp_cph8(amp)和ptd103aiia_ho1_pcya_aiia质粒共同转化到jt2大肠杆菌菌株中，实验步骤同上。

(2)挑选目标菌落、保藏菌株

(3)酶切、琼脂糖凝胶电泳验证

于pcr管中，按照表30所示体系加样。37℃，温浴1h。

pstⅰ酶切后，ptd103luxi_sfgfp_cph8(amp)质粒有3个酶切位点，ptd103aiia_ho1_pcya_aiia质粒有2个酶切位点，两质粒用pstⅰ酶切共得到5个片段，长度分别为：1867bp、2379bp、2920bp、3948bp、4609bp。

表28：酶切反应体系

(4)琼脂糖凝胶电泳检测呈阳性，则表明目标质粒已经转入jt2中。

实施例3大肠杆菌荧光观察

1大肠杆菌涂片观察

1.1大肠杆菌涂片制作

(1)取含有pbad_sfgfp、pbad_mtagbfp、pbad_mtagbfp2质粒的mg1655大肠杆菌，分别于含有阿拉伯糖溶液、cm抗生素的lb培养液中培养3-4h，至对数期中期。(上述培养为振荡系统报告蛋白的选取实验，并进行群体荧光亮度检测；蓝光光控系统效果比较实验则将含有ptd103aiia_el222_10eb_sfgfp、ptd103aiia_el222_35eb10_sfgfp、ptd103aiia_el222_35eb10eb_sfgfp质粒的mg1655大肠杆菌分别于3-oxo-c6-hsl溶液中培养，进行单细胞荧光亮度检测。)

(2)取1.5ml灭菌离心管，加入1.5ml菌液，12000×g离心后去除上清液。利用残余的少许上清液，将大肠杆菌沉淀在高速涡旋仪上涡旋，使之形成均一的浓稠的菌液，用作大肠杆菌群体荧光亮度检测。(大肠杆菌单细胞荧光亮度检测：取0.9％的生理盐水，按照百分之一的比例将大肠杆菌培养液进行稀释。)

(3)取干净的载玻片，吸取5μl上述菌液，于载玻片均匀涂布后，轻轻盖上盖玻片，注意不要有气泡。最后，用吸水纸将盖玻片周围多余的液体清理干净。

1.2荧光显微观察

(1)将制作好的涂片放置于显微镜载物台上，用压片夹压住，此时样品正对通光孔。

(2)从低倍镜(10×)开始观察，调焦，转动粗准焦螺旋，使载物台缓慢上升，直至物镜接近涂片，此时眼睛看着物镜以免物镜撞到涂片。然后双眼注视目镜，反向转动粗准焦螺旋，使载物台下降，直至观测到物像，再转动细准焦螺旋轻微调整，使看到的物像更加清晰。

(3)找到对应的观测点后，将低倍物镜转换为高倍物镜(40×)，再轻微转动细准焦螺旋，便可以看到清晰的物象。

(4)将显微镜转换到荧光观测模式，选择对应的激发光，进行荧光观测。

1.3微流控芯片观测

1.3.1菌液的培养与浓缩

(1)取复苏后的30μl菌液加至3ml含有对应抗生素的lb培养液中，置于恒温摇床，37℃培养3-4小时，以达到对数期中期。

(2)取1.5ml的离心管，加入1.5ml菌液，2000r/min离心5min，去除上清液，只留下残余的少许培养液，再在涡旋仪上涡旋混匀细菌沉淀，形成均一的浓稠菌液。

1.3.2上样

(1)准备三根适当长度的毛细管，并将其与微流控芯片等材料放置于超净台中，紫外灭菌20min。

(2)将微流控芯片置于真空罩中抽真空，需要10min左右。

(3)在超净台中，用10μl移液枪吸取部分浓缩菌液后，将枪头插入芯片的入液口，从入液口开始注入菌液。

(4)选取对应规格的注射器针头，将毛细管套于针头，两者紧密相连。用注射器吸取含有对应抗生素的培养液，将注射器和针头连接，按压活塞柄，使培养液充满整个毛细管，再将毛细管的另一端插入到芯片的入液口处。同时，将另外两根毛细管插到芯片的出液口处。

1.3.3上镜观测

将微流控芯片固定于载物台，注射器固定于注射泵，便开始注射、观测。注意观察前先按压活塞柄，使培养液快速通过，以冲洗芯片通道，避免细菌在通道中大量生长，导致堵塞。

实施例4虚拟振荡器调控光控基因振荡器实现稳健振荡

本发明根据群体同步基因振荡器的数学模型(如图1b所示)，编写了群体同步基因振荡器模拟程序(即，虚拟振荡器)。虚拟振荡器的振荡周期和振幅值分别为50min和201，振荡周期和振幅都比较稳健，其振荡模式如图1c所示。虚拟振荡器能够根据其基因振荡器的振荡观测值控制显微镜的照射光光源，从而影响aiia基因的表达。当虚拟振荡值小于100时，显微镜发出的光照强度呈线性变化；当振荡值超过100时，显微镜则以100％的最大强度进行照射(如图1a所示)。这一调控机制使我们施加的光照强度呈现稳定的振荡变化，从而使基因振荡器中aiia这一元件的表达呈现稳定模式，最终使整个基因振荡器的振荡行为更加稳健。

在计算机中，虚拟振荡器为一个独立运行的程序，可将虚拟振荡的振幅值写入一个文件，以供其他程序读取。观测、拍摄过程中，通过在显微镜软件中编写程序，读取虚拟振荡值，使显微镜光源发出对应强度的照射光，并按照15min的间隔进行荧光拍摄。

通过以上虚拟振荡器的调控，光控基因振荡器的振荡结果如下：

1.蓝光光控稳健振荡系统

对微流控芯片中的蓝光光控基因振荡器进行持续显微观测，记录mtagbfp2荧光蛋白的荧光亮度变化。如图2a所示，当不施加调控时，蓝光光控基因振荡器的振荡现象不够稳定，振荡的周期和振幅变化较大(σ周期＝0.195，σ振幅＝0.048)；如图2b所示，施加虚拟振荡调控后，振荡器的稳健性大大增加，周期和振幅逐渐变得比较稳定(σ周期＝0.083，σ振幅＝0.038)。刚进行蓝光调控时，各振荡的振幅变化比较大，可能是由于调控的滞后性导致报告蛋白的合成量出现了较大的波动。综上所述，在蓝光光控稳健振荡系统中，虚拟振荡器对蓝光光控基因振荡器的调控作用是有效的。(注：标准差σ＝sqrt(((x1-x)2+(x2-x)2+......(xn-x)2)/n)，其中，x1、x2......xn为各数据值，x为数据平均值，n为数据量。)

2.红光光控稳健振荡系统

对微流控芯片的同一小室进行持续显微观测，如图3a所示，在不施加任何调控时，红光光控基因振荡器的振荡现象较不稳定，每个振荡的周期和振幅变化较大(σ周期＝0.291，σ振幅＝0.068)；如图3b所示，施加虚拟振荡器调控后，振荡器的稳健性大大增加，周期和振幅变得稳定(σ周期＝0.079，σ振幅＝0.013)。此结果表明，虚拟振荡器的调控作用增强了红光光控基因振荡器的稳健性。(注：标准差σ＝sqrt(((x1-x)²+(x2-x)²+......(xn-x)²)/n)，其中，x1、x2......xn为各数据值，x为数据平均值，n为数据量。)

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干替换、变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

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