本发明属于生物实验方法的设计技术领域，具体公开一种快速培养结核病致病菌的培养方法。
背景技术：
结核病是由结核分枝杆菌复合群细菌所引起的人畜共患的慢性消耗性传染病。要控制结核病的发生和流行，必须加强对该病的检测。结核分枝杆菌复合群细菌是结核病的致病菌，为抗酸的杆菌，主要通过呼吸道传播。及时、有效的诊断是控制结核病关键，其中其致病菌培养是实验室诊断的主要方法之一，但结核分枝杆菌复合群细菌属缓慢生长分枝杆菌，其自身分裂周期长、生长速度慢，且在样本处理过程中易受损伤，导致分离培养耗时长。当前，实验室的常用培养基有改良罗氏培养基(l-j培养基)和丙酮酸钠培养基，虽然这两种培养基已使用有百年的历史，但是这两种培养基培养时间长，已分离的纯培养物需25天以上，临床病料中的病原分离需要60天以上才可见到典型菌落，达不到快速诊断的目的。
近年来，用于培养结核病致病菌的新型改良培养基越来越多，在国内相关实验中，添加烟酸的新型改良罗氏培养基，添加维生素e及猪肺汤的改良培养基，以及在原有培养基成分中加入土豆、鸡蛋或平菇等营养物质的培养基均有出现。以上这些培养基和培养方法尽管缩短了结核致病菌的培养时间，仍需要20天以上，且所需药品或培养基成分要求高，受设施和条件限制，不利于广泛使用。
技术实现要素：
本发明的目的在于：设计一种能快速分离结核病致病菌的培养方法，在结核病致病菌损伤修复培养基(drm培养基)中进行预培养后，可提高细菌增殖率，并降低了在生长过程中的高营养需求，从而加速了结核病致病菌的生长，缩短了培养时间。
本发明的技术方案：一种快速培养结核病致病菌的培养方法，该培养方法包括下述步骤：
一、培养基的制备与保存
(一)0.3％琼脂高糖drm培养基的制备
(1)将l-天冬酰胺1g，磷酸二氢钾1.5g，磷酸氢二钠2.5g，七水硫酸镁0.5g，二水柠檬酸纳1.3g，柠檬酸铁胺0.05g，丙酮酸钠2.4g，琼脂粉3g，水1000ml溶解后，在115-121℃，高压条件下，20min，制备成0.3％琼脂快速培养基，备用；
(2)称取100g白糖，加入50ml水，在45-50℃充分溶解，110-115℃，高压10-15min灭菌后制备成200％高糖液，备用；
(3)无菌条件下，在加高压除菌后处于60-80℃的143ml的200％高糖液加到同等条件下1000ml0.3％琼脂快速培养基中，充分混匀，制备成0.3％琼脂高糖drm培养基分装，18mm×150mm试管，每管7ml，4℃保存备用；
(二)lowenstein-jensen培养基的制备
(1)将天门冬素3.6g，磷酸二氢钾2.4g，七水硫酸镁0.24g，柠檬酸镁0.6g，丙三醇12ml，蒸馏水600ml，充分溶解后备用；
(2)向步骤(1)中加入可溶性淀粉30g，混匀，煮沸35-45min，成透明糊状溶液，冷却后备用；
(3)向步骤(2)中加入经过滤后的新鲜鸡卵液1000ml，混匀，备用；
(4)最后，向步骤(3)中加入2％孔雀绿水溶液20ml，混匀，分装，18mm×150mm试管，每管7ml，放置斜面高度占试管三分之二，在温度条件85℃，45min间歇灭菌两次，37℃无菌测定24h后，4℃贮存备用；
(三)丙酮酸钠培养基的制备
(1)先将天门冬素3.6g，磷酸二氢钾2.4g，七水硫酸镁0.24g，柠檬酸镁0.6g，丙酮酸钠1.6g，蒸馏水600ml，充分溶解后，用4％naoh校正至ph7.2后，加入葡萄糖4.0g混匀备用；
(2)向步骤(1)中加入可溶性淀粉30g，混匀，煮沸35-45min成透明糊状溶液，冷却后备用；
(3)向步骤(2)中加入经过滤后的新鲜鸡卵液1000ml，混匀，备用；
(4)最后，向步骤(3)中加入2％孔雀绿水溶液20ml，混匀，分装，18mm×150mm试管，每管7ml，放置斜面高度占试管三分之二，在温度条件85℃，45min间歇灭菌两次，37℃无菌测定24h后，4℃贮存备用；
二、样本处理
(一)组织样本处理
(1)研磨组织：将采集到的肺脏、淋巴病变组织，用剪刀剪成小块，然后加入生理盐水，用研磨棒研磨，制成乳剂；
(2)碱处理：取2ml～4ml乳剂液，加人等量的4％naoh溶液，充分振摇5～10min；
(3)酸平衡：碱处理10min后，用2mol/l的hcl调ph值至6.5-7.0，在10min之内完成；
(4)离心：酸碱处理后的菌液，离心20min，4000rpm，弃上清，沉淀加入生理盐水，充分混匀；
(二)鼻拭子样品的处理
(1)将含鼻拭子样品的生理盐水用4000rpm离心20min，收集沉淀，加入适量的生理盐水；
(2)碱处理：同步加入等量4％naoh和2.94％枸橼酸钠溶液中，其中枸橼酸钠溶液中含1％n-乙酰-l半胱胺酸，室温静置20分钟，使粘液液化至清亮；
(3)酸平衡：碱处理20min后，用2mol/l的hcl调ph值至6.5-7.0，在10min之内完成；(4)离心：酸碱处理后的菌液，离心20min，4000rpm，弃上清，沉淀加入生理盐水，充分混匀；
(三)结核病致病原快速培养：酸、碱处理后的菌液，用无菌的一次性滴管取0.2ml菌液垂直穿刺至含0.3％琼脂高糖drm培养基，置37℃恒温培养箱中预培养3天；3天后用无菌的一次性滴管取0.2ml菌液转接至丙酮酸钠培养基和/或l-j培养基斜面，置37℃恒温培养箱中培养，从第三天开始进行观察培养基中细菌的生长情况并做记录。
优化设计，所述新鲜鸡卵液的制备过程为：先将新鲜鸡蛋清洗干净，晾干，再浸泡在75％酒精中10-15min；再挑拣消毒后的无裂缝鸡蛋取鸡卵。
优化设计，所述的可溶性淀粉为马铃薯淀粉。
本发明的有益效果：该drm培养基具有使抗酸染色阳性菌培养时间较短，生长速度较快且能快速形成典型菌落等特点，检测效果好及成本低。结核杆菌培养前在drm培养基中进行预培养能够缩短培养基时间，对结核病的科研研究和早期诊断有一定的意义。同时使用该培养基和培养方法可快速进行结核与非结核分支杆菌培养、鉴定；获得的纯菌落可进行多种药物敏感实验，并可长期保存结核与非结核分支杆菌。该培养基和培养方法培养结果容易观察，应用范围广泛。
具体实施方式
实施例1、快速培养结核病致病菌的培养方法
一、试剂及制备
样品处理溶液的制备：(1)生理盐水：氯化钠0.85g，加蒸馏水至100ml，15磅高压20min，4℃保存备用；(2)4％naoh；(3)2.94％枸橼酸钠；(4)1％n-乙酰基-l-半胱氨酸
1、0.1％琼脂drm培养基：(1)培养基组成：l-天冬酰胺1g，磷酸二氢钾1.5g，磷酸氢二钠2.5g，七水硫酸镁0.5g，二水柠檬酸纳1.3g，柠檬酸铁胺0.05g，丙酮酸钠2.4g，琼脂粉1g，水1000ml；(2)制备和保存：上述成分溶解后充分混匀，115-121℃，高压20min，分装，18mm×150mm试管，每管7ml，置4℃保存备用。
2、0.3％琼脂高糖drm培养基
(1)培养基组分：l-天冬酰胺1g，磷酸二氢钾1.5g，磷酸氢二钠2.5g，七水硫酸镁0.5g，二水柠檬酸纳1.3g，柠檬酸铁胺0.05g，丙酮酸钠2.4g，琼脂粉3g，水1000ml。上述成分溶解后充分混匀，115-121℃，高压20min备用。(2)200％高糖的制备：称取100g白糖，加入50ml的水，在45-50℃水中充分溶解。再置110-115℃高压10-15min灭菌。(3)制备和保存：无菌条件下，加高压除菌后处于60-80℃的143ml的200％高糖到同等条件下1000ml0.3％琼脂快速培养基中，充分混匀，分装，18mm×150mm试管，每管7ml，待凝固后置4℃保存备用。
3、lowenstein-jensen培养基的制备
(1)培养基组分：天门冬素3.6g，磷酸二氢钾2.4g，七水硫酸镁0.24g，柠檬酸镁0.6g，丙三醇12ml，蒸馏水600ml，可溶性淀粉(马铃薯淀粉)30g，新鲜鸡卵液1000ml，2％孔雀绿水溶液20ml。(2)制备与保存：各盐类成份充分溶解后，加入马铃薯淀粉，混匀，沸水浴煮沸35-45min至淀粉成透明糊状。待冷却后加入经消毒纱布过滤的新鲜鸡卵液，混匀；最后加入2％孔雀绿水溶液，混匀，分装，18mm×150mm试管，每管7ml，放置斜面高度占试管2/3。85℃，45min间歇灭菌两次。37℃无菌测定24h后贮存4℃冰箱备用。(3)注意事项a.配试剂用的灭菌水要预先加热。b.鸡蛋清洗干净，先晾干，再浸泡在75％酒精中约10-15min。c.挑拣消毒后的无裂缝鸡蛋取鸡卵，鸡蛋要一个一个的先在无菌的50ml的烧杯中磕破，检查蛋黄和蛋清的新鲜状况，以免有不新鲜的鸡卵液污染，影响培养基的营养成份。
4、丙酮酸钠培养基的制备(1)培养基组分：天门冬素3.6g，磷酸二氢钾2.4g，七水硫酸镁0.24g，柠檬酸镁0.6g，丙酮酸钠1.6g，蒸馏水600ml，调ph值至7.2，葡萄糖4.0g，可溶性淀粉30g，新鲜鸡卵液1000ml，2％孔雀绿水溶液20ml。(2)制备与保存：各盐类成份充分溶解后，用4％naoh校正至ph7.2后，加入葡萄糖混匀。再加入可溶性淀粉，混匀，沸水浴煮沸(约40min)至淀粉成透明糊状。以下步骤同“lowenstein-jensen培养基的制备”中的“(2)制备与保存”。(3)注意事项同“lowenstein-jensen培养基的制备”中的“(3)注意事项”。
二、样本处理
1、组织样本处理
(1)研磨组织：将采集到的肺脏、淋巴病变组织，用剪刀剪成小块，然后加入少量生理盐水，用研磨棒研磨，制成乳剂。(2)碱处理：取2ml～4ml乳剂液，加人等量的4％naoh溶液，充分振摇5min～10min，或摇至发生液化为止。(3)酸平衡：碱处理10min后，用2mol/l的hcl调ph值至6.5-7.0，在10min之内完成。(4)离心：酸碱处理后的菌液，离心20min，4000rpm。弃上清，沉淀加入适量的生理盐水，充分混匀。
2、鼻拭子样品的处理
(1)将含鼻拭子样品的生理盐水用4000rpm离心20min，收集沉淀，加入适量的生理盐水。
(2)碱处理：同步加入等量4％naoh和2.94％枸橼酸钠中(含1％n-乙酰-l半胱胺酸)，室温静置20分钟，使粘液液化至清亮。(3)酸平衡：碱处理20min后，用2mol/l的hcl调ph值至6.5-7.0，在10min之内完成。(4)离心：酸碱处理后的菌液，离心20min，4000rpm。弃上清，沉淀加入适量的生理盐水，充分混匀。
三、结核病致病原快速培养
酸、碱处理后的菌液，用无菌的一次性滴管取0.2ml菌液垂直穿刺至含0.3％琼脂高糖drm培养基，置37℃恒温培养箱中预培养3天，3天后用无菌的一次性滴管取0.2ml菌液分别转接至丙酮酸钠培养基和l-j培养基斜面，置37℃恒温培养箱中培养，从第三天开始进行观察培养基中细菌的生长情况并做记录。
实施例2、牛结核分枝杆菌参考菌株培养方法比较
1.材料方法
1.1菌株：牛结核分枝杆菌参考菌株。
1.2预处理：将单个牛结核分枝杆菌参考菌株菌落稀释到1ml生理盐水中，再混入30ml痰液中，充分混匀，使用鼻拭子蘸取后放入10ml生理盐水中，按照以下进行步骤处理：
(1)将含鼻拭子样品的生理盐水用4000rpm离心20min，收集沉淀，加入适量的生理盐水；
(2)碱处理：同步加入等量4％naoh和2.94％枸橼酸钠中(含1％n-乙酰-l半胱胺酸)，室温静置20分钟，使粘液液化至清亮；
(3)酸平衡：碱处理20min后，用2mol/l的hcl调ph值至6.5-7.0，在10min之内完成；
(4)离心：酸碱处理后的菌液，离心20min，4000rpm。弃上清，沉淀加入适量的生理盐水，充分混匀。
2、培养
按照实施例1中的“结核病致病原快速培养方法”进行，对照组将处理的样本直接接种到丙酮酸钠培养基或l-j培养基。
3、结果：直接接种于丙酮酸钠和l-j培养基中，在丙酮酸钠培养基上出现可见菌落需要13d，26d后长出典型的菌落；在l-j培养基上出现可见菌落需要15d，31d后长出典型的菌落(表1)。
牛型结核分枝杆菌参考菌株按照上述处理后，使用三步法培养，预培养后接种于丙酮酸钠培养基，样本处理后初次接种至出现可见菌落平均需要9天，第18天出现典型菌落；预培养后接种于l-j培养基，样本处理后初次接种至出现可见菌落平均需要9天，第18天出现典型菌落(表1)。
表1：牛结核分枝杆菌参考菌株用直接法和间接法培养比较结果
实施例3、六份牛结核病病理组织样本的培养比较
1.材料方法
1.1菌株：从屠宰场采集的六份牛结核病肺脏病理组织样本。
1.2预处理：按照实施例1中的组织样本处理方式进行组织样本的处理，具体如下：
(1)研磨组织：将采集到的肺脏剪刀剪成小块，然后加入少量生理盐水，用研磨棒研磨，制成乳剂。(2)碱处理：取2ml～4ml乳剂液，加人等量的4％naoh溶液，充分振摇5min～10min，或摇至发生液化为止。(3)酸平衡：碱处理10min后，用2mol/l的hcl调ph值至6.5-7.0，在10min之内完成。(4)离心：酸碱处理后的菌液，离心20min，4000rpm。弃上清，沉淀加入适量的生理盐水，充分混匀。
2、培养
按照实施例1中的“结核病致病原快速培养方法”进行，对照组将处理的样本直接接种到丙酮酸钠培养基或l-j培养基。
3、结果：酸、碱处理后的菌液直接接种在丙酮酸钠培养基和l-j培养基上，其中，接种于丙酮酸钠培养基中，平均在第64天出现可见菌落，继续培养平均在第86天出现典型菌落；接种于l-j培养基的细菌平均第66天出现可见菌落，继续培养平均在第87天出现典型菌落(表2)。
使用结核病致病原快速培养方法，预培养后接种于丙酮酸钠培养基，样本处理后初次接种至出现可见菌落平均需要19天，第31天出现典型菌落；预培养后接种于l-j培养基，样本处理后初次接种至出现可见菌落平均需要24天，第35天出现典型菌落(表2)。
表2结核分枝杆菌病理组织经不同方法培养结果的比较