RalstoniapickettiiM1菌株及其在降解菲和联苯中的应用的制作方法

本发明涉及微生物技术领域，具体涉及皮氏罗尔斯顿菌(ralstoniapickettii)m1菌株及其在降解菲和/或联苯中的应用。

背景技术：

随着现代工业过程的快速发展，工业废水污染日益严重。工业废水中存有各种持久性有机污染物(pops)，如多环芳烃(pahs)和多氯联苯(pcbs)。pahs在环境中普遍存在且不断积累，受到人们的广泛关注。由于工矿业、农业等人为活动以及土壤环境背景值高等因素已经造成了环境中pahs的严重污染及严重超标，并且化工类园区及周边土壤、采油区、采矿区、污水灌溉区的主要污染物都是由pahs造成的。菲是一种三环芳烃，它与pahs的致癌性有着非常密切的关系，凭借其独特的化学结构，菲成为pahs研究的模式化合物。联苯的卤代衍生物尤其是多氯联苯作为工业原料主要组分在国内外广泛生产，在早期氯代联苯的应用过程中，有大量的氯代联苯泄漏到环境中，造成环境的长期污染。由于这两类物质具有潜在的致癌、致畸、致突变性及生物累积性等特性，能够对生态环境和人类健康构成重大危害。

环境中有毒有害有机污染物的自然衰减主要依赖相关微生物代谢作用，生物修复技术具有成本低、效果好、无二次污染等优点，因此该方法是目前菲、联苯污染修复最具潜力的修复手段。目前，已报道的菲、联苯降解菌株较少，主要包括paenibacillus,burkholderia和pseudomonas等。由于环境中的大部分微生物都是不可培养的，很多微生物尤其是具有特定功能的微生物都不能通过纯培养的方式分离获得。因此，筛选出能有效降解高浓度菲、联苯的菌株具有重要的应用价值和现实意义。

技术实现要素：

本发明的目的是提供皮氏罗尔斯顿菌(ralstoniapickettii)m1菌株及其在降解菲和/或联苯中的应用。

本发明人从广东省清远某电子垃圾回收厂污水中驯化和分离得到一株以菲、联苯为碳源的降解菌株m1，根据菌株形态、生理特征、革兰氏反应、16srdna基因测序分析及系统发育分析，鉴定该菌株为ralstoniapickettiim1。ralstoniapickettiim1菌株生长的最佳环境条件为：温度为30℃，ph值为7，氯化钠含量为1％；该菌株的16srdna基因测序分析结果显示与m1最相近的菌株为r.pickettiiatcc27511(100％)。

因此，本发明提供了皮氏罗尔斯顿菌(ralstoniapickettii)m1菌株及其在降解菲和/或联苯中的应用。

本发明的第二个目的是提供一种降解菲和/或联苯的方法，是将皮氏罗尔斯顿菌m1菌株施放到含有菲和/或联苯的环境中，使皮氏罗尔斯顿菌m1菌株降解菲和/或联苯。

优选，所述的含有菲和/或联苯的环境是含有菲和/或联苯的土壤或水。

本发明的有益效果为：

ralstoniapickettiim1菌株能够利用菲和联苯作为碳源，在菲和联苯初始浓度分别为100mg·l^-1的无机盐培养液中培养3天后，降解率均可达到60％以上。因此，该ralstoniapickettiim1菌株在多环芳烃和多氯联苯的生物修复方面具有较好的应用潜力。

本发明的ralstoniapickettiim1于2019年5月9日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(gdmcc)，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省微生物研究所，保藏编号为：gdmccno:60663。

附图说明

图1为ralstoniapickettiim1菌株的生长形态及透射电子显微镜图。(a)为分别在以菲(上)和联苯(下)为碳源的无机盐固体培养基上生长的m1菌落；(b)为m1菌株透射电子显微镜图：无鞭毛，比例尺为0.5μm(上)和1μm(下)。

图2为ralstoniapickettiim1菌株和其相关菌的基于16srrna基因序列的系统发生关系，构建方法为邻接法，自展值设定重复1000次，图中仅展示了自展值大于50％的结果，比例尺0.01代表每个核苷酸的替换率。

图3为ralstoniapickettiim1菌株在不同条件下的生长情况。(a)ph；(b)温度；(c)耐盐度。

图4为ralstoniapickettiim1菌株在高浓度菲(phe)或联苯(bp)的无机盐培养基中生长曲线(菲、联苯的初始浓度100mg·l^-1)。

图5为ralstoniapickettiim1菌株在高浓度菲(phe)或联苯(bp)的无机盐培养基中的降解效率(菲、联苯的初始浓度100mg·l^-1)。

具体实施方式

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

实施例1皮氏罗尔斯顿菌(ralstoniapickettii)m1菌株的驯化、筛选和分离

1、样品来源

从广东清远某电子垃圾回收厂污水中采集污水样品，分别以高浓度菲和联苯为碳源进行长期驯化，通过多次筛选和分离纯化得到高效的菲、联苯降解菌。

2、培养基

(1)无机盐培养基：无机盐培养基用于样品中微生物的富集培养和纯菌条件下菲、联苯降解实验。该培养基配方见表1(含菲或联苯溶液)。

表1无机盐培养基配方

(2)营养培养基：营养培养基用于细菌的分离、纯化、保藏、活化等常规微生物的培养。本实验所用的液体营养培养基种类及成分见表2。

表2营养培养基(luria-bertani培养基)成分

若实验需要配制固体培养基，仅需在原有培养基配方的基础上增添1.5-2％的琼脂粉。若菌株的培养条件无特别说明，培养基ph均调节至7.2。

3、菌株的驯化、筛选和分离

将采集的污水加入到无机盐培养基中，分别以浓度为100mg·l^-1的菲(phe)和联苯(bp)作为降解的底物，放置于30℃培养箱中避光震荡培养。利用以菲或联苯为碳源的无机盐培养基进行菌株驯化，7d为一个驯化周期。取10％的接种量转接到具有相同培养体系的新鲜的以菲或联苯为碳源的无机盐培养基中并重复上述富集过程，如此重复三次。

将上述获得的第四代富集培养样品以稀释平板法进行涂布分离，样品用营养培养基分离。将涂布好的样品置于原培养温度条件下培养，经过48小时左右，培养基表面形成明显的单菌落，根据菌落的形态大小、颜色、透明度等特征挑取不相同的若干单菌落，并在营养培养基平板上进行划线纯化，培养。若经过划线纯化的平板上仍能观察到不同特征的单菌落，将其再次进行划线分离，直至在同一平板上只能观察到相同特征的单菌落为止。实验中筛选得到1株对菲和联苯均有高效降解性能的菌株m1。挑取纯化后的单菌落到相应液体营养培养基中培养至对数期，将菌液和无菌的甘油混合分装至无菌的2ml冻存管中(甘油浓度为15％)，放置于-80℃长期保存。

4、菌株鉴定

4.1菌株m1的形态特征

m1是一株从广东清远某电子垃圾回收厂污水中分离出的细菌，经活化以后，在30℃有氧的条件下该无机盐培养基制成的平板上生长48h后，能形成直径为1.0-2.5mm白色、圆形、表面光滑、微微向上凸起的、不透明、无芽孢、无鞭毛、革兰氏染色呈阴性、菌株个体为短杆状的菌落(图1a)。该菌为专性好氧菌，其细胞尺寸大概为0.3-0.6×0.8-1.4μm。其细胞的透射电子显微镜图见图1b。

4.2菌株m1的生理特征

本实验测试了许多m1菌株的生理特性，这些生理指标主要是测定菌株m1的碳源利用以及产酸等。碳源利用、产酸和其他试验均使用apiid32gn和api20ne微生物鉴定试剂盒测试(生物梅里埃公司)。生理特性均列在表3中。

表3菌株m1的生理特性

注：+，阳性；w，弱阳性；-，阴性。

4.3菌株m1的分子生物学特征

分子生物学特性鉴定主要包括测序及系统发育树的构建。在进行测序和构建系统发育树的之前，需先需要提取细菌的dna(实验使用的细菌基因组dna快速提取试剂盒来自北京艾德莱生物科技有限公司)。为了对细菌的分类学进行研究，通常需要扩增16srrna基因以及构建系统发育树，扩增的基因为原核生物中编码rrna所组成部分中的一段dna，因其具有高度的保守性、特异性和较合适的序列长度，通常被用于检测和鉴定细菌。

聚合酶链式反应(pcr)主要是用来扩增不同的基因片段，pcr需要不同的引物(27f和1492r)，pcr扩增反应的体系：10×buffer2.5μl，mg²⁺(25mmol/l)1.5μl，dntp(25mmol/l)0.3μl，正向引物(10mmol/l)0.5μl，反向引物(10mmol/l)0.5μl，taq酶：0.25μl，dna组模板0.1μl，去离子水19.35μl。pcr扩增反应条件：95℃条件下变性，55℃的条件下退火，72℃的条件下延伸，这个过程循环30次，72℃的条件下延伸10min，pcr反应结束后于4℃条件下保存。扩增所需基因后用0.75-1％的琼脂糖并加入核酸染色剂gelred配制成凝胶块，在凝胶块中加入pcr产物和包含各种长度片段的dna标记物(maker)并放置于电泳仪内，电泳仪内装入tbe(tris硼酸)缓冲液，使电泳仪在一定的电压下工作20min后取出，放置于300nm的紫外灯下进行观察以确定pcr产物扩增反应成功。然后将扩增成功的pcr产物送往华大基因科技有限公司测序，测序引物与扩增引物相同。

将测序所得的细菌16srrna进行比对，得到序列间的相似度信息。根据序列比对的结果分析即可选取相应的典型菌株作为本实验分离菌株的模式菌，同时还可以获得模式菌的16srrna基因序列，构建系统发育分析以证明模式菌与实验分离菌株具有差异，从而来鉴定分离的菌株。构建系统发育树利用mega5.05程序，通常采用邻接法、最小进化法和最大简约法构建进化树，其中最常用的为邻接法，自展值常设定为重复1000次计算。

通过pcr和基因测序所得到的一个长为1460bp16srrna基因序列(seqidno.1)。通过16srrna基因比对发现，该菌株与r.pickettiiatcc27511(jovl01000020)的基因相似度为100％。由以上结果可得出本发明所分离的菌株m1为r.pickettii这个种，由此将分离到的菌株m1命名为ralstoniapickettiim1，保藏编号为：gdmccno:60663。

利用菌株m1的16srrna基因序列和与其相似度较高的16srrna基因序列制作系统发育树，从而获得菌株m1的16srrna基因与其相似性较高的16srrna基因之间的同源性结果。采用邻位相接法构建的系统发育树见图2。

4.4菌株m1的生长条件

(1)生长温度的测定：配置菌株m1生长所需的液体营养培养基，配好后拿到灭菌锅进行灭菌。将活化好的菌株m1接入到培养基内(实验组)，用不接种细菌的培养基做为对照(对照组)，将培养基放入不同温度下培养18h，对照组和每个温度对应的实验组均有三个重复，每天都需观察细菌的生长情况，当遇到肉眼难以区分的结果时，用可见-紫外分光光度计测定培养基在波长λ＝600nm处的吸光值，最后得出菌株m1可生长温度和最适生长温度范围。测试温度如下：4℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃和55℃。结果如图3b所示，在液体营养培养基中，菌株m1能够在15-45℃的温度条件下生长，最适生长温度为该菌的富集温度30℃。

(2)生长ph的测定：配置菌株m1生长所需的液体营养培养基，用如下缓冲体系调节培养液的ph，ph4.0-5.0，0.1mol/l柠檬酸钠和0.1mol/l柠檬酸；ph6.0-8.0，0.1mol/lnaoh和0.1mol/lkh2po4；ph9.0-10.0，0.1mol/lnahco3和0.1mol/lna2co3；ph11.0，0.1mol/lnaoh和0.05mol/lna2hpo4。将菌株m1接入到液体营养培养基内，每个ph做三个重复，用不接种细菌的培养基作为对照，将液体营养培养基放入菌株m1生长最适温度(30℃)下培养7d，每天都需观察细菌的生长情况，当遇到肉眼难以区分的结果时，用可见-紫外分光光度计测定培养基在波长λ＝600nm处的吸光值，最后得出菌株m1可生长ph和最适生长ph范围。测试的ph如下：3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0。结果如图3a所示，菌株m1能够在5.0-9.0的ph条件下生长，最适生长ph为7.0。

(3)盐浓度耐受：配置菌株m1生长所需的液体营养培养基，调节培养基的盐浓度。将活化好的菌株m1接入到已灭菌的液体营养培养基内，每个盐浓度做三个重复，用不接菌的培养基作为对照，将液体营养培养基放置在菌株m1生长最适条件(30℃，ph为7.0)下培养7d，每天都需观察细菌的生长情况，当遇到肉眼难以区分的情况时，用可见-紫外分光光度计测定培养基在波长λ＝600nm处的吸光值，最后得出菌株m1所能耐受的盐浓度范围。测试盐浓度如下：0％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％。结果如图3c所示，菌株m1能够在盐浓度为0-4％的条件下生长，最适生长盐浓度为1％。

4.5在高浓度菲和联苯条件下菌株m1的生长及降解

根据以上实验结果，确定菌株m1的最佳生长条件为温度30℃，ph7.0，添加nacl为1％。菌株m1在高浓度菲和联苯中的生长及降解实验均在这个条件下进行。将处于对数生长期的菌株m1按10％的接种量分别接种于含有初始为100mg·l^-1的菲和联苯的无机盐培养基中，振荡培养，并做平行实验3次。其中，添加菌株m1的含菲处理组记为phe；添加菌株m1的含联苯处理组记为bp；未添加菌株m1但是分别添加菲和联苯的处理组(未添加菌株m1的对照组)分别记为control-phe和control-bp。

取上述培养液用于化学分析，具体步骤如下：

(1)样品预处理：将各培养样品加入二氯甲烷萃取，同时添加5μl浓度为200mg/l的回收率指示剂(对于菲处理样品，添加菲-d10；对于联苯，添加¹³c-联苯)，充分震荡后转入分液漏斗中静置。分层后收集有机相，把下层液体放回摇瓶再用等体积二氯甲烷重复萃取，合并萃取液，并将其转移至含有适量已活化铜片的平底烧瓶中进行旋转蒸发，浓缩至约2ml，加入少量正己烷(约5ml)，旋转蒸发至2ml，重复洗三次，将有机溶剂置换为正己烷。置换后的浓缩液用玻璃填充柱(直径约为9mm)净化。柱填料自下而上为3cm3％去活化中性氧化铝，3cm3％去活化硅胶和1cm的无水硫酸钠。用适量正己烷活化柱子，15ml正己烷/二氯甲烷(体积比为1:1)混合试剂淋洗填充柱，并用棕色试剂瓶收集洗脱液约15ml，氮吹使其浓缩至约0.5ml，最后转移至1.5ml细胞瓶中，冷冻保存。上机测定前加入5μl内标物六甲基苯，其浓度为200mg/l。

(2)仪器分析：采用安捷伦7890气相色谱仪-5975质谱仪联用测定各处理样品中菲和联苯的含量。使用的色谱柱为安捷伦db5-ms毛细管色谱柱(柱长30m，内径0.25mm，膜厚度0.25μm)。所得数据用安捷伦色谱工作站处理，菲和联苯定量用6点校正曲线和内标法进行。微生物细胞浓度的测定采用光电比浊法，以od来表示，即波长为600nm时紫外光透过所测定菌液样品的光密度值。

菌株m1的生长曲线如图4所示。由图4可知，菌株m1能够在高浓度菲或联苯的条件下生长。

根据gc-ms测定并分析得出菌株m1能够降解菲和联苯，并且在含有100mg/l浓度菲或联苯的无机盐培养液中培养3天后，降解率均可达到60％以上(图5)。说明菌株m1是一种既能降解菲又能降解联苯，且耐受这两种化合物能力很强的菌株，对pahs和pcbs适应性强。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110>中国科学院广州地球化学研究所

<120>ralstoniapickettiim1菌株及其在降解菲和联苯中的应用

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1460

<212>dna

<213>皮氏罗尔斯顿菌m1(ralstoniapickettiim1)

<400>1

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