一种基于低共熔溶剂制备Gemini型氨基酸的方法与流程

本发明涉及一种基于低共熔溶剂制备Gemini型氨基酸的方法，属于Gemini型脂氨基酸类合成领域。
背景技术：
：食品乳化剂在食品加工领域起到十分重要的作用，拥有极高的市场前景。作为绿色化学的十二项原则之一，利用可再生原料作为石油基原料的替代品始终是在当代加工工业中实现可持续和绿色化学的关键策略此外，出于健康方面的考虑，天然材料在食品工程和生物加工领域的应用受到广泛关注。在这种背景下，利用可再生，安全和天然原料制造食品乳化剂至关重要。脂氨基酸，也称为N-酰基氨基酸，是由天然可再生原料脂肪酸以及氨基酸通过酰化反应制得。与传统表面活性剂相比，脂氨基酸被认为是一种更加绿色环保且安全的表面活性剂。此外，很多研究表明，脂氨基酸类表面活性剂在生物降解以抑菌性方面也具有十分明显的优势。例如，Burstein等人认为一种N-酰基氨基酸其中，7种脂氨基酸由Shiva等人合成，并且在油酰丙氨酸中获得了与革兰氏阳性细菌与咪康唑相同的抗菌活性.12Wolf等人，即ElmiricAcids是具有治疗潜力的内源性信号分子。认为阳离子脂氨基酸可以通过静电相互作用与细菌膜结合，从而产生抗菌活性.作为新一代脂氨基酸，Gemini型脂氨基酸由两个亲水或两个疏水基团组成，可以认为是脂氨基酸的二聚体。Pérez等人认为Gemini型脂氨基酸的CMC值可以比单链表面活性剂低一个甚至几个数量级.Xiao等人合成了一系列新的基于L-赖氨酸的Gemini表面活性剂，与传统型脂氨基酸相比，在广谱的革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌中发现了更好的抗菌活性。尽管Gemini型脂氨基酸具有上述诸多优势，其仍没有被工业化应用，这是因为目前Gemini型脂氨基酸只能通过复杂的多步有机合成来制备。目前合成Gemini型脂氨基酸多采用肖顿-鲍曼反应来完成，该反应利用脂肪酰氯代替脂肪酸作为原料，虽一定程度提高了产物得率，但是仍存在极大的安全隐患以及环境问题。为了缓解Gemini型脂氨基酸生产过程中的污染以及安全性问题，酶法合成被逐渐重视。但是目前酶法合成仍存在一系列问题难以解决，主要集中于：很难找到一种溶剂在具有良好的底物溶解性的同时还能保持较高的酶活性。这些问题都导致，酶法合成Gemini型脂氨基酸产率较低。技术实现要素：为了克服上述现有技术的不足，本发明提供了一种低共熔溶剂的设计方法以及基于此低共熔溶剂/酶协同催化合成Gemini型脂氨基酸的高效制备方法。本发明所采用的技术方案包括：以脂肪酶、含有两个氨基的氨基酸为原料，酶作为催化剂，以疏水性天然低共熔溶剂为介质，一步法直接合成脂氨基酸，并采用简单、高效的水洗-甲醇重结晶法直接得到纯度较高的产物，本发明方法简便、绿色、安全、高效。本发明的第一个发明目的是提供一种制备Gemini型氨基酸的方法，所述方法是在低共熔溶剂中，以Amano脂肪酶M作为催化剂，氨基酸与脂肪酸反应制得Gemini型氨基酸；所述低共熔溶剂中的氢键供体包括油酸和/或亚油酸，氢键受体为氯化胆碱；所述氨基酸中氨基的数量不低于2。在本发明的一种实施方式中，所述氨基酸包括赖氨酸、胱氨酸、精氨酸。在本发明的一种实施方式中，所述脂肪酸为C2-C20脂肪酸。在本发明的一种实施方式中，所述脂肪酸包括月桂酸、棕榈酸。在本发明的一种实施方式中，所述低共熔溶剂优选氯化胆碱-油酸。在本发明的一种实施方式中，低共熔溶剂是由氢键供体和氢键受体在60-100℃条件下按照一定化学计量比，经过旋转蒸发获得。在本发明的一种实施方式中，低共熔溶剂中氢键供体与氢键受体的化学计量比为2:1～1:2。在本发明的一种实施方式中，所述反应的温度为40-80℃。在本发明的一种实施方式中，所述反应的温度优选60℃。在本发明的一种实施方式中，所述Amano脂肪酶M的添加量为每摩尔氨基酸添加50-100mg。在本发明的一种实施方式中，所述Amano脂肪酶M的添加量优选每摩尔氨基酸添加60-75mg。在本发明的一种实施方式中，所述Amano脂肪酶M来自毛霉(MJL)，CASNO：9001-62-1。在本发明的一种实施方式中，脂肪酸与氨基酸的摩尔比为2.5:1～1:1。本发明的一种实施例中，反应所得产物进过如下纯化过程：采用乙酸乙酯、水萃取，并利用甲醇重结晶，得到纯品。本发明的一种实施例中，每20mL反应体系利用50-100mL乙酸乙酯和250-500mL水进行萃取。本发明的第二个目的是将上述方法应用于食品乳化剂制备中。与现有技术相比，本发明的有益效果是：采用天然低共熔溶剂代替传统的有机溶剂作为反应介质，不仅仅解决了底物溶解性的问题，还极好的保持了较高的酶活性。此外，本发明首次报道了天然低共熔溶剂与酶之间存在协同催化效应，并在此基础上以较高的产物产率成功合成了Gemini型脂氨基酸类食品乳化剂(产率可达59.6％)，打破了国内Gemini型脂氨基酸合成的瓶颈。此外，本发明还设计对产物提纯过程的简化，采用了乙酸乙酯、水提取，甲醇重结晶的方式获得了纯度较高的产物。为了进一步降低生产成本，本发明还通过简单的处理对天然低共熔溶剂进行了回收循环利用，10次循环后还能够合成产率达到52.4％，保持初始效果的88.48％，具有优异的效果，极大的降低了生产成本。附图说明图1为Gemini型月桂酰赖氨酸(GLL)的质谱图；图2为单链型月桂酰甘氨酸质(LAA)的谱图图；图3为低共熔溶剂的循环使用效率。具体实施方式本发明的主要思路在于：为Gemini型脂氨基酸的酶法合成提供了新的思路，即采用了一系列与酶存在协同催化效应的绿色溶剂作为反应介质。本发明首先考察了传统有机溶剂中Gemini型脂氨基酸的合成，其次考察了自行设计的天然低共熔溶剂中脂氨基酸的合成，该过程包括：酶的筛选，溶剂的筛选，反应条件优化，溶剂的回收利用，产物的提纯方案。下面结合具体的实施例对本发明做进一步详细的说明。Gemini型脂氨基酸的产率＝Gemini型脂氨基酸的实际值/Gemini型脂氨基酸的的理论值；电导率法测定cmc值：利用离子型表面活性剂水溶液的电导率随浓度的变化关系，作Λm-C1/2曲线，由曲线的转折点求出CMC值。∧m＝K/CΛm(S·m2/mol)，C(mol/L)，若温度恒定，在极稀的浓度范围内，强电解质溶液的摩尔电导率Λm与其溶液浓度的c1/2成线形关系，对于胶体电解质，在稀溶液时的电导率，摩尔电导率的变化规律与强电解质一样，但是随着溶液中胶团的生成，电导率和摩尔电导率发生明显变化，这就是确定CMC的依据。实施例1取2.5mmol月桂酸、1mmolL-赖氨酸和60mgAmano脂肪酶M加入到20mL氯化胆碱-油酸(1：2)中，500rpm，60℃下进行72小时。反应后的混合物中加入200mL超纯水，并涡旋震荡1分钟；将稀释的反应溶液以10000rpm离心20分钟，保留沉淀物，同时收集水相用于溶剂回收；用25mL乙酸乙酯稀释沉淀物，用20ml饱和碳酸氢钠溶液中和脂肪酸。将混合物以10000rpm离心20分钟，在313K下真空干燥24小时；将干燥的产物加入到5mL甲醇中，涡旋1分钟，并以10000rpm离心20分钟，体系分层，去除上层(甲醇和单链型脂氨基酸)，得到Gemini型脂氨基酸产品。产品纯度为98％的纯产物，产率为59.6％。现有报道有利用低共熔溶剂(氯化胆碱-甘油)配合CALB脂肪酶合成N,N-二月桂酰赖氨酸，产率相为26.3％，不到本实施例效果一半。通过图1中的质谱可以看出，本实施例制备得到了一种由两个亲水或两个疏水基团组成的Gemini型月桂酰甘氨酸，即脂氨基酸的二聚体。采用电导率法测定了几种产物的cmc值，Gemini型月桂酰氨基酸的cmc为0.0044mol/Lmol/L，显著低于目前市面常用表面活性剂吐温十二烷基磺酸钠(0.009mol/L)，是一种性能较好的表面活性剂。实施例2不同低共熔溶剂对Gemini型脂氨基酸制备的影响参照实施例1，将溶剂分别替换为表1中所示的溶剂，其他条件不变，反应制备Gemini型脂氨基酸。所得结果如表1所示。表1不同低共熔溶剂制备Gemini型脂氨基酸的结果溶剂Gemini型脂氨基酸产率(％)氯化胆碱-亚油酸29.3甜菜碱-油酸22.1氯化胆碱-甘油18.6DMSONR丙酮NR[C4mim]ClNR其中，N.R.表示没有产物得到。实施例3不同酶对Gemini型脂氨基酸制备的影响参照实施例1，将酶催化剂分别替换为表2中所示的酶，其他条件不变，反应制备Gemini型脂氨基酸。所得结果如表2所示。表2不同低共熔溶剂制备Gemini型脂氨基酸的结果其中，DA为来自大肠杆菌的D-氨基酰化酶；PPL为来自猪胰腺的脂肪酶；CALB为南极假丝酵母(CandidaAntarctica)的脂肪酶B；BSAP为来自枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)的碱性蛋白酶。实施例4：反应条件参数的优化参照实施例1，采用单因素试验法，分别对底物摩尔比、反应时间、反应温度、酶添加量等指标进行优化。具体生成Gemini型脂氨基酸的结果如表3所示。表3反应条件参数的优化结果结果显示，反应过程中，酶添加量和反应温度是两种最为关键的影响因素。在60℃下，60mg酶添加量配合体系得到较好的反应效果。实施例5：考察反应后低共熔溶剂的回收效率采用在反应后处理过程中收集的水相来回收天然低共熔溶剂：向混合物中加入10质量当量的乙酸乙酯，涡旋1分钟，然后转移到分液漏斗中；弃去有机相，同时收集水相；通过在333K下真空干燥48小时除去过量的水和乙酸乙酯，回收得到低共熔溶剂。回收后的低共熔溶剂用于月桂酰赖氨酸的合成，以检验其性能，具体反应条件参照实施例1，溶剂经过10次循环，Gemini型脂氨基酸的合成得率由59.6％降低到52.4％，还能够保持初始效果的88.48％。上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点。其目的在于让熟悉此项技术的人能够了解本发明的内容并据此加以实施。并不能以此限制本发明的保护范围，凡根据本发明精神实质所做的等效变化或修饰，都应该涵盖在本发明的保护范围之内。当前第1页1 2 3