一种早期日本血吸虫病检测试剂盒及其检测方法与流程

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种早期日本血吸虫病检测试剂盒及其检测方法。

背景技术：

血吸虫病是由裂体吸虫属血吸虫引起的一种慢性寄生虫病，主要流行于亚、非、拉美的73个国家，患病人数约2亿，是热带和发展中国家的主要健康和经济负担。日本血吸虫病临床表现为肉芽肿形成，门静脉纤维化，门静脉高压，肝脾肿大，腹水和肝细胞癌。

得益于长期的、广泛的、综合性的控制举措，我国血吸虫病的一般流行病学状况已经有了显著改观，一些流行地区接近传播阻断标准，因此，当下迫切需要更高效的诊断方法来监测、评估血防工作，以确保最终消除血吸虫病。目前，有四种主要的血吸虫病诊断方法：寄生虫学检测(主要是kato-katz法)，基于抗体检测，血吸虫特异性抗原检测，分子生物学检测(pcr检测循环血中血吸虫dna)。前三种方法的缺点在于它们灵敏度低(如kato-katz法)，与其他蠕虫感染的交叉反应性，或不能区分急性感染和既往感染(如抗原法、抗体法)。而粪便检测法或血吸虫可溶性性抗原特异性血清抗体检测都是以形成血吸虫卵为前提的，这限制了这些方法在血吸虫病早期诊断中的应用。以上种种现状表明，目前监测血吸虫病进展控制的局限性，特别是在血吸虫病流行率低或传播水平低的地区。

微小rna(microrna)是一类长度约为22个核苷酸的小型非编码rna，可在多种体液中检测到，包括血浆/血清。microrna在体液中的具有高稳定性，主要归因于两种机制：一方面是其与argonaute蛋白或高密度脂蛋白形成稳定的蛋白-mirna复合物；另一方面，它们常存在于外泌体中。mirna近年来越来越多地被认为是下一代诊断生物标志物的潜在靶标，因为已证实各种疾病的状态/进展与microrna的失调特征之间的强相关性。检测循环microrna作为各种癌症，病毒感染以及药物诱导的肝损伤的生物标志物的潜力已被广泛报道。最新的研究证实，血吸虫来源的microrna：“sja-mir-277”可做为日本血吸虫病的早期诊断标志物。

环介导等温扩增(lamp)是一种高效的等温核酸放大技术，最初由日本的notomi课题组在2000年提出。该方法在等温(60-65℃)条件下，利用具有链置换活性的dna聚合酶，短时间内完成对目标序列的扩增，具有特异性强、简单、快速等特点，被广泛应用于众多病原生物的检测。lamp主要分为两个步骤，扩增的起始步骤与循环扩增步骤。在lamp反应的起始阶段，内引物和外引物均参与其中，产生双哑铃结构dna，用于引发循环扩增反应。当反应进入循环扩增阶段，只有内引物参与反应。内引物和外引物的序列不同，分别对应目标dna的正义链和反义链，在扩增反应过程中，二者交替作为引物进行dna合成，产生大量长度不一的茎-环结构dna产物，产物可以通过肉眼观测鉴别，是核酸分子快速检测的优良平台。

现有技术中以循环血中游离的日本血吸虫特异性microrna引发扩增反应，实现快速、准确诊断早期日本血吸虫病均没有任何记载。

技术实现要素：

本发的明目的是提供一种操作简单、灵敏度高的早期日本血吸虫病检测试剂盒及其检测方法。

本发明所采用的技术方案是：

一种早期日本血吸虫病检测试剂盒，所述试剂盒包括dna模板、bip引物以及fip引物，

所述dna模板的核苷酸序列为：

5’-cgtcgtgact(f1c)-tttt-gagcactccttcggttcctg(f2)-tttt-agtcacgacg(f1)-aagcttgcttgccagagggt-agaggttcgg(b1c)-tttt-ccgctcacacatccacacac(b2c)-tttt-ccgaacctct(b1)-cgggccagaaaatgcattta(m)-3’(seqidno:1)；

所述bip引物的核苷酸序列为：

5’-agaggttcgg(b1c)-aaaa-gtgtgtggatgtgtgagcgg(b2)-3’(seqidno:2)；

所述fip引物的核苷酸序列为：

5’-cgtcgtgact(f1c)-tttt-gagcactccttcggttcctg(f2)-3’(seqidno:3)。

进一步地，所述试剂盒还包括pcr试剂，所述的pcr试剂为：10-30mmol/ltris-hcl，50-150mmol/l氯化钾，50-200mmol/l硫酸铵，150-400mmol/l硫酸镁，0.1-0.5mmol/l脱氧核糖核苷三磷酸混合物，15-100u/μlrna酶抑制剂，5-15mmol/l甜菜碱，5-10u/μlbstdna聚合酶，15-35μmol/lfip引物、15-35μmol/lbip引物，5-20pmol/ldna模板。

更进一步地，所述的pcr试剂为：3.5μl反应缓冲液(20mmol/ltris-hcl，100mmol/l氯化钾，100mmol/l硫酸铵)，1μlfip和bip引物(各20μmol/l)，5μldna模板(10pmol/l)，2.5μl硫酸镁(100mmol/l)，10μl甜菜碱(5mol/l)，1μlrna酶抑制剂(40u/μl)，5μldntps(2.5mmol/l)和1μl待测样品，体系终体积是50μl。

优选地，所述的pcr试剂的扩增体积为10-100μl。

一种早期日本血吸虫病的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)提取待检测样品血清中总rna；(2)将步骤(1)中的总rna放入试剂盒中，与含有可视化混合染料的pcr试剂混合，进行等温扩增，扩增产物可肉眼观察颜色变化判断检测结果。

优选地，所述等温扩增的温度为45-60℃，等温扩增时间为5-35min。

更优选地，所述等温扩增的温度为55℃。

进一步地，所述步骤(1)中的总rna为微小rna。

本发明具有以下优点：

本发明以循环血中游离的日本血吸虫特异性microrna(sja-mir-277)为靶点标志物，以一条人工合成的双环哑铃型dna为模板，在模板dna的3′设计一段与待测microrna互补的序列，以mirna充当一条引物，引发扩增反应，一步反应实现高灵敏度、高特异性的等温扩增microrna，利用microrna得到早期日本血吸虫病检测试剂盒，该试剂盒和检测方法，可以实现快速、准确诊断早期日本血吸虫病。

说明书附图

图1为自然光下实施例1中的扩增产物照片；

图2为紫外灯下实施例1中的扩增产物照片。

具体实施方式

下面利用实施例对本发明做进一步说明:

一种早期日本血吸虫病检测试剂盒，所述试剂盒包括dna模板、bip引物以及fip引物，

所述dna模板的核苷酸序列为：

5’-cgtcgtgact(f1c)-tttt-gagcactccttcggttcctg(f2)-tttt-agtcacgacg(f1)-aagcttgcttgccagagggt-agaggttcgg(b1c)-tttt-ccgctcacacatccacacac(b2c)-tttt-ccgaacctct(b1)-cgggccagaaaatgcattta(m)-3’(seqidno:1)；

所述bip引物的核苷酸序列为：

5’-agaggttcgg(b1c)-aaaa-gtgtgtggatgtgtgagcgg(b2)-3’(seqidno:2)；

所述fip引物的核苷酸序列为：

5’-cgtcgtgact(f1c)-tttt-gagcactccttcggttcctg(f2)-3’(seqidno:3)。所述试剂盒还包括pcr试剂，所述的pcr试剂为：10-30mmol/ltris-hcl，50-150mmol/l氯化钾，50-200mmol/l硫酸铵，150-400mmol/l硫酸镁，0.1-0.5mmol/l脱氧核糖核苷三磷酸混合物，15-100u/μlrna酶抑制剂，5-15mmol/l甜菜碱，5-10u/μlbstdna聚合酶，15-35μmol/lfip引物、15-35μmol/lbip引物，5-20pmol/ldna模板。所述的pcr试剂最佳浓度为：3.5μl反应缓冲液(20mmol/ltris-hcl，100mmol/l氯化钾，100mmol/l硫酸铵)，1μlfip和bip引物(各20μmol/l)，5μldna模板(10pmol/l)，2.5μl硫酸镁(100mmol/l)，10μl甜菜碱(5mol/l)，1μlrna酶抑制剂(40u/μl)，5μldntps(2.5mmol/l)和1μl待测样品，体系终体积是50μl。所述的pcr试剂的扩增体积为10-100μl。

一种早期日本血吸虫病的检测方法，包括以下步骤：(1)提取待检测样品血清中总rna；(2)将步骤(1)中的总rna放入试剂盒中，与含有可视化混合染料的pcr试剂混合，进行等温扩增，扩增产物可肉眼观察颜色变化判断检测结果。等温扩增的温度为45-60℃，等温扩增时间为5-35min，所述等温扩增的最佳温度为55℃。步骤(1)中的总rna为微小rna。

实施例1

取日本大耳兔10只，经腹部皮肤感染日本血吸虫尾蚴(～200条)。感染前和感染后1-5周经耳缘静脉采血,共6次,每次3ml,肝素抗凝。抗凝血在4℃以4,000rpm离心10分钟，收集血浆。

抗凝血用mirneasyminikit试剂盒(qiagen)提取总rna。引物及dna模板委托上海生工生物工程有限公司合成。dna模板序列为：

5’-cgtcgtgactttttgagcactccttcggttcctgttttagtcacgacgaagcttgcttgccagagggt-agaggttcggttttccgctcacacatccacacactttt-ccgaacctctcgggccagaaaatgcattta-3’

bip引物序列为：5’-agaggttcggaaaagtgtgtggatgtgtgagcgg-3’

fip引物序列为：5’-cgtcgtgactttttgagcactccttcggttcctg-3’

在无菌无dna、rna酶的pcr管中配置如下反应体系：

3.5μl反应缓冲液(20mmol/ltris-hcl，100mmol/l氯化钾，100mmol/l硫酸铵)，1μlfip和bip引物(各20μmol/l)，5μldna模板(10pmol/l)，2.5μl硫酸镁(100mmol/l)，10μl甜菜碱(5mol/l)，1μlrna酶抑制剂(40u/μl)，5μldntps(2.5mmol/l)1μl钙黄绿素(1mol/l)和1μl待测样品，体系终体积是50μl。

将混合物混匀后99℃加热变性dna(10min)，然后冰上冷却。加入20ubstdna聚合酶，混匀后置55℃水浴箱中保温1h，80℃保温5min，中止反应。

反应产物肉眼观察颜色变化，图1为自然光下扩增产物照片，阳性扩增呈现荧光绿色，阴性呈现淡橘黄色；图2是紫外灯下扩增产物照片，阳性扩增呈现荧光，阴性无荧光。

本发明以循环血中游离的日本血吸虫特异性microrna(sja-mir-277)为靶点标志物，以一条人工合成的双环哑铃型dna为模板，在模板dna的3′设计一段与待测microrna互补的序列，以mirna充当一条引物，引发扩增反应，一步反应实现高灵敏度、高特异性的等温扩增microrna，利用microrna得到早期日本血吸虫病检测试剂盒，利用该试剂盒和检测方法，可以最终实现快速、准确诊断早期日本血吸虫病。

最后所应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

序列表

<110>江汉大学

<120>一种早期日本血吸虫病检测试剂盒及其检测方法

<160>3

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>136

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

cgtcgtgactttttgagcactccttcggttcctgttttagtcacgacgaagcttgcttgc60

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<210>2

<211>34

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

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<211>34

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<213>人工序列(artificialsequence)

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