本发明涉及
技术领域：
，尤其涉及一种灵芝孢子油萃取方法。
背景技术：
：灵芝孢子是灵芝发育成熟期弹射出来的种子，是灵芝的生殖细胞，生物学上称为担孢子。孢子被集中收集后称为孢子粉，孢子粉内含有脂类、维生素类、胡萝卜素类、三萜类、生物碱类、多糖类、甾醇类、蛋白质和氨基酸类等多种活性成分，由于灵芝孢子的内外双层壁是坚硬的几丁质，如果没有破壁，其内部成分就很难被提取出来，服用后也很难被人体吸收。目前，采用超临界CO2萃取灵芝孢子油的专利报道较多，超临界CO2萃取过程为：灵芝孢子粉→破壁→制粒→颗粒烘干→超临界CO2萃取→灵芝孢子油，为了解决灵芝孢子粉粉体太细，在高压条件下易造成喷料的问题，萃取之前必须采用制粒工序，但制粒及干燥中的高温加工会引起油脂氧化，降低灵芝孢子油的质量；同时超临界CO2萃取方法并非万能的，破壁、烘干、制粒、烘干的工序会使用多个容器，容易造成部分物料损失，且非常依赖破壁以及制粒工艺，因而如果能在超临界CO2萃取之前，简化其破壁、烘干、制粒等工序，将更加提高提取效率和提取质量。技术实现要素：本发明的目的是为了解决现有技术中存在的缺点，而提出的一种灵芝孢子油萃取方法。为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：一种灵芝孢子油萃取方法，包括以下步骤：S1，破壁：将灵芝孢子和锆珠按重量比为,1：2至1：4加入到超声球磨罐中，添加占灵芝孢子重量份为50%-200%的水，继续添加占水比重1%-1.5%的生物酶，加入巴比妥缓冲液，调整pH至6-9，保证总液面占球磨罐的1/4-1/2，开启球磨罐的超声，低频超声；同时开启球磨旋转轴，低速旋转，通过球磨罐的循环水控制球磨罐内温度为25-45℃，运行0.5-4h；S2，浸提：经过S1处理后，于超声球磨罐加入占灵芝孢子重量份为50%-200%的乙醇，再滴加浓度为5%-10%的碱醇溶液，调整pH至6-10，开启球磨罐的超声，高频超声，开启球磨旋转轴，高速旋转，控制球磨罐内温度为70-100℃，运行3-7h，得到悬浮液A；S3，过滤：取出悬浮液A后，用乙醇对超声球磨罐清洗3-5次，得到清洗液B；将清洗液B和悬浮液A混合，采用微孔筛板压滤，得滤液C和滤饼D；S4，分液萃取：取占滤液C重量比200%-500%的非极性有机溶剂，并加入滤液C，超声溶解，静置20-80min，分液，得下层的萃取液，45-60℃旋蒸得初制孢子油E；S5，超临界萃取：将滤饼D装到滤布袋中，滤布袋中填充浮球，将滤布袋封口放到超临界CO2萃取釜中，萃取釜中加入夹带剂，控制萃取压力为6-10MPa，温度为25-35℃，萃取时间为0.5-2h，得二次孢子油F；S6，高速离心：将初制孢子油E和二次孢子油F混合，经高速离心处理后，得成品的精制孢子油G。优选地，本发明所采用的超声球磨罐为特制的超声波行星式球磨机，其分为内胆和外壳，且内胆和外壳之间填充循环水，内胆外套接导电滑环，罐盖上设有进液口，进气口和出气口。优选地，锆珠具体为二氧化锆或稀土稳定的二氧化锆中的任一种，锆珠采用大，中，小三种球按1:1:1数量比混用，大锆珠尺寸为2.2-2.4um，中锆珠为1.4-1.6um，小锆珠为0.6-0.8um。优选地，S1中球磨机的低速旋转速度具体为150-200r/min，低频超声的频率具体为15-30Hz。优选地，S2中球磨机的高速旋转速度具体为300-500r/min，高频超声的频率具体为60-80Hz，碱醇溶液中的溶质为NaOH或KOH中的任一种。优选地，微孔筛板和滤布袋的孔径一致，其孔径范围具体为200-400目，浮球具体为食品级塑料材质的空心浮球。优选地，S4中的非极性有机溶剂具体为氯仿、正己烷中的任一种。优选地，S5中的夹带剂具体为乙醇、乙醇水溶液、正己烷中的任一种。优选地，S6中的高速离心转速不低于10000r/min。与现有技术相比，本发明的有益效果是：1.本发明的优势在于采用生物酶-超声-机械联用破壁法直接对灵芝孢子进行破壁，采用的破壁设备为特制的超声波行星式球磨机，其分为内胆和外壳，且内胆和外壳之间填充循环水，温度pH均可控，操作简便，破壁速度快，破壁效率高。2.本发明的破壁与浸提采用一锅法，加入乙醇和碱醇溶液，浸提的过程也实现生物酶灭活的功效，无需更换容器，物料几乎无损失，同时超声-球磨联用使破壁后的孢子粉能够充分被提取剂（乙醇）浸提，进一步提高提取率。3.本发明采用超声浸提-超临界提取的两步萃取法，对孢子原料进行两次提取，提取过程无需干燥、制粒等程序，节约成本且提高了提取率和产品质量。具体实施方式下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。实施例1：一种灵芝孢子油萃取方法，包括以下步骤：S1，破壁：取重量份的灵芝孢子10g、锆珠25g加入到超声球磨罐中，添加水10g、生物酶0.15g，加入巴比妥缓冲液，调整pH至6.5，总液面占球磨罐的1/2，开启超声20Hz，球磨转速为200r/min，控制球磨罐内温度为35℃，运行3h；S2，浸提：经过S1处理后，于超声球磨罐加入10g乙醇，再滴加浓度为8%的NaOH乙醇溶液，调整pH至10，开启超声70Hz，球磨转速为500r/min，，控制球磨罐内温度为100℃，运行7h，得到悬浮液A；S3，过滤：取出悬浮液A后，用乙醇对超声球磨罐清洗3-5次，得到清洗液B；将清洗液B和悬浮液A混合，采用微孔筛板压滤，得滤液C和滤饼D；S4，分液萃取：取占滤液C5倍重量的氯仿，并加入滤液C，超声溶解，静置20-80min，分液，得下层的萃取液，45-60℃旋蒸得初制孢子油E；S5，超临界萃取：将滤饼D装到滤布袋中，滤布袋中填充浮球，将滤布袋封口放到超临界CO2萃取釜中，萃取釜中加入夹带剂，控制萃取压力为10MPa，温度为30℃，萃取时间为2h，得二次孢子油F；S6，高速离心：将初制孢子油E和二次孢子油F混合，经高速离心处理后，得成品的精制孢子油G。实施例2：一种灵芝孢子油萃取方法，包括以下步骤：S1，破壁：取重量份的灵芝孢子10g、锆珠38g加入到超声球磨罐中，添加水15g、生物酶0.15g，加入巴比妥缓冲液，调整pH至7，总液面占球磨罐的2/5，开启超声25Hz，球磨转速为180r/min，控制球磨罐内温度为30℃，运行3h；S2，浸提：经过S1处理后，于超声球磨罐加入10g乙醇，再滴加浓度为5%的KOH乙醇溶液，调整pH至9，开启超声80Hz，球磨转速为400r/min，，控制球磨罐内温度为90℃，运行6h，得到悬浮液A；S3，过滤：取出悬浮液A后，用乙醇对超声球磨罐清洗3-5次，得到清洗液B；将清洗液B和悬浮液A混合，采用微孔筛板压滤，得滤液C和滤饼D；S4，分液萃取：取占滤液C5倍重量的正己烷，并加入滤液C，超声溶解，静置20-80min，分液，得下层的萃取液，45-60℃旋蒸得初制孢子油E；S5，超临界萃取：将滤饼D装到滤布袋中，滤布袋中填充浮球，将滤布袋封口放到超临界CO2萃取釜中，萃取釜中加入夹带剂，控制萃取压力为8MPa，温度为33℃，萃取时间为1.5h，得二次孢子油F；S6，高速离心：将初制孢子油E和二次孢子油F混合，经高速离心处理后，得成品的精制孢子油G。实施例3：S1，破壁：取重量份的灵芝孢子10g、锆珠32g加入到超声球磨罐中，添加水20g、生物酶0.15g，加入巴比妥缓冲液，调整pH至8.5，总液面占球磨罐的1/4，开启超声30Hz，球磨转速为150r/min，控制球磨罐内温度为45℃，运行1.5h；S2，浸提：经过S1处理后，于超声球磨罐加入15g乙醇，再滴加浓度为10%的KOH乙醇溶液，调整pH至8.6，开启超声65Hz，球磨转速为350r/min，，控制球磨罐内温度为85℃，运行4h，得到悬浮液A；S3，过滤：取出悬浮液A后，用乙醇对超声球磨罐清洗3-5次，得到清洗液B；将清洗液B和悬浮液A混合，采用微孔筛板压滤，得滤液C和滤饼D；S4，分液萃取：取占滤液C4倍重量的氯仿，并加入滤液C，超声溶解，静置20-80min，分液，得下层的萃取液，45-60℃旋蒸得初制孢子油E；S5，超临界萃取：将滤饼D装到滤布袋中，滤布袋中填充浮球，将滤布袋封口放到超临界CO2萃取釜中，萃取釜中加入夹带剂，控制萃取压力为8.5MPa，温度为35℃，萃取时间为1h，得二次孢子油F；S6，高速离心：将初制孢子油E和二次孢子油F混合，经高速离心处理后，得成品的精制孢子油G。对比例1：S1，破壁：取重量份的灵芝孢子10g、锆珠32g加入到超声球磨罐中，添加水20g，加入巴比妥缓冲液，调整pH至8.5，总液面占球磨罐的1/4，开启超声30Hz，球磨转速为150r/min，控制球磨罐内温度为45℃，运行1.5h；S2，浸提：经过S1处理后，于超声球磨罐加入15g乙醇，再滴加浓度为10%的KOH乙醇溶液，调整pH至8.6，开启超声65Hz，球磨转速为350r/min，，控制球磨罐内温度为85℃，运行4h，得到悬浮液A；S3，过滤：取出悬浮液A后，用乙醇对超声球磨罐清洗3-5次，得到清洗液B；将清洗液B和悬浮液A混合，采用微孔筛板压滤，得滤液C和滤饼D；S4，分液萃取：取占滤液C4倍重量的氯仿，并加入滤液C，超声溶解，静置20-80min，分液，得下层的萃取液，45-60℃旋蒸得初制孢子油E；S5，超临界萃取：将滤饼D装到滤布袋中，滤布袋中填充浮球，将滤布袋封口放到超临界CO2萃取釜中，萃取釜中加入夹带剂，控制萃取压力为8.5MPa，温度为35℃，萃取时间为1h，得二次孢子油F；S6，高速离心：将初制孢子油E和二次孢子油F混合，经高速离心处理后，得成品的精制孢子油G。对比例2：S1，破壁：取重量份的灵芝孢子10g、锆珠32g加入到超声球磨罐中，添加水20g，加入巴比妥缓冲液，调整pH至8.5，总液面占球磨罐的1/4，开启超声80Hz，球磨转速为300r/min，控制球磨罐内温度为45℃，运行1.5h；S2，浸提：经过S1处理后，于超声球磨罐加入15g乙醇，再滴加浓度为10%的KOH乙醇溶液，调整pH至8.6，开启超声65Hz，球磨转速为350r/min，，控制球磨罐内温度为85℃，运行4h，得到悬浮液A；S3，过滤：取出悬浮液A后，用乙醇对超声球磨罐清洗3-5次，得到清洗液B；将清洗液B和悬浮液A混合，采用微孔筛板压滤，得滤液C和滤饼D；S4，分液萃取：取占滤液C4倍重量的氯仿，并加入滤液C，超声溶解，静置20-80min，分液，得下层的萃取液，45-60℃旋蒸得初制孢子油E；S5，超临界萃取：将滤饼D装到滤布袋中，滤布袋中填充浮球，将滤布袋封口放到超临界CO2萃取釜中，萃取釜中加入夹带剂，控制萃取压力为8.5MPa，温度为35℃，萃取时间为1h，得二次孢子油F；S6，高速离心：将初制孢子油E和二次孢子油F混合，经高速离心处理后，得成品的精制孢子油G。表1生物酶对破壁工艺的影响对比例1对比例2实施例3破壁率（%）3594>98如表1所示，在相同的破壁时间和温度下，生物酶与超声波-球磨破碎联用的破壁率最高，不加生物酶就需要大幅提高超声的频率和球磨的转速。对比例3：S1，破壁：取重量份的灵芝孢子10g、锆珠36g加入到超声球磨罐中，添加水20g、生物酶0.15g，加入巴比妥缓冲液，调整pH至9，总液面占球磨罐的1/3，开启超声30Hz，球磨转速为150r/min，控制球磨罐内温度为35℃，运行3h；S2，浸提：经过S1处理后，于超声球磨罐加入15g乙醇，开启超声65Hz，球磨转速为450r/min，控制球磨罐内温度为50℃，运行6h，得到悬浮液A；S3，过滤：取出悬浮液A后，用乙醇对超声球磨罐清洗3-5次，得到清洗液B；将清洗液B和悬浮液A混合，采用微孔筛板压滤，得滤液C和滤饼D；S4，分液萃取：取占滤液C4倍重量的氯仿，并加入滤液C，超声溶解，静置20-80min，分液，得下层的萃取液，45-60℃旋蒸得初制孢子油E；S5，超临界萃取：将滤饼D装到滤布袋中，滤布袋中填充浮球，将滤布袋封口放到超临界CO2萃取釜中，萃取釜中加入夹带剂，控制萃取压力为9MPa，温度为30℃，萃取时间为2h，得二次孢子油F；S6，高速离心：将初制孢子油E和二次孢子油F混合，经高速离心处理后，得成品的精制孢子油G。表2.精制孢子油的提取率破壁温度/℃破壁pH孢子油的酶活性精制孢子油产量/g提取率/%总三萜含量/%实施例1356.5无2.6626.618.9实施例2307无2.8128.119.3实施例3458.5无3.0730.719.6对比例3359有1.5315.313.5精制孢子油G中生物酶的活性测试：采用考马斯亮兰法，如精制孢子油G样品未导致测试染料溶液变色，即证明生物酶无活性；如溶液的颜色由棕黑色变为蓝色，即证明生物酶有活性。如表2所示，对比例3采用的浸提温度为50℃，未加入碱醇溶液，该条件不足以使生物酶失活，同时与实施例1-3相比，由于浸提温度过低，导致孢子油未得到充分提取，使孢子油提取率大幅下降，从而表明单靠CO2超临界萃取法，也会有不少的浸提损失；从实施例1-3比较，可以得出最佳破壁条件为45℃，pH8.5，平均出油率为30%左右，平均总三萜含量为19%，属于较高品质的灵芝孢子油产品（一般孢子油中总三萜的含量为15%左右）。本发明的优势在于采用生物酶-超声-机械联用破壁法直接对灵芝孢子进行破壁，破壁速度快，破壁效率高；破壁与浸提采用一锅法，无需更换容器，物料几乎无损失；采用超声浸提-超临界萃取两步法，对孢子原料进行两次提取，提取过程无需干燥、制粒等程序，节约成本且提高提取率和产品质量。以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本
技术领域：
的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。当前第1页1 2 3