一种具有自愈合功能的丝胶水凝胶及其制备方法和应用与流程

本发明涉及自愈合水凝胶的制备领域，尤其涉及一种具有自愈合功能的丝胶水凝胶及其制备方法和在促成骨功能中的应用。

背景技术：

自愈合水凝胶是模仿生物体损伤后自行愈合的机制，在材料受到破坏后能够自动愈合的一种新兴仿生材料。自愈合水凝胶的愈合机理主要是借助于氢键、静电作用、动态金属配位、疏水作用、超分子主客体作用和亚胺键等动态相互作用，当凝胶内部结构被破坏后，受损部位的动态键重新结合实现凝胶的自愈合。其中，亚胺键(又称席夫碱)是由胺和活性羰基缩合而成的一种动态可逆化学键，因为席夫碱反应之间的动态平衡，近年来常作为动态交联反应用于构建自愈合水凝胶。

羟基磷灰石是人体和动物骨骼中的主要无机成分，具有良好的生物相容性、骨诱导性和骨传导性，在骨组织工程领域具有良好的应用前景。然而羟基磷灰石也存在一些缺点，例如脆性大，抗疲劳性差，很大程度上限制了羟基磷灰石作为单一材料在骨组织修复中的应用。

如果将羟基磷灰石与自愈合水凝胶相结合，有望解决羟基磷灰石作为单一材料在骨组织修复中存在的上述技术问题。

申请公布号为cn103157129a的中国专利文献中公开了一种用于骨修复的聚氨基酸/羟基磷灰石复合水凝胶及其制备方法，该制备方法包括：首先将氨基酸溶解于去离子水中，通过碳化二胺活化，加入二元胺作为交联剂，制备聚氨基酸水凝胶，将所得水凝胶在模拟体液中浸泡一定天数，即可得到聚氨基酸/羟基磷灰石复合水凝胶。但该技术方案耗时较长，且矿化过程需要多个羟基磷灰石成核位点，对水凝胶基体表面要求高。

申请公布号为cn105268029a的中国专利文献中公开了一种用于骨修复的可注射并可自愈合的天然高分子水凝胶的制备方法，先将海藻酸钠与可溶性高碘酸盐经氧化反应生成醛基功能化海藻酸钠，然后将氢氧化钙与磷酸反应生成磷酸钙骨水泥，再将磷酸钙骨水泥与乙二醇壳聚糖复合后，与醛基功能化海藻酸钠在磷酸盐缓冲溶液中进行席夫碱反应制备得到。但该技术方案合成磷酸钙骨水泥时需要调控ph，且与生物体内的磷灰石的结晶度和钙磷比存在一定差距，用于骨修复效果可能不佳。

技术实现要素：

针对现有技术存在的上述问题，本发明公开了一种具有自愈合功能的丝胶水凝胶的制备方法，制备得到的丝胶水凝胶兼具优异的自愈合功能和力学性能，尤其适合用于促进成骨功能。

具体技术方案如下：

一种具有自愈合功能的丝胶水凝胶的制备方法，包括如下步骤：

(1)以丝胶为原料，制备胺基化丝胶；

(2)以海藻酸钠为原料，制备氧化海藻酸钠；

(3)将步骤(1)制备的胺基化丝胶、羟基磷灰石与水混合，得到混合溶液；

(4)将步骤(2)制备的氧化海藻酸钠与水混合得到溶液，再将所述溶液与步骤(3)所述混合溶液混合，经席夫碱反应得到所述具有自愈合功能的丝胶水凝胶。

丝胶是包裹在丝素纤维表层的一种天然大分子蛋白，具有良好的生物相容性和易加工性，可以非常方便地制成纤维、微球、薄膜、水凝胶等多种形式的材料。另外，丝胶拥有大量的极性基团(羟基、羧基以及氨基)，这种组分和结构赋予了丝胶蛋白易于交联、结构可控以及良好的生物相容性等特性。丝胶本身所具有的羧基能很好地结合钙离子，从而与纳米羟基磷灰石颗粒进行静电吸附。

本发明利用天然大分子材料丝胶添加羟基磷灰石作为无机成分形成凝胶时，在电镜下表现为多孔的微观结构，表现出对人类间充质干细胞良好促成骨分化作用。此外，不同的浓度配比表现为不同的凝胶结构和性能，生产中可通过浓度配比的调节来控制产品的性状。

步骤(1)中，所述胺基化丝胶的具体制备工艺如下：

向丝胶/二甲基亚砜溶液中，加入羰基二咪唑充分反应，将混合液倒入己二酸二酰肼/二甲基亚砜溶液中，反应12～36h，反应液经透析处理、冷冻干燥后得到胺基化丝胶。

所述丝胶由下角茧、废丝或回收再生的绢丝织物品中提取得到；因此可以大大降低该制备工艺的生产成本。

所述丝胶/二甲基亚砜溶液的浓度为100～300mg/ml；

所述己二酸二酰肼/二甲基亚砜溶液的浓度为300～800mg/ml；

所述羰基二咪唑、丝胶和己二酸二酰肼的质量比为1：1～2：10～20；

经试验发现，所述己二酸二酰肼用量的调整会对制备的具有自愈合功能的丝胶水凝胶的交联程度产生影响。低于上述添加量时，丝胶胺基化比率低，导致丝胶水凝胶的交联程度和自愈合效率较差；而高于上述添加量时，将导致成本增加，更会由于产品过反应而影响生物相容性。进一步优选，所述己二酸二酰肼/二甲基亚砜溶液的浓度为600mg/ml。

步骤(2)中，所述氧化海藻酸钠的具体制备工艺如下：

向海藻酸钠水溶液中，加入高碘酸钠，室温下避光反应2～6h，再加入乙二醇终止反应，反应液经透析、冷冻干燥后得到氧化海藻酸钠。

所述海藻酸钠水溶液的浓度为5～20mg/ml；

所述海藻酸钠与高碘酸钠的摩尔比为1：0.5～1；

所述乙二醇与所述海藻酸钠水溶液的体积比为0.5～1.5：100；

经试验发现，不同高碘酸钠添加量对海藻酸钠的氧化度有影响。低于上述摩尔比，氧化不完全；而高于上述摩尔比，成本增加，并造成多余高碘酸钠残留。

优选地，步骤(2)与步骤(3)中的透析处理均采用截留分子量为3500d的透析袋，经试验发现，采用上述两步特殊规格的透析袋处理后的胺基化丝胶和氧化海藻酸钠，两者的交联更佳充分。

步骤(3)中：

所述胺基化丝胶与羟基磷灰石的质量比为1：0.1～0.6；经试验发现，随羟基磷灰石添加量的增加，其在内部进行二次静电吸附形成双层网络结构，水凝胶交联密度增强，机械性能增加。但高于上述添加量时，过多的羟基磷灰石会妨碍氨基和醛基之间的交联，导致自愈合能力下降。

所述混合溶液中，胺基化丝胶的浓度为50～200mg/ml；随所述胺基化丝胶浓度的增加，水凝胶内部显微结构的紧密程度有一定的增强，机械性能增加，凝胶时间明显缩短；低于上述浓度范围，所形成形貌以松散不均一为主；而高于上述浓度范围，凝胶速度过快也会导致交联不完整，形貌过于紧密且不平整均一；进一步优选，所述胺基化丝胶的浓度为90～150mg/ml。

步骤(4)中：

所述溶液中氧化海藻酸钠的浓度为50～200mg/ml；经试验发现，随所述海藻酸钠水溶液浓度的增加，水凝胶内部显微结构的紧密程度有一定的增强，机械性能增加，凝胶时间明显缩短；低于上述浓度范围，所形成形貌以松散不均一为主；而高于上述浓度范围，凝胶速度过快也会导致交联不完整，形貌过于紧密且不平整均一；进一步优选，所述氧化海藻酸钠的浓度为90～150mg/ml。

进一步优选，所述胺基化丝胶中的氨基与所述氧化海藻酸钠中的醛基的摩尔比为0.5～2：1。经试验发现，随上述摩尔比变化，对水凝胶机械性能和凝胶时间都有明显影响。低于或高于上述摩尔比，都会导致凝胶时间长，机械性能差。

再优选：

所述胺基化丝胶与所述氧化海藻酸钠的浓度均为150mg/ml，所述胺基化丝胶中的氨基与所述氧化海藻酸钠中的醛基的摩尔比为1：1。经试验发现，采用上述优化参数制备得到的丝胶水凝胶兼具最佳的自愈合性能以及抗压性和韧性。

本发明还公开了根据上述方法制备得到的具有自愈合功能的丝胶水凝胶，该水凝胶还包含天然大分子海藻酸钠和天然骨骼成分羟基磷灰石，构建了均一多孔的微观形貌。

所述丝胶水凝胶兼具优异的自愈合功能和力学性能，以及生物相容性和骨诱导活性，尤其适合用于促进成骨功能，可在促成骨功能中加以应用。

与现有技术相比，本发明具有如下优点：

本发明制备的丝胶水凝胶具有优异的自愈合功能，愈合过程不需要外界刺激(ph、光照、温度和化学试剂等)；以及优异的抗压性与韧性，机械性能更佳。相对于其它常见的天然大分子材料(如明胶)制备的水凝胶具有更佳的综合性能，与羟基磷灰石也具有更佳的结合效果。

本发明制备的可自愈合的丝胶水凝胶，生物相容性好，利于细胞生长，可应用于组织工程等领域。

本发明的制备工艺具有耗能低，生物安全性高，价格低廉，操作简单方便，时间短，反应条件温和，产量高等优势。

附图说明

图1为实施例1制备的丝胶水凝胶的微观照片；

图2为实施例1制备的丝胶水凝胶的自愈合过程照片；

图3为实施例1制备的丝胶水凝胶经压缩前、后的对比照片。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明的技术方案作进一步的详细说明，以下实施例是对本发明的解释而本发明并不局限于以下实施例。

实施例1

6g丝胶粉末溶于30ml二甲基亚砜中，加入4g羰基二咪唑充分反应，将混合液倒入100ml、600mg/ml己二酸二酰肼溶液，充分反应24h，将反应液用3500d透析袋透析48h，冻干得到胺基化丝胶。

3g海藻酸钠粉末溶于300ml的去离子水中，加入3.24g高碘酸钠，室温避光反应5h，加入4.5ml乙二醇终止反应1h，将反应液用3500d透析袋透析72h，冻干得到氧化海藻酸钠。

分别将胺基化丝胶和氧化海藻酸钠溶解于去离子水中，制成浓度均为150mg/ml的溶液，在胺基化丝胶溶液中加入丝胶质量40％的羟基磷灰石粉末，超声30min，将混有羟基磷灰石的胺基化丝胶溶液和氧化海藻酸钠溶液按体积比1：1均匀混合，以控制胺基化丝胶中的氨基与氧化海藻酸钠中的醛基的摩尔比为1：1，得到机械性能优异的可自愈合的丝胶水凝胶。

图1为本实施例制备的丝胶水凝胶的微观形貌，为多孔状网络结构，且孔壁上附有羟基磷灰石颗粒，表明其成功复合进水凝胶内部。

将本实施例制备的丝胶水凝胶切开后，重新组合，经过12h后观察凝胶自愈合情况，详见图2。观察发现，本实施例制备的丝胶水凝胶具有优异的自愈合性能，经12h，愈合效率达84.5％。

将水凝胶制成直径为10mm，高为5mm的圆柱状样品，采用拉力试验机在无侧限压缩模式下分析本实施例制备的丝胶水凝胶的压缩抗压性能，其中力的加载速度为1n/min。测得最大应力为189kpa，最大应变为62％。

图3为压缩前、后的对比照片，对比发现，制备的丝胶水凝胶具有较高的抗压性和韧性。

对比例1

制备工艺与实施例1中相同，区别仅在于将6g丝胶粉末替换为6g明胶粉末。

经测试，经12h，本对比例制备的水凝胶自愈合效率达72％。

经压缩测试(测试条件同实施例1)，本对比例制备的水凝胶的最大应力为121kpa，最大应变为38％。

对比例2

制备工艺与实施例1中相同，区别仅在于未加入羟基磷灰石粉末。

经测试，经12h，本对比例制备的水凝胶自愈合效率达87.2％。

经压缩测试(测试条件同实施例1)，本对比例制备的水凝胶的最大应力为108kpa，最大应变为52％。

对比例3

制备工艺与对比例2中相同，区别在于将6g丝胶粉末替换为6g明胶粉末。

经测试，经12h，本对比例制备的水凝胶自愈合效率达81％。

经压缩测试(测试条件同实施例1)，本对比例制备的水凝胶的最大应力为92kpa，最大应变为47％。

实施例2～3

制备工艺与实施例1中相同，区别仅在于羟基磷灰石粉末的加入量分别替换为丝胶质量的20％和60％。

经测试，实施例2、3分别制备的丝胶水凝胶具有优异的自愈合性能，经12h，愈合效率分别达85.3％、73％。

经压缩测试(测试条件同实施例1)，实施例2、3分别制备的水凝胶的最大应力分别为134kpa、84kpa，最大应变分别为52％、59％。

实施例4

6g丝胶粉末溶于30ml二甲基亚砜中，加入4g羰基二咪唑充分反应，将混合液倒入100ml、600mg/ml己二酸二酰肼溶液，充分反应24h，将反应液用3500d透析袋透析48h，冻干得到胺基化丝胶。

3g海藻酸钠粉末溶于300ml的去离子水中，加入3.24g高碘酸钠，室温避光反应5h，加入4.5ml乙二醇终止反应1h，将反应液用3500d透析袋透析72h，冻干得到氧化海藻酸钠。

将胺基化丝胶和氧化海藻酸钠溶解于去离子水中，分别制150mg/ml和90mg/ml的溶液，在胺基化丝胶溶液中加入丝胶质量40％的羟基磷灰石粉末，超声30min，将混有羟基磷灰石的胺基化丝胶溶液和氧化海藻酸钠溶液按体积比2：1均匀混合，以控制胺基化丝胶中的氨基与氧化海藻酸钠中的醛基的摩尔比为2：1，得到机械性能较低的可自愈合的丝胶水凝胶。

经测试，本实施例制备的丝胶水凝胶具有优异的自愈合性能，经12h，愈合效率达52.7％。

经压缩测试(测试条件同实施例1)，本实施例制备的水凝胶的最大应力为43kpa，最大应变为68％。

实施例5

6g丝胶溶粉末溶于30ml二甲基亚砜中，加入4g羰基二咪唑充分反应，将混合液倒入100ml、600mg/ml己二酸二酰肼溶液，充分反应24h，将反应液用3500d透析袋透析48h，冻干得到胺基化丝胶。

3g海藻酸钠粉末溶于300ml的去离子水中，加入3.24g高碘酸钠，室温避光反应5h，加入4.5ml乙二醇终止反应1h，将反应液用3500d透析袋透析72h，冻干得到氧化海藻酸钠。

将胺基化丝胶和氧化海藻酸钠溶解于去离子水中，分别制150mg/ml和120mg/ml的溶液，在胺基化丝胶溶液中加入丝胶质量40％的羟基磷灰石粉末，超声30min，将混有羟基磷灰石的胺基化丝胶溶液和氧化海藻酸钠溶液按体积比1：2均匀混合，以控制胺基化丝胶中的氨基与氧化海藻酸钠中的醛基的摩尔比为1：2，得到机械性能优异的可自愈合的丝胶水凝胶。

经测试，本实施例制备的丝胶水凝胶具有优异的自愈合性能，经12h，愈合效率达76.5％。

经压缩测试(测试条件同实施例1)，本实施例制备的水凝胶的最大应力为173kpa，最大应变为38％。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的几个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。