用于骨关节炎的诊断性分子标志物的制作方法

本发明涉及疾病诊断领域，具体涉及用于骨关节炎的诊断性分子标志物，更具体地涉及以检测fam167b异常为手段的疾病诊断方法。
背景技术：
：骨关节炎(osteoarthritis，oa)是一种以关节软骨退行性变和关节炎症为特征的慢性骨关节疾病，主要临床表现为慢性疼痛和关节活动障碍，严重影响患者生活质量。该病多见于中老年人，在年龄≥60岁的人群中约有80％的人出现骨关节炎，基于六大行政区域的中国40岁以上人群原发性oa总体患病率为46.3％。骨关节炎是由机械、遗传和环境因素引起的复杂多因素疾病，也是关节中最常见的疾病，许多环境因素如激素、饮食、感染、创伤、酒精摄入和接触烟草烟雾等，都会增加骨关节炎的患病风险，年龄是其独立危险因素。随着社会老龄化进程及肥胖的日益加重，oa发病率逐年增加，导致患者身体残疾及生活质量降低，给患者带来沉重的经济负担，oa已经演变成为严重的社会问题，值得广泛关注。长期以来，许多学者致力于关节软骨生理、病理及软骨细胞代谢等方面的基础研究，并在oa病因及病理机制方面达成了一定共识。目前普遍认为oa与遗传因素、年龄、体重及外伤等因素有关，病理改变主要涉及关节软骨细胞外基质降解、软骨细胞凋亡及软骨成分自身免疫反应等，软骨细胞凋亡及炎症机制在oa中扮演着重要的角色。软骨细胞是关节软骨中唯一的细胞，细胞外基质降解、软骨细胞凋亡和细胞因子的产生对骨关节炎的病理进展至关重要。因此，抑制细胞外基质降解、减轻软骨细胞凋亡和炎症反应可延缓骨关节炎的病理进展过程。近年来，随着研究的逐渐深入，oa在分子生物学方面的发病机制越来越引起学者们的关注，由机体天然免疫系统介导的慢性、低度炎症反应在oa发病机制中的作用逐渐成为研究热点，开辟了oa研究的新领域，将使我们更加全面地认识oa，为oa早期防治提供新思路。在专利方面，多件专利文献，如201510627048.x、201510725004.0、201510724747.6等均披露了一些能够诊断骨关节炎的分子标志物。但是现有的研究还远远达不到精准医疗中对检测标志物数量研究的要求，本申请旨在提供新的骨关节炎诊断性分子标志物，为临床基因检测服务。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种可用于骨关节炎早期诊断的分子标志物。本发明利用测序和qpcr实验证明了fam167b基因在骨关节炎滑膜组织的表达水平显著高于正常滑膜组织，因此可将fam167b基因作为骨关节炎的诊断性基因标志物。为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：本发明提供了检测fam167b基因及其表达产物的产品在制备诊断骨关节炎的工具中的应用。进一步，上面所提到的检测fam167b基因及其表达产物的产品包括：通过rt-pcr、实时定量pcr、免疫检测、原位杂交、芯片或高通量测序平台检测fam167b基因表达水平以诊断骨关节炎的产品。进一步，所述用rt-pcr诊断骨关节炎的产品至少包括一对特异扩增fam167b基因的引物；所述用实时定量pcr诊断骨关节炎的产品至少包括一对特异扩增fam167b基因的引物；所述用免疫检测诊断骨关节炎的产品包括：与fam167b蛋白特异性结合的抗体；所述用原位杂交诊断骨关节炎的产品包括：与fam167b基因的核酸序列杂交的探针；所述用芯片诊断骨关节炎的产品包括：蛋白质芯片和基因芯片；其中，蛋白质芯片包括与fam167b蛋白特异性结合的抗体，基因芯片包括与fam167b基因的核酸序列杂交的探针。根据在本发明中所使用的，术语“引物”指能在其3’端与互补核酸分子杂交且提供可由核酸聚合酶延伸的游离3’羟基末端的任何核酸，扩增引物是能与基因(分别为正链和负链，或反之)的5’或3’区退火且之间包含短区域的一对核酸分子。在适宜的条件下，使用适宜的试剂，这类引物允许扩增具有两侧为该引物的核苷酸序列的核酸分子。所述fam167b蛋白的特异性结合抗体包括单克隆抗体、多克隆抗体。其包括完整的抗体分子、抗体的任何片段或修饰(例如嵌合抗体、scfv、fab、f(ab’)2、fv等)。只要所述片段能够保留与fam167b蛋白的结合能力即可。用于蛋白质水平的抗体的制备是本领域技术人员公知的，并且本发明可以使用任何方法来制备所述抗体。本发明中使用的术语“探针”指能结合具有互补序列的靶核酸的寡核苷酸，该结合经由一种或多种类型的化学键，通常经由互补碱基配对，通常经由氢键形成。根据杂交条件的严格性，探针可以结合与探针序列缺乏完全互补性的靶序列。可以存在任意数目的碱基对错配，其将干扰本文中描述的靶序列与单链核酸之间的杂交。然而，如果突变数目太多以至于甚至在最小严格杂交条件下也不能发生杂交，那么该序列不是互补靶序列。探针可以是单链或部分单链和部分双链的。探针的链性由靶序列的结构、组成和特性决定。探针可以直接标记或间接标记，如用生物素标记，其可之后被链霉亲合素蛋白复合物结合。进一步，在本发明的具体实施方案中，所述用实时定量pcr诊断骨关节炎的产品至少包括的一对特异扩增fam167b基因的引物的序列如seqidno.1和seqidno.2所示。本发明方法中，采用从滑膜组织样品提取核酸的快速技术和扩增和检测指示骨关节炎，这些核酸片段定性和定量地测量由标志基因fam167b编码的mrna。就测量mrna水平来确定基因表达而言，可通过本领域已知的任何手段来进行分析，并且包括诸如pcr、滚环扩增(rca)、连接酶链反应(lcr)、链置换扩增(sda)、基于核酸序列的扩增(nasba)等之类的方法。所涉及的快速分子诊断学优选的实时定量pcr。典型的pcr包括多个扩增步骤或循环，其选择性扩增靶核酸种类。典型的pcr包括三个步骤：变性步骤，其中靶核酸变性；退火步骤，其中一组pcr引物(正向引物和反向引物)退火至互补dna链；延伸步骤，其中热稳定性dna聚合物延伸引物。通过重复该步骤多次，dna片段被扩增而产生对应于靶dna序列的扩增子。典型的pcr包括20个或更多个变性、退火和延伸循环。通常，退火后延伸步骤可同时进行，在这种情况中该循环仅含两个步骤。本发明还提供了一种诊断骨关节炎的工具，所述诊断工具包括能够检测生物样品中fam167b基因或fam167b蛋白的表达水平的产品，优选地，包括芯片、试剂盒、试纸或高通量测序平台。其中，所述芯片包括基因芯片、蛋白质芯片；所述基因芯片包括固相载体以及固定在固相载体的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括用于检测fam167b基因转录水平的针对fam167b基因的寡核苷酸探针；所述蛋白质芯片包括固相载体以及固定在固相载体的fam167b蛋白的特异性抗体。本发明的基因芯片可用于检测包括fam167b基因在内的多个基因(例如，与骨关节炎相关的多个基因)的表达水平；蛋白质芯片可用于检测包括fam167b蛋白在内的多个蛋白质(例如，与骨关节炎相关的多个蛋白质)的表达水平。通过将多个与骨关节炎相关的标志物同时检测，骨关节炎诊断的准确率也将大大提高。其中，所述试剂盒包括基因检测试剂盒和蛋白免疫检测试剂盒；所述基因检测试剂盒包括用于检测fam167b基因转录水平的试剂；所述蛋白免疫检测试剂盒包括fam167b蛋白的特异性抗体。进一步，所述试剂包括使用rt-pcr、实时定量pcr、免疫检测、原位杂交或芯片方法检测fam167b基因表达水平过程中所需的试剂。优选地，所述检测fam167b基因转录水平的试剂包括检测fam167b基因mrna的引物和/或探针。根据fam167b基因的核苷酸序列信息容易设计出可以用于检测fam167b基因表达水平的引物和探针。本发明中检测fam167b基因mrna的引物序列如下：正向引物序列如seqidno.1所示，反向引物序列如seqidno.2所示。其中，所述试纸包括试纸载体和固定在试纸载体上的寡核苷酸，所述寡核苷酸能够检测fam167b基因的转录水平。其中，所述高通量测序平台包括检测fam167b基因转录水平的试剂。高通量测序平台是一种特殊的诊断工具，检测fam167b基因表达的产品可以应用于该平台实现对fam167b基因的表达情况的检测。随着高通量测序技术的发展，对一个人的基因表达谱的构建将成为十分便捷的工作。通过对比疾病患者和正常人群的基因表达谱，容易分析出哪个基因的异常与疾病相关。因此，在高通量测序中获知fam167b基因的异常与骨关节炎相关也属于fam167b基因的用途，同样在本发明的保护范围之内。本发明使用的术语“生物样品”指的是含有生物材料例如dna、rna和蛋白质的样品。在本发明的具体实施方案中，用于诊断骨关节炎的fam167b基因及其表达产物的来源是组织。高质量的rna提取为期望的，因为rna降解会不利影响所提取rna的下游评价，例如在基因表达和mrna分析中以及在非编码rna(例如小rna和微小rna)的分析中。在一些实施方案中，高质量的核酸提取为其中能够检测18s和28srrna的提取。在一些实施方案中，提取的18s和28srrna的量化可用于确定核酸提取的质量。在一些实施方案中，18s和28srrna的量化比率为约1:1-约1:2，例如约1:2。在本发明的上下文中，“fam167b基因”包括fam167b基因以及fam167b基因的任何功能等同物的多核苷酸。fam167b基因(nc_000001.11(32247222..32248856))序列可在国际公共核酸序列数据库genebank中查询到。在本发明的上下文中，fam167b基因表达产物包括fam167b蛋白以及fam167b蛋白的部分肽。所述fam167b蛋白的部分肽含有与骨关节炎相关的功能域。“fam167b蛋白”包括fam167b蛋白以及fam167b蛋白的任何功能等同物。所述功能等同物包括fam167b蛋白保守性变异蛋白质、或其活性片段，或其活性衍生物，等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严谨条件下能与fam167b基因的dna杂交的dna所编码的蛋白质。“诊断”意为检测疾病或病症，或者确定疾病或病症的阶段或程度。通常地，对疾病或病症的诊断基于对指示疾病的一种或多种因子和/或症状的评估。亦即，诊断可基于指示疾病或状况的存在或缺乏的因子的存在、缺乏或量来进行。在本发明的上下文中，“诊断骨关节炎”既包括判断受试者是否已经患有骨关节炎、也包括判断受试者是否患有骨关节炎的风险。本发明的优点和有益效果：本发明发现了一种骨关节炎的诊断性分子标志物，使用该分子标志物可以在骨关节炎发生的早期做出判断，进而为受试者的预防方案或治疗方案提供指导性意见。附图说明图1显示利用qpcr在mrna水平上检测fam167b基因表达的统计图。具体实施方式下面将结合附图和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。实施例1oa滑膜组织和正常滑膜组织的高通量测序5例oa患者的滑膜组织(oa组)来自于骨科行膝关节置换或滑膜切除术的oa病人。所用病例符合altam提出的关于oa的诊断标准。3例正常滑膜组织(nor组)来自于外伤手术病人关节滑膜组织。1、提取样品组织的rna利用trizolrna提取方法提取oa患者滑膜组织和正常滑膜组织中的总rna。(1)用液氮预冷研钵，组织样品放入加有液氮的研钵中，在液氮下把组织样品充分研磨成粉末；(2)把样品粉末转入到装有trizol裂解液的2.0mlep管中，(每ml裂解液可加50mg组织样品)剧烈震荡，充分混匀，平放室温静置5-10min；(3)10000rpm，4℃离心5min；(4)吸取上清液至新的2.0mlep管中，每毫升裂解液加入200μl氯仿/异戊醇，剧烈颠倒混匀；(5)10000rpm，4℃离心10min；(6)吸取上清液至新的1.5ml离心管，注意不要吸到中间蛋白层，加入等上清液体积的异丙醇，轻轻颠倒混匀；(7)放入-20℃冰箱沉淀1h；(8)13600rpm，4℃离心20min；(9)吸弃上清，加入1ml75％乙醇，用移液器吹洗沉淀；(10)10000rpm，4℃离心3min，吸弃上清，短暂离心，吸去残留液体，晾干3-5min；(11)用30-100μldepc水或者rnasefree水溶解沉淀；(12)置于-80℃冰箱保存。2、rna样品的质量分析nanodrop2000检测rna的浓度和纯度，od260/280范围区间为1.8-2.2，agilenttechnologies2100bioanalyzer检测总rna的浓度、rin值、28s/18s和片段大小，rna完整性指数合格，浓度≥200ng/ul，进行mrna文库构建。3、高通量转录组测序应用illuminahiseqx-ten第二代高通量测序技术进行mrna测序。(1)文库富集，pcr扩增15个cycles；(2)2％琼脂糖胶回收目的条带；(3)tbs80(picogreen)定量，按数据比例混合；(4)cbot上进行桥式pcr扩增，生成clusters；(5)hiseqx-ten测序平台，进行2×100bp/300bp测序。使用软件cuffquant、cuffdiff进行mrna表达定量与差异表达分析。cuffquant是cufflinks套件中专门用来进行表达量评估和标准化的工具，而cuffdiff则是专门用来计算差异表达的工具，可利用cuffquant的定量结果比较每个基因/转录本在两个分组间的表达差异。显著差异mrna筛选条件：p<0.05，|log2fc|>1。4、结果高通量测序结果显示，fam167b在oa滑膜组织中表达下调。实施例2oa和正常人群fam167b基因表达水平的检测1、样本收集与rna提取按照实施例1的方法收集骨关节炎滑膜组织和正常滑膜组织各33例。rna提取步骤同实施例1。2、逆转录利用tiangen公司的逆转录试剂盒进行rna的逆转录，具体反应体系如下：(1)去除基因组dna的反应体系将1.0μg的总rna模板与2.0μl的5×gdnabuffer和rnasefree水混合，终体积为10μl，42℃孵育3min。(2)逆转录pcr反应体系将2.0μl的10×fastrtbuffer、1.0μl的primerscriptrtenzymemixi与2.0μl的fq-rtprimermix混合，加入10μl的去除基因组dna的反应体系和5.0μl的rnasefree水，共20μl，42℃反应15min，之后95℃反应3min。3、qpcr(1)引物设计根据genebank中fam167b基因和gapdh基因的编码序列设计qpcr扩增引物，具体引物序列如下：fam167b基因：正向引物为5’-tggggctactgaaattcc-3’(seqidno.1)；反向引物为5’-cagtgccttcacagagtc-3’(seqidno.2)；gapdh基因：正向引物为5’-tttaactctggtaaagtggatat-3’(seqidno.3)；反向引物为5’-ggtggaatcatattggaaca-3’(seqidno.4)。(2)按照表1配制pcr反应体系：superrealpremixplus试剂盒购自tiangen公司。表1pcr反应体系试剂体积2×superrealpremixplus10μl正向引物(10um)0.6μl反向引物(10um)0.6μl50×roxreferencedye2μldna模板2μl去离子水4.8μl(3)pcr反应条件：95℃15min，(95℃10s，55℃30s，72℃32s)进行40个循环，之后95℃15s，60℃60s，95℃15s。以sybrgreen作为荧光标志物，在abi7300型荧光定量pcr仪上进行pcr反应，通过熔解曲线分析和电泳确定目的条带，2-δδct法进行相对定量。4、统计学方法实验设置3次平行实验，结果数据以平均值±标准差的方式来表示，采用spss13.0统计软件来进行统计分析，两者之间的差异采用t检验，认为当p<0.05时具有统计学意义。5、结果统计结果如图1所示，与正常滑膜组织相比，骨关节炎滑膜组织fam167b基因表达量显著降低，差异具有统计学意义(p<0.05)。上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围之内。序列表<110>北京泱深生物信息技术有限公司<120>用于骨关节炎的诊断性分子标志物<160>4<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>18<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1tggggctactgaaattcc18<210>2<211>18<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2cagtgccttcacagagtc18<210>3<211>23<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3tttaactctggtaaagtggatat23<210>4<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>4ggtggaatcatattggaaca20当前第1页12