本发明属于植物培育技术领域，尤其涉及一种抗除草剂薏苡资源获取的方法。
背景技术：
薏苡田杂草种类繁多，它们的适应性强，繁殖能力旺盛，与薏苡争夺阳光、水分、肥料和空间，疏于管理会带来严重减产，除去杂草是薏苡生产中的重要栽培技术环节。除草剂除草作为现代农业生产体系的组成部分，是薏苡田除草技术中最可靠、最经济的措施，对节省劳动力、提高劳动生产率和保护土壤结构都有重要意义。除草剂在消灭杂草的同时也对薏苡本身具有伤害作用，这就限制了除草剂的应用。同时薏苡的应用规模较稻麦玉米等禾本科作物禾本科小，抗除草剂资源研究工作做的较少。薏苡生产主要在偏远地带，田间锄草主要依赖播前化学锄草和人工锄草相结合来完成，效率较低。因此抗除草剂薏苡资源可较好的解除除草剂应用的顾忌，实现薏苡田高效锄草。
技术实现要素：
本发明目的就是为了弥补已有技术的缺陷，提供一种抗除草剂薏苡资源获取的方法。
为了实现上述的目的，本发明提供以下技术方案：
一种抗除草剂薏苡资源获取的方法，包括以下步骤：
（1）无菌胚芽培养：去除总苞的薏苡种子经75%酒精浸泡2min，无菌水冲洗3次，无菌水纸床培养，发芽后0.1%升汞消毒8min，无菌水冲洗5-8次，切下胚芽，接于ms培养基无菌培养，温度21-23℃，光照强度2000lx；
（2）愈伤组织诱导：芽长达3cm后，斜切薄片，转接于培养基，ph5.8，温度21-23℃，光照13h，1200lx，出愈后原培养基继代2-3次；
（3）愈伤组织增殖培养：继代2-3次后，接入培养基，ph5.8，温度21-23℃，光照13h，1500lx，再次继代培养2-3次；
（4）抗草丁膦bar基因导入愈伤组织共培养：将含有bar基因载体的农杆菌菌液培养过夜，用菌液稀释培养基，稀释光密度值至0.6-0.8，侵染薏苡的胚性愈伤组织15min，期间不停晃动，之后用滤纸吸干愈伤组织上多余的菌液，接入培养基上暗培养2d，培养后的胚性愈伤组织用含有500mg/l头孢霉素的无菌水洗2次，用滤纸吸干水分；
（5）抗性愈伤组织的增殖培养：接入培养基，ph5.8，温度21-23℃，光照13h，1500lx，再次继代培养2-3次；
（6）草丁膦培养筛选抗性愈伤组织：增殖后的愈伤组织转接抗性选择培养基，ph5.8，温度21-23℃，光照13h，1500lx，筛选培养，筛选3次，每15d继代1次，3轮选择后生长健旺的抗性愈伤组织，进行编号；
（7）抗草丁膦胚性愈伤组织的再分化：编号后抗性愈伤组织转接分化培养基进行分化培养，同时提取抗性愈伤组织系的dna，进行聚合酶链式反应（pcr）检测，统计转化率，胚性愈伤组织出现的绿点进一步分化出不定芽，待不定芽长到2-3cm，转接在生根培养基（1/2n6）上，2%蔗糖，ph5.8，温度21-23℃，光照13h，2000lx进行生根培养；
（8）炼苗移栽：苗长到6-7cm，选根系诱导较好的苗开瓶炼苗5-7d，多菌灵液蘸根后移栽于基质中，1/8n6培养液喷施，逐天减湿炼苗，2周后移到温室内，成活后再移至大田正常栽培管理，收种，次年播种，喷施草丁膦检验转化效果，留用适用资源。
优选的，所述步骤2中愈伤组织诱导所用培养基为：n6＋2.0mg/l2，4－d+500mg/l脯氨酸+300mg/l水解酪蛋白＋1.0mg/lagno3＋30g/l蔗糖。
优选的，所述步骤3中愈伤组织增殖培养所用培养基为：n6＋1.0mg/l2，4－d+500mg/l脯氨酸+300mg/l水解酪蛋白＋0.5mg/lagno3＋30g/l蔗糖。
优选的，所述步骤4中抗草丁膦bar基因导入愈伤组织共培养所用培养基为：n6+500mg/l脯氨酸+300mg/l水解酪蛋白+30g/l蔗糖+20mg/l乙酰丁香酮。
优选的，所述步骤5中抗性愈伤组织的增殖培养所用培养基为：n6＋1.0mg/l2，4－d+500mg/l脯氨酸+300mg/l水解酪蛋白+500mg/l谷氨酰胺＋30g/l蔗糖。
优选的，所述步骤6中草丁膦培养筛选抗性愈伤组织所用的抗性选择培养基为：n6+1.0mg/l2.4-d+500mg/l脯氨酸+300mg/l水解酪蛋白+500mg/l谷氨酰胺+30g/l蔗糖+500mg/l头孢霉素+15mg/l草丁膦。
优选的，所述步骤7中抗草丁膦胚性愈伤组织的再分化所用的分化培养基为：n6+0.5mg/lnaa+3mg/l6-ba+500g/l脯氨酸+300mg/l水解酪蛋白+500mg/l谷氨酰胺＋30g/l蔗糖。
优选的，所述步骤8的基质由锯木屑、蛭石、河沙按体积比1：1：2混合组成。
本发明的优点是：
本发明通过多步科学精确的培养筛选，能够高效获得抗除草剂薏苡资源，其对抗除草剂具有较强的抗性，可较好的解除除草剂应用的顾忌，在薏苡种植过程中能够简化除草过程，提高劳动效率，增加经济产值，具有较好的推广使用价值。
具体实施方式
以下结合具体的实例对本发明的技术方案做进一步说明：
一种抗除草剂薏苡资源获取的方法，包括以下步骤：
1、无菌胚芽培养
去除总苞的薏苡种子经75%酒精浸泡2min，无菌水冲洗3次，无菌水纸床培养。发芽后0.1%升汞消毒8min，无菌水冲洗5～8次，切下胚芽，接于ms培养基无菌培养，温度（22±1）℃，光照强度2000lx。
2、愈伤组织诱导
芽长达3cm后，斜切薄片，转接于培养基（n6＋2.0mg/l2,4－d+500mg/l脯氨酸+300mg/l水解酪蛋白＋1.0mg/lagno3＋30g/l蔗糖）,ph5.8,温度（22±1）℃，光照13h,1200lx,出愈后原培养基继代2～3次。
3、愈伤组织增殖培养
继代2～3次后，接入培养基（n6＋1.0mg/l2,4－d+500mg/l脯氨酸+300mg/l水解酪蛋白＋0.5mg/lagno3＋30g/l蔗糖）,ph5.8,温度（22±1）℃，光照13h,1500lx,再次继代培养2～3次。
4、抗草丁膦bar基因导入愈伤组织共培养
将含有bar基因载体的农杆菌菌液培养过夜，用菌液稀释培养基（n6+500mg/l脯氨酸+300mg/l水解酪蛋白+30g/l蔗糖+20mg/l乙酰丁香酮）稀释光密度值至0.6～0.8，侵染薏苡的胚性愈伤组织15min，期间不停晃动，之后用滤纸吸干愈伤组织上多余的菌液，接入培养基（n6+500mg/l脯氨酸+300mg/l水解酪蛋白+30g/l蔗糖+20mg/l乙酰丁香酮）上暗培养2d，培养后的胚性愈伤组织用含有500mg/l头孢霉素的无菌水洗2次，用滤纸吸干水分。
5、抗性愈伤组织的增殖培养
接入培养基（n6＋1.0mg/l2,4－d+500mg/l脯氨酸+300mg/l水解酪蛋白+500mg/l谷氨酰胺＋30g/l蔗糖）,ph5.8,温度（22±1）℃，光照13h,1500lx,再次继代培养2～3次。
6、草丁膦培养筛选抗性愈伤组织
增殖后的愈伤组织转接抗性选择培养基（n6+1.0mg/l2.4-d+500mg/l脯氨酸+300mg/l水解酪蛋白+500mg/l谷氨酰胺+30g/l蔗糖+500mg/l头孢霉素+15mg/l草丁膦）,ph5.8,温度（22±1）℃，光照13h,1500lx,筛选培养。筛选3次。每15d继代1次。3轮选择后生长健旺的抗性愈伤组织，进行编号。
7、抗草丁膦胚性愈伤组织的再分化
编号后抗性愈伤组织转接分化培养基（n6+0.5mg/lnaa+3mg/l6-ba+500g/l脯氨酸+300mg/l水解酪蛋白+500mg/l谷氨酰胺＋30g/l蔗糖）进行分化培养，同时提取抗性愈伤组织系的dna，进行聚合酶链式反应（pcr）检测，统计转化率。胚性愈伤组织出现的绿点进一步分化出不定芽，待不定芽长到2～3cm，转接在生根培养基（1/2n6）上，2%蔗糖,ph5.8,温度（22±1）℃，光照13h,2000lx进行生根培养。
8、炼苗移栽
苗长到6、7cm，选根系诱导较好的苗开瓶炼苗5～7d，多菌灵液蘸根后移栽于基质（锯木屑、蛭石、河沙体积比1：1：2），1/8n6培养液喷施，逐天减湿炼苗，2周后移到温室内，成活后再移至大田正常栽培管理，收种。次年播种，喷施草丁膦检验转化效果，留用适用资源。