本发明涉及发酵领域，具体地涉及一种枯草芽孢杆菌的高密度发酵方法。
背景技术：
：枯草芽孢杆菌是在自然界广泛存在一种好氧的产芽孢杆菌。它具有很强的脂肪酶、蛋白酶、淀粉酶等活性，代谢旺盛，对人畜无害，不污染环境，在畜牧业饲料行业应用广泛。枯草芽孢杆菌是饲用微生态制剂的常用菌种之一，芽孢杆菌在成熟期以孢子状态存在，具有天然耐酸和耐胆盐等优点。枯草芽孢杆菌通过定植到目标动物肠道中，拮抗致病微生物，并产生多种消化酶及营养补充剂，产生有益代谢产物。所以枯草芽孢杆菌不仅可改善原料风味，更重要的是它可调节消化道健康，增强动物体的免疫功能，最终预防疾病的发生，达到促进目标动物生长和提高饲料转化率的目的，因而枯草芽孢杆菌被越来越多地研制成饲用微生态制剂。但目前的发酵培养方法，枯草芽孢杆菌的菌体不易繁殖、数量少，菌体密度低，出芽率低或出芽时间长，不利于产物积累。技术实现要素：本发明的目的是为了克服现有技术存在的上述问题，提供一种枯草芽孢杆菌的高密度发酵方法，采用本发明的方法进行枯草芽孢杆菌的培养，能够有效缩短出芽周期和发酵周期，提高发酵终点的菌体密度。为了实现上述目的，本发明提供了一种枯草芽孢杆菌的高密度发酵方法，该方法包括：将枯草芽孢杆菌接种至发酵培养基中进行发酵，其中，在枯草芽孢杆菌发酵的对数生长期，开始向所述发酵培养基中添加营养补充剂，所述营养补充剂含有酵母浸粉、葡萄糖和硫酸锰。优选地，在所述营养补充剂中，酵母浸粉的含量为0.01-0.5重量％，葡萄糖的含量为0.1-3重量％，硫酸锰的含量为0.005-0.1重量％。通过上述技术方案，即在枯草芽孢杆菌发酵的发酵对数生长期添加特定的营养补充剂，能够有效弥补枯草芽孢杆菌发酵过程中营养物不足和碳氮比不平衡的情况，从而利于枯草芽孢杆菌的菌体生长，且缩短了发酵周期，提高了枯草芽孢杆菌的菌体密度，同时菌体的出芽率在95％以上。因此，本发明的方法在不改变设备和反应条件等能耗的前提下，能够得到较高的菌体干重，从而提高了经济效益。具体实施方式以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。本发明提供了一种枯草芽孢杆菌的高密度发酵方法，该方法包括：将枯草芽孢杆菌接种至发酵培养基中进行发酵，其中，在枯草芽孢杆菌发酵的对数生长期，开始向所述发酵培养基中添加营养补充剂，所述营养补充剂含有酵母浸粉、葡萄糖和硫酸锰。优选地，在所述营养补充剂中，酵母浸粉的含量为0.01-0.5重量％，葡萄糖的含量为0.1-3重量％，硫酸锰的含量为0.005-0.1重量％。进一步优选地，在所述营养补充剂中，酵母浸粉的含量为0.1-0.3重量％，例如，可以为0.1重量％、0.13重量％、0.15重量％、0.18重量％、0.2重量％、0.22重量％、0.25重量％、0.28重量％、0.3重量％；葡萄糖的含量为0.2-1重量％，例如，可以为0.2重量％、0.3重量％、0.4重量％、0.5重量％、0.6重量％、0.7重量％、0.8重量％、0.9重量％、1重量％；硫酸锰的含量为0.02-0.04重量％，例如，可以为0.02重量％、0.025重量％、0.03重量％、0.035重量％、0.04重量％。尽管本发明只要在枯草芽孢杆菌的对数生长期向发酵培养基中添加如上所述的营养补充剂即可实现本发明的目的，但本发明的发明人发现，当在枯草芽孢杆菌的对数生长期，其发酵液的od值为2-6(例如，可以为2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6)时，一般在发酵开始4-7个小时后，开始向所述发酵培养基中添加所述营养补充剂，弥补菌体所需要的营养补充剂，有利于枯草芽孢杆菌的菌体生长，发酵终点菌体密度能够得到进一步提高，发酵时间进一步缩短，还能够在保证出芽率的同时缩短出芽周期。优选地，通过流加所述营养补充剂的方式将发酵培养基中的还原糖含量维持在0.3-1.0重量％，能够促进枯草芽孢杆菌的生长，缩短发酵周期，提高菌体密度。其中，所述还原糖的含量可以通过以一定的时间间隔对发酵液进行取样并通过费林试剂法进行测定获得，可根据实际的还原糖含量对发酵液进行稀释处理后测定还原糖浓度。本发明需要说明的是，在没有特别说明的情况下，本发明中所指的od值的测定方法为将取样得到的发酵液稀释合适的倍数后，使用紫外分光光度计测定od600nm，得到的od600nm数值与稀释倍数相乘得到发酵液的od值，也即，本文中所涉及的od值均为发酵液原液(未稀释前)的od值。根据本发明，所述营养补充剂的添加状态可以以固体状态添加，也可以以其水溶液的状态添加，优选情况下，以其水溶液的状态添加到所述发酵培养基中。其中，所述水溶液中各物质的含量可以按照如上所述进行设定。根据本发明，对所述营养补充剂的添加方式以及添加量没有特别的限制，例如，可以向所述发酵培养基中连续添加所述营养补充剂。当以连续添加的方式添加营养补充剂的水溶液，并优选使所述营养补充剂的水溶液中各组分的浓度在上述优选范围内，其流速的控制可以根据实际情况进行调整。通常情况下，以每升发酵培养基为基准，所述营养补充剂的流速为0.05-0.1l/h。或者，还可以分多次向所述发酵培养基中添加所述营养补充剂。当以分多次添加的方式加入营养补充剂时，所述营养补充剂的加入状态可以以固体的状态加入，也可以以其水溶液的状态加入，但通常以其水溶液的状态加入，并优选使所述营养补充剂水溶液中各组分的浓度在上述优选范围内，每次的添加量和相邻两次添加的间隔时间可以根据实际情况进行调整。通常情况下，以每升发酵培养基为基准，其每次的添加量为0.05-0.2l，相邻两次添加的时间间隔优选为1-2小时。本发明的发明人发现，由于以连续性的方法向发酵培养基中添加营养补充剂，可使发酵培养基中各营养组分的含量和比例控制在较好的水平内。因此，优选情况下，采用连续添加的方式向发酵培养基中添加所述营养补充剂。在本发明中，尽管可以一直添加所述营养补充剂直到发酵的终点，但通常当在发酵结束前的3-5小时，枯草芽孢杆菌正处于出芽期，发酵培养基中菌体繁殖量减少，所需营养也相应减少。因此，为了节省成本及操作时间，优选地，在发酵培养基中的枯草芽孢杆菌的芽孢率达到70-90％时，例如可以为70％、75％、80％、85％、90％以及任意两个值之间组成的任意范围，一般是在发酵结束前的3-5小时，停止添加所述营养补充剂。在发酵结束时，发酵液中的营养物能够得到充分的利用。在本发明中，可以以枯草芽孢杆菌的产芽孢率为基准定义发酵的终点，为了保证发酵后的芽孢率，以芽孢率达到95％以上作为发酵终点，具体的，可以使用显微镜观察取样发酵液中的菌体形态，以观测到芽孢作为产芽孢周期的起始点，在芽孢率达到95％以上时为产芽孢周期的结束点。根据本发明，对所述枯草芽孢杆菌进行发酵的条件可以按照本领域常规的方法进行，例如，所述发酵的温度为30-35℃，转速为200-600rpm。根据本发明，所述枯草芽孢杆菌的发酵培养基可以为本领域常规培养基，例如，可以为常规的lb培养基，而根据本发明一种优选的实施方式，所述发酵培养基含有葡萄糖、豆粕、酵母浸粉和硫酸锰。其中，葡萄糖、豆粕、酵母浸粉和硫酸锰的含量可以在较宽的范围内进行调整，但本发明的发明人发现，在枯草芽孢杆菌生长过程中添加适量的豆粕和硫酸锰能够使菌体健壮、出芽率高，且使用该菌体制备的饲用微生态制剂活性强、保存期长。因此，根据本发明一种优选的实施方式，在所述发酵培养基中，所述葡萄糖的含量为0.5-2重量％，所述豆粕的含量为0.5-2重量％，所述酵母浸粉的含量为0.1-1重量％，所述硫酸锰的含量为0.01-0.05重量％。在该优选的情况下，可以使得枯草芽孢杆菌快速的进入对数期，从而进一步缩短发酵周期。而在上述优选的培养基的条件下，在对数期向发酵培养基中添加上述营养补充剂，能够进一步提高枯草芽孢杆菌的生长、出芽特性。其中，优选的，所述发酵培养基的ph值为6.5-7.5(指灭菌前的ph值)。根据本发明，所述枯草芽孢杆菌的接种量可以在较宽的范围内改变，优选的情况下，枯草芽孢杆菌的接种量为0.05-2重量％。本发明发酵所使用的枯草芽孢杆菌可以为商购的固体制剂或枯草芽孢杆菌菌种，例如，获自安徽农业大学生命科学学院的枯草芽孢杆菌菌种，编号为951na4。所述枯草芽孢杆菌可以采用常规的方法接种，例如，在被接种至发酵培养基中之前，将所述枯草芽孢杆菌经过活化处理，之后将得到的种子液加入到发酵培养基中。枯草芽孢杆菌种子液的发酵终点可以通过od值进行监控，一般情况下，当种子液的od值达到2-6，优选4-5时停止培养。优选情况下，对所述枯草芽孢杆菌进行活化处理的方法包括：将枯草芽孢杆菌菌种接种到常规种子培养基(如lb培养基)中进行培养，所述菌种在种子培养基中的接种量可以为0.05-2重量％。根据本发明，所述枯草芽孢杆菌种子的培养条件可以在很大范围内改变，例如所述培养的条件可以包括：温度为30-35℃，转速为200-600rpm。根据本发明，当在枯草芽孢杆菌发酵生长的对数期，向发酵培养基中添加本发明的营养补充剂，相比于不添加营养补充剂，当到达发酵终点时，发酵时间大大缩短，发酵液中的菌体密度显著高于不添加营养补充剂的发酵液的菌体密度，提高量可达2-3个数量级。此外，流加营养补充剂还使得出芽周期明显缩短。由此可见，本发明的方法能够显著缩短发酵的时间以及提高发酵终点的发酵密度，还能够缩短出芽周期。以下将通过实施例对本发明进行详细描述。以下实施例中，发酵液的od值使用紫外分光光度计(722n，可见分光光度计)进行测定，具体的，将取样得到的发酵液稀释26倍后，使用紫外分光光度计测定od600nm，得到的od600nm数值与稀释倍数相乘得到发酵液的od值；发酵液的菌体密度以活菌数的形式表示，活菌数的测定根据gb26428-2010所记载的方法进行检测；还原糖的含量通过费林试剂法进行测定；枯草芽孢杆菌获自安徽农业大学生命科学学院的枯草芽孢杆菌菌种，编号为951na4；芽孢率可通过镜检、计数的方法计算得出。出芽周期为从镜检到芽孢开始到发酵结束为止的时间。制备例本制备例用于说明枯草芽孢杆菌种子液的制备将保存在超低温冰箱中枯草芽孢杆菌提前0.5h自然解冻，按照0.1重量％的接种量转接至活化一级种子摇瓶。在往复式摇瓶柜内30℃-32℃，转速120rpm。od600值长至2-6之间，结束培养，得到种子液。种子培养基：酵母粉0.5重量％，蛋白胨1重量％，葡萄糖0.5重量％，氯化钠1.0％，ph值为7.0左右。实施例1本实施例用于说明本发明提供的枯草芽孢杆菌的高密度发酵方法发酵培养基：葡萄糖1.0重量％，豆粕1.0重量％，硫酸锰0.02重量％，酵母浸粉0.5重量％，ph7.0左右，121℃灭菌20min。营养补充剂：酵母浸粉0.2重量％，葡萄糖0.5重量％，硫酸锰0.02重量％，121℃灭菌20min。将制备例得到的种子液按照0.2重量％的比例接种到发酵培养基中，在培养温度33℃-34℃，转速400rpm，ph7.00-7.20的条件下进行培养，并每隔2h取样监测发酵液的od值，并从第12h开始每隔0.5h取样镜检1次。当发酵液的od值达到3左右，开始流加营养补充剂。其中，以每升发酵培养基计，所述营养补充剂添加的流速为0.05-0.07l/h。在发酵培养基中的枯草芽孢杆菌的芽孢率达到85％左右时停止流加营养补充剂，并在芽孢率达到95％以上时停止发酵。记录出芽周期和发酵周期，并测定发酵结束时发酵液的菌体密度，结果见表1。实施例2本实施例用于说明本发明提供的枯草芽孢杆菌的高密度发酵方法发酵培养基：葡萄糖0.5重量％，豆粕2.0重量％，酵母浸粉1重量％，硫酸锰0.01重量％，ph7.0左右，121℃灭菌20min。营养补充剂：酵母浸粉0.1重量％，葡萄糖1重量％，硫酸锰0.01重量％，121℃灭菌20min。将制备例得到的种子液按照0.4重量％的比例接种到发酵培养基中，在培养温度30℃-31℃，转速300rpm，ph7.00-7.20的条件下进行培养，并每隔2h取样监测发酵液的od值，并从第12h开始每隔0.5h取样镜检1次。当发酵液的od值达到4左右时，开始流加营养补充剂。其中，以每升发酵培养基计，所述营养补充剂添加的流速为0.07-0.09l/h。在发酵培养基中的枯草芽孢杆菌的芽孢率达到85％左右时停止流加营养补充剂，并在芽孢率达到95％以上时停止发酵。记录出芽周期和发酵周期，并测定发酵结束时发酵液的菌体密度，结果见表1。实施例3本实施例用于说明本发明提供的枯草芽孢杆菌的高密度发酵方法发酵培养基：葡萄糖2重量％，豆粕0.5重量％，酵母浸粉0.1重量％，硫酸锰0.05重量％，ph7.0左右，121℃灭菌20min。营养补充剂：酵母浸粉0.3重量％，葡萄糖0.2重量％，硫酸锰0.04重量％，121℃灭菌20min。将制备例得到的种子液按照1重量％的比例接种到发酵培养基中，在培养温度34℃-35℃，转速600rpm，ph7.00-7.20的条件下进行培养，并每隔2h取样监测发酵液的od值，并从第12h开始每隔0.5h取样镜检1次。当发酵液的od值达到6左右时，开始流加营养补充剂。其中，以每升发酵培养基计，所述营养补充剂添加的流速为0.08-0.1l/h。在发酵培养基中的枯草芽孢杆菌的芽孢率达到85％左右时停止流加营养补充剂，并在芽孢率达到95％以上时停止发酵。记录出芽周期和发酵周期，并测定发酵结束时发酵液的菌体密度，结果见表1。实施例4本实施例用于说明本发明提供的枯草芽孢杆菌的高密度发酵方法按照实施例1的方法进行枯草芽孢杆菌的发酵，不同的是，所述营养补充剂含有酵母浸粉0.02重量％，葡萄糖2重量％，硫酸锰0.008重量％。记录出芽周期和发酵周期，并测定发酵结束时发酵液的菌体密度，结果见表1。实施例5本实施例用于说明本发明提供的枯草芽孢杆菌的高密度发酵方法按照实施例1的方法进行枯草芽孢杆菌的发酵，不同的是，所述营养补充剂含有酵母浸粉0.5重量％，葡萄糖0.15重量％，硫酸锰0.08重量％。记录出芽周期和发酵周期，并测定发酵结束时发酵液的菌体密度，结果见表1。实施例6本实施例用于说明本发明提供的枯草芽孢杆菌的高密度发酵方法按照实施例1的方法进行枯草芽孢杆菌的发酵，不同的是，所述发酵培养基为中的豆粕替换为等量的花生粕。记录出芽周期和发酵周期，并测定发酵结束时发酵液的菌体密度，结果见表1。对比例1本对比例用于说明参比的枯草芽孢杆菌的发酵方法按照实施例1的方法进行枯草芽孢杆菌的发酵，不同的是，不添加营养补充剂。记录出芽周期和发酵周期，并测定发酵结束时发酵液的菌体密度，结果见表1。对比例2本对比例用于说明参比的枯草芽孢杆菌的发酵方法按照实施例1的方法进行枯草芽孢杆菌的发酵，不同的是，所述营养补充剂的组成和发酵培养基相同。记录出芽周期和发酵周期，并测定发酵结束时发酵液的菌体密度，结果见表1。对比例3本对比例用于说明参比的枯草芽孢杆菌的发酵方法按照实施例1的方法进行枯草芽孢杆菌的发酵，不同的是，所述营养补充剂的添加时机为将枯草芽孢杆菌接种至发酵培养基中开始。记录出芽周期和发酵周期，并测定发酵结束时发酵液的菌体密度，结果见表1。表1编号16h活菌数cfu/ml出芽周期/h发酵周期/h最终活菌数cfu/ml实施例13.2*101111.018.04.1*1012实施例23.0*101111.518.03.8*1012实施例32.8*101111.518.53.5*1012实施例49.1*101012.019.55.3*1011实施例56.3*101012.019.04.0*1011实施例63.9*101012.519.53.1*1011对比例12.3*10720.024.02.9*109对比例25.1*10819.523.08.7*109对比例34.9*10819.022.56.2*1010通过表1的结果可以看出，由实施例1-6和对比例1-3的比较可以看出，在枯草芽孢杆菌发酵的对数生长期添加本发明的营养补充剂能够有效提高发酵终点的菌体密度，缩短出芽周期和发酵周期。由实施例1和实施例4-5的比较可以看出，在本发明优选的营养补充剂各组分的含量以及优选的添加时机加入所述营养补充剂，能够进一步提高发酵终点的菌体密度，缩短出芽周期和发酵周期。由实施例1和实施例6的比较可以看出，采用本发明优选的发酵培养基也能够进一步提高发酵终点的菌体密度，缩短出芽周期和发酵周期。以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型。包括各个具体技术特征以任何合适的方式进行组合。为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。但这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。当前第1页12