缺失型alpha-地中海贫血三重实时荧光定量PCR检测引物、探针和试剂盒的制作方法

本发明属于地中海贫血检测
技术领域：
，尤其涉及缺失型alpha-地中海贫血三重实时荧光定量pcr检测引物、探针和试剂盒。
背景技术：
：广西是我国地贫发病率和基因携带率最高的地区，最新调查显示，广西地贫的基因携带率是21％(alpha-地贫15.2％，belta-地贫5.8％)。地贫治疗困难，费用昂贵，对于大多数患者来说，倾其所有财富，却最多只能活到20岁，因此，地贫是广西亟待解决的重大民生问题。然而，当前广西地中海贫血的总发病率仍然高达0.2％，地中海贫血基因携带率仍然高达21％，说明目前使用的地中海贫血筛查方法存在不足，主要是：①不能检出静止型alpha-地中海贫血和轻型beta-地中海贫血；②只能检出常见型的地贫类型，不能检出非常见的地中海贫血。alpha-地贫的分子基础是位于16号染色体末端位点p13.3上的人alpha-珠蛋白基因(hba2和hba1)先天性遗传缺陷,从而使红细胞的主要结构蛋白(血红蛋白)生成障碍,并导致无效造血和红细胞破坏，而产生慢性溶血性贫血。alpha-地贫主要是由于alpha-珠蛋白基因缺失所致(90％以上),只有少数alpha-地贫是由于alpha-珠蛋白基因的点突变所致。据此将alpha-地贫分为两大类,即缺失型和非缺失型alpha-地贫。缺失型alpha-地贫的分子缺陷是包含alpha-珠蛋白基因在内的大片段基因缺失,其范围从几kb到100kb以上。非缺失型alpha-地贫突变的主要类型是发生在hba2或hba1结构基因或启动子区的点突变,导致加工异常、抑制转录或使翻译产物不稳定。正常人两条染色体上共有4个alpha-珠蛋白基因。不同类型的缺失型alpha-地贫患者,体内缺失的alpha-珠蛋白基因数目各不相同,缺失的alpha-珠蛋白基因越多,病情越严重。技术实现要素：本发明要解决的技术问题是提供一种缺失型alpha-地中海贫血三重实时荧光定量pcr检测引物、探针和试剂盒。为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：缺失型alpha-地中海贫血三重实时荧光定量pcr检测引物、探针，包括分别针对hba、cre、hbz基因的三组引物和探针，它们分别具有以下碱基序列：缺失型alpha-地中海贫血三重实时荧光定量pcr检测引物、探针，探针hbapbr102、探针crepb186r-joe、探针hbzpbr9413-cy5的5’端分别标记有荧光报告基团fam、joe、cy5，其3’端分别标记有荧光淬灭基团bhq1、bhq1、bhq3。缺失型alpha-地中海贫血三重实时荧光定量pcr检测试剂盒，包括实时荧光定量pcr反应液、dna聚合酶、检测引物和检测探针；检测引物和检测探针是分别针对hba、cre、hbz基因的三组引物和探针，它们分别具有以下碱基序列：探针hbapbr102、探针crepb186r-joe、探针hbzpbr9413-cy5的5’端分别标记有荧光报告基团fam、joe、cy5，其3’端分别标记有荧光淬灭基团bhq1、bhq1、bhq3。上述alpha-地中海贫血三重实时荧光定量pcr检测试剂盒在pcr扩增反应中的应用。pcr扩增反应的体系为：反应体系总体积25μl，引物终浓度400nm，探针终浓度200nm；其中，主反应液(mastermix)组成为：引物探针mix(pmix)组成为：pcr扩增反应的程序为：95℃，5min；45个循环×(95℃，10s；60℃，45s)。针对非常见的地中海贫血缺乏有效检测手段的问题，发明人根据hba、cre、hbz基因序列，设计并制备了缺失型alpha-地中海贫血三重实时荧光定量pcr检测引物、探针，包括分别针对hba、cre、hbz基因的三组引物和探针，它们分别具有序列表seq.id.no.1至seq.id.no.9的碱基序列。据此，发明人还研制了相应试剂和并建立相应基于taqman探针的三重荧光pcr检测非常见缺失型alpha-地中海贫血的方法。试验结果显示，正常样本的判定值位于0.9-1.1之间，3个α基因拷贝的判定值位于0.65-0.85之间，2个α基因拷贝的判定值位于0.4-0.6之间，1个α基因拷贝的判定值位于0.15-0.35之间。表明设计的引物和探针特异性强、体系的优化效果也较佳，能辨别出不同α基因的拷贝数，具有灵敏度高、特异性强、结果可靠的特点，是一种理想的大规模探索广西常见和非常见的缺失型alpha-地中海贫血基因的方法，从而弄清广西非常见的缺失型alpha-地贫基因突变的基因谱和基因突变频率，为广西调整地贫防治策略、降低地贫患儿的出生提供科学依据。附图说明图1是应用本发明进行pcr扩增hba、cre和hbz基因的结果图。具体实施方式一、研究设计该研究拟建立一个高通量高灵敏度的三重实时荧光定量pcr检测方法，能用于大规模探索非常见的缺失型alpha-地中海贫血基因，利用正常人和缺失型突变者alpha-珠蛋白基因(hba2、hba1)拷贝数不同，同步检测hba2、hba1和内参基因，根据2-△△ct原理，相对定量hba2、hba1的基因拷贝数，从而检测hba2、hba1的基因缺失或基因叠加。由于hba2和hba1具有高度的同源性，作为一个初筛试验，同时测定hba2和hba1是不必要的。在本发明中，仅测定hba2和hba1的共同特征基因片段hba，这种改变会减少多重pcr体系的复杂性。此外，先前一直有关于hbz造成地贫缺失的报道，为了提高筛查试验检出非常见缺失型alpha-地贫基因突变的能力，加入了hbz基因。这样不仅能检出常见的缺失类型，而且能检出非常见的缺失类型。研究通过设计hba、hbz和参比基因crebp的引物和探针，建立三重taqman实时荧光定量pcr检测体系，为在广西全区大规模筛查缺失型alpha-地贫基因突变，进行流行病学调查提供有力工具。二、引物和探针的设计和合成通过ncbi上下载相关序列，通过blast功能保证引物序列的准确性，再用abi的primerexpress3.0软件设计引物和taqman探针，委托深圳优圣康生物科技有限公司设计，所有引物探针均在life公司合成，引物和探针序列见表1。表1荧光pcr引物和探针序列其中，探针hba，cre，hbz的5’端分别标记有荧光报告基团fam，joe，cy5；hba，cre的3’端均标记有荧光淬灭基团bhq1，hbz的3’端标记有荧光淬灭基团bhq3。三、三重实时荧光定量pcr检测方法1、操作步骤：1)对样本进行前处理：通过细胞分离液分离白细胞，尽可能去除红细胞或其碎片；2)提取dna：采用分离液分离白细胞以后提取dna，提取的dna测定浓度后稀释至2ng/μl；3)使用针对hba，cre，hbz基因的引物和探针，与实时荧光定量pcr扩增用的反应液及dna聚合酶混合形成扩增反应体系；pcr扩增反应的体系为：反应体系总体积25μl，引物终浓度400nm，探针终浓度200nm；其中，主反应液(mastermix)组成为：引物探针mix(pmix)组成为：4)将扩增反应体系在荧光pcr仪上进行实时荧光pcr反应(程序为95℃，5min；45个循环×(95℃，10s；60℃，45s)，反应结束后，根据探针标记的荧光报告基团记录的荧光信号，读取并记录各检测样品的pcr扩增循环次数(ct)；5)根据各样品的ct值，按照建立的判定值2-△△ct来判定基因的缺失，实现缺失型α-地贫的快速筛查。2、结果判定标准判定值是2-△△ct，如果2-△△ct＝1±0.1，为正常样本；2-△△ct＝0.75±0.1，为3个α基因拷贝；2-△△ct＝0.5±0.1，为2个α基因拷贝；2-△△ct＝0.25±0.1，为1个α基因拷贝。四、实施例先将600μl白细胞分离液加到2ml离心管底部，缓慢加入200μl临床人血液样本：edta抗凝，4℃保存不超过7天，加到分离液面上层，离心8000rpm，10min，通过白细胞分离液分离白细胞。从上到下吸取直至中间透明的白细胞层。避免吸到下层分离液层。加600μl红细胞裂解液裂解红细胞。放冰上5min。离心机8000rpm，10min。加蛋白酶k20μl，裂解液180μl。震荡混匀。让白细胞充分重悬，消化。56℃孵育大于15min，95℃孵育1h。实验结果显示，dna提取过程中，95℃处理1h的步骤不可或缺，无论哪种前处理，缺少这一步，结果大受影响。震荡混匀，瞬时离心机离心。加结合液200μl，震荡混匀。再加200μl无水乙醇。震荡混匀，瞬时离心机离心。加到离心柱中，8000rpm离心，1min。倒掉底部废液，加500μl洗液1，8000rpm离心，1min。加500μl洗脱液2，离心8000rpm，1min。倒掉底部废液。8000rpm离心，3min。开盖烘干2min左右，挥发乙醇，换新的离心柱底座，加洗脱液100μl，静置2min。8000rpm离心，1min。这样就提取出所需dna，用于荧光pcr扩增。实时荧光扩增体系：反应体系25μl，模板dna5μl、pcr反应液16.5μl、引物探针混合液3μl(包括hba，cre，hbz的探针3条，hba，cre，hbz的引物各2条)、dna聚合酶0.5μl。实时荧光pcr反应参数为：95℃，5min；45个循环×(95℃，10s；60℃，45s)。结果与分析1、取正常临床样本检测，采用分离液分离白细胞后提取dna，提取的dna测定浓度后稀释至2ng/μl。结果如表2和表3所示，表2是hba拷贝数测定，表3是hbz拷贝数测定，可以看出，经本实施例的实时荧光pcr扩增ct值，判定值得结果偏差可以满足检测要求：0.9±0.1，具有较好的分辨性。表2hba拷贝数测定表3hbz拷贝数测定2、取地贫临床样本检测，采用分离液分离白细胞后提取dna，提取的dna测定浓度后稀释至2ng/μl。样本信息如表4所示：表4样本信息序号hbahbz1207-1异常3拷贝1207-21207-31207-41207-51207-6异常2拷贝1207-71207-81207-91207-10检测结果如表5所示。表5检测结果表6结果分析如表5和表6所示，使用hbz作为hba的内控时，阴性样本的判定值标准偏差较以cre为内控时稍小些。结果与标准分子检测结果相符。3、方法验证13份全血样本全部做了分子检测(gappcr)，hba的拷贝数如表7：表7样本拷贝数样本编号hba拷贝数113233271303383512574614724752782794804hbz基因只有点突变样本，无基因缺失样本，不适用此检测。样本提取：取200ul全血白细胞分离液分离白细胞，红细胞裂解液洗涤一次后提取dna。qpcr检测2平行/样本。检测结果如表8：表8检测结果结果显示，在已分离白细胞提取dna的前提下，以cre和hbz作为内控，3拷贝hba样本结果差异较大。以hbz为内控，能够较好的分辨3拷贝和4拷贝hba样本(判定值均值<0.85为阳性)。阴性样本的参考值均值均落在0.9至1.1之间，符合检测结果的质控要求。综上，当以hbz为内控时，阳性预期值为0～0.89(2平行结果均值)，阴性预期值为0.9～1.1。阳性符合率(灵敏度)为100％，阴性符合率(特异性)为100％。当以cre为内控时，阳性预期值为0～0.89(2平行结果均值)，阴性预期值为0.9～1.1。阳性符合率(灵敏度)为75％(6/8)，阴性符合率(特异性)为100％(5/5)。结论与讨论血液中含有血红蛋白，免疫球蛋白等大量的pcr抑制物，纯化过程中抑制物去除不彻底，可能会影响pcr的结果，如ct值，荧光信号强度等。实际测试中发现简易的提取方法得到的dna会影响靶标的ct值。有趣的是，不同的靶标，这种影响存在较大的差异，而且这种差异是独立存在的。比如，hba，hbz和cre三个基因的扩增子中，cre扩增子受到的影响较小，而hba和hbz扩增子(特别是前者)影响非常显著。而且无论单重还是多重体系，结果是一致的，与靶标之间的相互干扰无关。dna纯度越高，抑制性越小，ct值越接近对照，而荧光增量没有显著变化。值得注意的是，这种抑制和酶活似乎没有关系，影响仅仅表现为ct值的退后。推测某种dna调控因子会与hb基因结合而影响其扩增。为了减小抑制物对靶标扩增的影响，首先采取将白细胞(或细胞核)从血液中分离出来再进行提取的方式，最大限度的去除血液中的干扰物。其次，在裂解过程中加入95℃孵育1h的步骤，也大大降低了扩增干扰。具体的，采用细胞分离液(密度梯度离心法)加细胞裂解液洗涤白细胞沉淀，hba扩增受到的影响明显降低。系统误差的影响：由于ct值的判定与多种因素相关，存在一定的系统误差，选择合适的仪器和质控品也至关重要。目前测试的仪器为abi7500，不同通道的荧光相对强弱及孔位差异都可能或影响结果，目前我们在试剂中加入了rox染料做矫正，并选择多个正常样本的ct值平均值作为参考值，在一定程度上可以减小系统偏差的影响，而每个样本的检测需至少做两个平行，减小系统误差的影响。在实际检测中，需要对仪器的全孔位(或代表孔)做重复性测试，比如将阴性参考品(正常样本)的检测管放置在96孔板的四周及中间的孔位中，以了解仪器不同孔位的偏差有多大。内控的选择：由于干扰物对hba和hbz的扩增影响显著高于对cre的扩增，用hbz作为内控，其对结果的影响会减小。实际检测中，以hbz作为内控时，检测效果明显优于以cre为内控。序列表<110>右江民族医学院<120>缺失型alpha-地中海贫血三重实时荧光定量pcr检测引物、探针和试剂盒<160>9<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1tctcctgccgacaagaccaa20<210>2<211>19<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2agggcctccgcaccatact19<210>3<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3ccgaccttaccccaggcggcc21<210>4<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>4ctgggccagtatatccccagt21<210>5<211>23<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>5ccatcaactcagccttccaaagt23<210>6<211>16<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>6cccaccgcgcccggcc16<210>7<211>19<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>7ctgcctgaggtcggtgtca19<210>8<211>19<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>8agaggagcagggcccagta19<210>9<211>22<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>9cctcctgggaccaagccccacg22当前第1页12