一种从矮生二裂委陵菜中提取的α-葡萄糖苷酶抑制剂的制作方法

本发明涉及中药技术领域，具体地说是一种从矮生二裂委陵菜中提取的α-葡萄糖苷酶抑制剂及其提取方法和应用。

背景技术：

糖尿病是21世纪最严重的世界健康疾病之一，给人类带来了极大的危害。α-糖苷酶抑制剂类药物是目前常用的降糖药物，但合成的该类药物有较多副作用，对人体造成了不同程度的损伤。从天然植物中提取分离的降糖活性成分毒性小，同时还有较好的降糖作用。从天然植物中提取分离降糖活性成分有助于开发新药及促进天然植物的开发利用。

矮生二裂委陵菜（Potentilla bifurca var. Humilior R）系蔷薇科（Rosaceae）委陵菜属（Potentilla）植物，植株矮小铺散，花茎长不及 7 厘米，小叶通常 3-5 对，稀 6 对，多全缘，偶顶端 2 裂，花常单生，花果期 5-10 月。产于青海、甘肃、宁夏、新疆、四川及西藏等地，生于海拔1800 - 4000 m 山坡草地、河滩沙地及干旱草原。《全国中草药汇编》记载其性甘、微辛、凉，主治止血、止痢，用于功能性子宫出血、产后出血过多、痢疾等。现代研究表明本属植物的化学成分涉及黄酮、三萜、鞣质、有机酸等，药理研究表明本属植物主要有降血糖、抗菌、抗肿瘤、抗氧化、抗癌、抗脑缺血损伤、抗过敏、抗病毒、保肝、治疗骨质疏松、镇痛等作用。矮生二裂委陵菜单体化合物有较高的α-葡萄糖苷酶抑制活性为首次发现。α-葡萄糖苷酶（α-glucosidase ，AG）是一类分布于小肠上皮黏膜微绒毛膜表面的双糖水解酶，包括麦芽糖酶、异麦芽糖酶、蔗糖酶和海藻糖酶等。该酶能使摄入人体的双糖转变为易于人体吸收的单糖，对糖的分解代谢具有重要作用。α-葡萄糖苷酶抑制剂是一种降低餐后血糖的治疗糖尿病的药物，通过与AG发生竞争性抑制，达到降低餐后血糖的目的。

现有技术存在问题：目前最常用的α-葡萄糖苷酶抑制剂降糖药物阿卡波糖可有效控制糖尿病，降低血糖，但其适用人群有限，不适用于以肉类，蛋类等高蛋白高脂肪食物为主食的人群，同时因其在小肠内分解及吸收缓慢，停留时间延长，经肠道细菌的酵解而产气增多，可引起腹胀、腹痛及腹泻等，而且阿卡波糖的价格较高，不适用于较低收入人群。其他降糖药物也有着不同程度的副作用及社会问题。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题在于提供从矮生二裂委陵菜中提取的α-葡萄糖苷酶抑制剂。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

一种从矮生二裂委陵菜中提取的α-葡萄糖苷酶抑制剂，所述抑制剂为1-O-香豆酰基-β-D-葡萄糖（1-O-coumaroyl-β-D-glucose）。该α-葡萄糖苷酶抑制剂采用α-葡萄糖苷酶体外活性测定方法，进行酶抑制活性的测定，结果显示：在样品浓度为2.5mg/mL时，1-O-香豆酰基-β-D-葡萄糖（1-O-coumaroyl-β-D-glucose）的α-葡萄糖苷酶抑制率为99.41%，IC50为0.0019mg/mL。

一种从矮生二裂委陵菜中提取的α-葡萄糖苷酶抑制剂，所述抑制剂为：杨梅素（myricetin），该α-葡萄糖苷酶抑制剂采用α-葡萄糖苷酶体外活性测定方法，进行酶抑制活性的测定，结果显示：在样品浓度为1.25mg/mL时，杨梅素（myricetin）的α-葡萄糖苷酶抑制率为90.67%，IC50为0.0561mg/mL。

一种从矮生二裂委陵菜中提取的α-葡萄糖苷酶抑制剂，所述抑制剂为：银椴苷（tiliroside），该α-葡萄糖苷酶抑制剂采用α-葡萄糖苷酶体外活性测定方法，进行酶抑制活性的测定，结果显示：在样品浓度为1.25mg/mL时，银椴苷（tiliroside）的α-葡萄糖苷酶抑制率为87.38%，IC50为0.1807mg/mL。

一种从矮生二裂委陵菜中提取的α-葡萄糖苷酶抑制剂，所述抑制剂为：儿茶素（(+)-catechin），该α-葡萄糖苷酶抑制剂采用α-葡萄糖苷酶体外活性测定方法，进行酶抑制活性的测定，结果显示：在样品浓度为1.25mg/mL时，儿茶素（(+)-catechin）的α-葡萄糖苷酶抑制率为96.52%，IC50为0.0652mg/mL。

一种从矮生二裂委陵菜中提取的α-葡萄糖苷酶抑制剂，所述抑制剂为：槲皮素-3-O-(6''-O-反式-对羟基桂皮酰基)-β-D-葡萄糖苷（quercetin-3-O-(6''-O-trans-p-coumaroyl)-β-D-glucoside），该α-葡萄糖苷酶抑制剂采用α-葡萄糖苷酶体外活性测定方法，进行酶抑制活性的测定，结果显示：在样品浓度为1.25mg/mL时，槲皮素-3-O-(6''-O-反式-对羟基桂皮酰基)-β-D-葡萄糖苷（quercetin-3-O-(6''-O-trans-p-coumaroyl)-β-D-glucoside）的α-葡萄糖苷酶抑制率为92.06%，IC50为0.0498mg/mL。

一种从矮生二裂委陵菜中提取的α-葡萄糖苷酶抑制剂，所述抑制剂为：槲皮素（quercetin），该α-葡萄糖苷酶抑制剂采用α-葡萄糖苷酶体外活性测定方法，进行酶抑制活性的测定，结果显示：在样品浓度为1.25mg/mL时，槲皮素（quercetin）的α-葡萄糖苷酶抑制率为88.16%，IC50为0.2095mg/mL。

一种从矮生二裂委陵菜中提取的α-葡萄糖苷酶抑制剂，所述抑制剂为：皱褶菌素A甲酯（methyl ester of rugosin A），该α-葡萄糖苷酶抑制剂采用α-葡萄糖苷酶体外活性测定方法，进行酶抑制活性的测定，结果显示：在样品浓度为2.5mg/mL时，皱褶菌素A甲酯（methyl ester of rugosin A）的α-葡萄糖苷酶抑制率为97.77%，IC50为0.0004mg/mL。

一种从矮生二裂委陵菜中提取的α-葡萄糖苷酶抑制剂，所述抑制剂为：(-)-表儿茶素（(-)-epicatechin），该α-葡萄糖苷酶抑制剂采用α-葡萄糖苷酶体外活性测定方法，进行酶抑制活性的测定，结果显示：在样品浓度为2.5mg/mL时，(-)-表儿茶素（(-)-epicatechin）的α-葡萄糖苷酶抑制率为103.29%，IC50为0.2087mg/mL。

一种从矮生二裂委陵菜中提取的α-葡萄糖苷酶抑制剂，所述抑制剂为：3,5,7-三羟基-4'-甲氧基黄酮（3,5,7-trihydroxy-4'-methoxyflavone），该α-葡萄糖苷酶抑制剂采用α-葡萄糖苷酶体外活性测定方法，进行酶抑制活性的测定，结果显示：在样品浓度为0.625mg/mL时，3,5,7-三羟基-4'-甲氧基黄酮（3,5,7-trihydroxy-4'-methoxyflavone）的α-葡萄糖苷酶抑制率为91.98%，IC50为0.0019mg/mL。

附图说明

图1是α-葡萄糖苷酶抑制剂提取工艺流程图；

图2是1-O-香豆酰基-β-D-葡萄糖（1-O-coumaroyl-β-D-glucose）结构示意图；

图3是杨梅素（myricetin）结构示意图；

图4是银椴苷（tiliroside）结构示意图；

图5是儿茶素（(+)-catechin）结构示意图；

图6是槲皮素-3-O-(6''-O-反式-对羟基桂皮酰基)-β-D-葡萄糖苷（quercetin-3-O-(6''-O-trans-p-coumaroyl)-β-D-glucoside）结构示意图；

图7是槲皮素（quercetin）结构示意图；

图8是皱褶菌素A甲酯（methyl ester of rugosin A）结构示意图；

图9是(-)-表儿茶素（(-)-epicatechin）结构示意图；

图10是3,5,7-三羟基-4'-甲氧基黄酮（3,5,7-trihydroxy-4'-methoxyflavone）结构示意图。

具体实施方法

本发明专利下述实施例中使用方法和装置，如无特殊说明，均为常规方法和装置；所用器材、试剂均为试剂公司购买的常规器材和试剂。为使本发明专利的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合具体实施例对本发明专利的具体实施方式进行详细说明。这些优选实施方式的示例在具体实施例中进行了例示。

在此，还需要说明的是，为了避免因不必要的细节而模糊了本发明专利的技术方案，在实施例中仅仅示出了与根据本发明专利的方案密切相关的技术方案和/或处理步骤，而省略了关系不大的其他细节。

实施例1

本实施例提供一种从矮生二裂委陵菜中提取的α-葡萄糖苷酶抑制剂，所述抑制剂为1-O-香豆酰基-β-D-葡萄糖（1-O-coumaroyl-β-D-glucose），其化学结构如附图2所示。该α-葡萄糖苷酶抑制剂采用α-葡萄糖苷酶体外活性测定方法，进行酶抑制活性的测定，结果显示：在样品浓度为2.5mg/mL时，1-O-香豆酰基-β-D-葡萄糖（1-O-coumaroyl-β-D-glucose）的α-葡萄糖苷酶抑制率为99.41%，IC50为0.0019mg/mL。

实施例2

本实施例提供一种从矮生二裂委陵菜中提取的α-葡萄糖苷酶抑制剂，所述抑制剂为：杨梅素（myricetin），该α-葡萄糖苷酶抑制剂采用α-葡萄糖苷酶体外活性测定方法，进行酶抑制活性的测定，结果显示：在样品浓度为1.25mg/mL时，杨梅素（myricetin）的α-葡萄糖苷酶抑制率为90.67%，IC50为0.0561mg/mL，其化学结构如附图3所示。

实施例3

本实施例提供一种从矮生二裂委陵菜中提取的α-葡萄糖苷酶抑制剂，所述抑制剂为：银椴苷（tiliroside），该α-葡萄糖苷酶抑制剂采用α-葡萄糖苷酶体外活性测定方法，进行酶抑制活性的测定，结果显示：在样品浓度为1.25mg/mL时，银椴苷（tiliroside）的α-葡萄糖苷酶抑制率为87.38%，IC50为0.1807mg/mL，其化学结构如附图4所示。

实施例4

本实施例提供一种从矮生二裂委陵菜中提取的α-葡萄糖苷酶抑制剂，所述抑制剂为：儿茶素（(+)-catechin），该α-葡萄糖苷酶抑制剂采用α-葡萄糖苷酶体外活性测定方法，进行酶抑制活性的测定，结果显示：在样品浓度为1.25mg/mL时，儿茶素（(+)-catechin）的α-葡萄糖苷酶抑制率为96.52%，IC50为0.0652mg/mL，其化学结构如附图5所示。

实施例5

本实施例提供一种从矮生二裂委陵菜中提取的α-葡萄糖苷酶抑制剂，所述抑制剂为：槲皮素-3-O-(6''-O-反式-对羟基桂皮酰基)-β-D-葡萄糖苷（quercetin-3-O-(6''-O-trans-p-coumaroyl)-β-D-glucoside），该α-葡萄糖苷酶抑制剂采用α-葡萄糖苷酶体外活性测定方法，进行酶抑制活性的测定，结果显示：在样品浓度为1.25mg/mL时，槲皮素-3-O-(6''-O-反式-对羟基桂皮酰基)-β-D-葡萄糖苷（quercetin-3-O-(6''-O-trans-p-coumaroyl)-β-D-glucoside）的α-葡萄糖苷酶抑制率为92.06%，IC50为0.0.0498mg/mL，其化学结构如附图6所示。

实施例6

本实施例提供一种从矮生二裂委陵菜中提取的α-葡萄糖苷酶抑制剂，所述抑制剂为：槲皮素（quercetin），该α-葡萄糖苷酶抑制剂采用α-葡萄糖苷酶体外活性测定方法，进行酶抑制活性的测定，结果显示：在样品浓度为1.25mg/mL时，槲皮素（quercetin）的α-葡萄糖苷酶抑制率为88.16%，IC50为0.2095mg/mL，其化学结构如附图7所示。

实施例7

本实施例提供一种从矮生二裂委陵菜中提取的α-葡萄糖苷酶抑制剂，所述抑制剂为：皱褶菌素A甲酯（methyl ester of rugosin A），该α-葡萄糖苷酶抑制剂采用α-葡萄糖苷酶体外活性测定方法，进行酶抑制活性的测定，结果显示：在样品浓度为2.5mg/mL时，皱褶菌素A甲酯（methyl ester of rugosin A）的α-葡萄糖苷酶抑制率为97.77%，IC50为0.0004mg/mL，其化学结构如附图8所示。

实施例8

本实施例提供一种从矮生二裂委陵菜中提取的α-葡萄糖苷酶抑制剂，所述抑制剂为：(-)-表儿茶素（(-)-epicatechin），该α-葡萄糖苷酶抑制剂采用α-葡萄糖苷酶体外活性测定方法，进行酶抑制活性的测定，结果显示：在样品浓度为2.5mg/mL时，(-)-表儿茶素（(-)-epicatechin）的α-葡萄糖苷酶抑制率为103.29%，IC50为0.2087mg/mL，其化学结构如附图9所示。

实施例9

本实施例提供一种从矮生二裂委陵菜中提取的α-葡萄糖苷酶抑制剂，所述抑制剂为：3,5,7-三羟基-4'-甲氧基黄酮（3,5,7-trihydroxy-4'-methoxyflavone），该α-葡萄糖苷酶抑制剂采用α-葡萄糖苷酶体外活性测定方法，进行酶抑制活性的测定，结果显示：在样品浓度为0.625mg/mL时，3,5,7-三羟基-4'-甲氧基黄酮（3,5,7-trihydroxy-4'-methoxyflavone）的α-葡萄糖苷酶抑制率为91.98%，IC50为0.0019mg/mL，其化学结构如附图10所示。

实施例10

本实施例提供一种从矮生二裂委陵菜中提取的α-葡萄糖苷酶抑制剂的提取方法，如附图1所示，包括如下步骤：

（1）实验准备：原料及辅料：矮生二裂委陵菜、硅胶板（薄层用）、硅胶（柱色谱用）、Sephadex LH-20（25-100μm）、MCI CHP-20P（75-100μm）、展开剂为（苯：甲酸乙酯：甲酸）三相溶液；显色剂为10% 的硫酸乙醇溶液和1% 三氯化铁乙醇溶液（其中显色剂为分析纯配制）、蒸馏水、甲醇、石油醚、乙酸乙酯、其他。主要设备：600MHz核磁共振仪、Auto Spec-3000 质谱仪、R1002旋转蒸发仪、SHZ-D（Ⅲ）循环水式真空泵、ARA520电子分析天平、ALC-210.3电子分析天平、BS-100A自动接收仪、BCD-215KA海尔冰箱、Newstyle HPLC、粉粹机、真空泵、旋转蒸发器、冷凝循环水泵、D101树脂柱、Sephadex LH-20、MCI-gel CHP-20P、RP-18、HPLC。

（2）提取与萃取：一种从矮生二裂叶委陵菜全草中提取的α-葡萄糖苷酶抑制剂，所述的抑制剂是从矮生二裂叶委陵菜全草中提取获得；该抑制剂通过如下步骤制成：取矮生二裂叶委陵菜全草，粉碎，用95% 甲醇，65℃回流提取，提取液浓缩回收甲醇后得浸膏。浸膏按照极性大小分别用石油醚和乙酸乙酯进行萃取，得石油醚部位、乙酸乙酯部位和水层提取部位；

（3）柱层析分离：取乙酸乙酯部位用水溶解分散后用乙醚进一步萃取，得到乙醚层，水层；所得水层用D101柱以0%-30%-60%-80%-100%甲醇水溶液洗脱，得到水洗脱物、30% 甲醇洗脱物、60%甲醇洗脱物、80% 甲醇洗脱物、100% 甲醇洗脱物；取乙酸乙酯部位乙醚萃取后水层80% D101甲醇洗脱物经Sephadex LH-20柱层析，以水-甲醇（1:0-0:1）每10% 浓度递增进行梯度洗脱，得到7个部分，取07部分经MCI柱层析，以水-甲醇（1:0-0:1）每10% 浓度递增进行梯度洗脱后得到20部分（1.3 g），经Sephadex LH-20柱层析，以水-甲醇（1:0-0:1）每10%浓度递增进行梯度洗脱后得到部分21（87 mg），再采用MCI柱层析，以水-甲醇（1:0-0:1）每10% 浓度递增进行梯度洗脱后得到化合物1-O-香豆酰基-β-D-葡萄糖（1-O-coumaroyl-β-D-glucose），即为α-葡萄糖苷酶抑制剂。其他8种化合物提取方法如附图1所示。

（4）糖苷酶抑制活性验证：该α-葡萄糖苷酶抑制剂采用α-葡萄糖苷酶体外活性测定方法，进行酶抑制活性的测定。具体测定方法如下：

AG抑制剂筛选模型原理：AG催化水解PNPG生成对硝基酚（PNP），PNP在400 nm波长下具有吸收峰，测定PNG的产出量，计算矮生二裂委陵菜单体化合物对AG的抑制活性。

酶的抑制活性测定用全自动酶标仪，反应在不可拆96孔板中进行。反应体系为200 μL：在125 μL磷酸缓冲液和8.92×10^-3 mol/L的PNPG 25 μL中加入浓度为1.953×10^-2 mg/mL的样品25 μL和0.05 U/mL的AG 25 μL后37℃温浴20 min，采用全自动酶标仪于400 nm波长下测定吸光度，并用蒸馏水代替酶液作空白对照。每个样品做3次重复试验，取其平均值。

AG活力单位定义：在37℃ pH 6.8条件下，每分钟内酶水解PNPG释放PNG的量（OD值）。抑制剂活力单位定义：在相同条件下降低1个酶活力单位所需的抑制剂的量。

为了消除样品和底物PNPG对测定结果的影响，需要测定样品和底物的背景吸收值。用0.05 mol/mL的磷酸盐缓冲液代替样品和底物进行校正。

抑制率（%）= [(A1-A3)-(A2-A4)]/(A1-A3)

A1：原有的酶活力；A2：加入抑制剂后的酶活力；A3：PNPG背景；A4：样品背景

结果显示：在样品浓度为2.5mg/mL时，1-O-香豆酰基-β-D-葡萄糖（1-O-coumaroyl-β-D-glucose）的α-葡萄糖苷酶抑制率为99.41%，IC50为0.0019 mg/mL。

在样品浓度为1.25mg/mL时，杨梅素（myricetin）的α-葡萄糖苷酶抑制率为90.67%，IC50为0.0561mg/mL。

在样品浓度为1.25mg/mL时，银椴苷（tiliroside）的α-葡萄糖苷酶抑制率为87.38%，IC50为0.1807mg/mL。

在样品浓度为1.25mg/mL时，儿茶素（(+)-catechin）的α-葡萄糖苷酶抑制率为96.52%，IC50为0.0652 mg/mL。

在样品浓度为1.25mg/mL时，槲皮素-3-O-(6''-O-反式-对羟基桂皮酰基)-β-D-葡萄糖苷（quercetin-3-O-(6''-O-trans-p-coumaroyl)-β-D-glucoside）的α-葡萄糖苷酶抑制率为92.06%，IC50为0.0498 mg/mL。

在样品浓度为1.25mg/mL时，槲皮素（quercetin）的α-葡萄糖苷酶抑制率为88.16%，IC50为0.2095 mg/mL。

在样品浓度为2.5mg/mL时，皱褶菌素A甲酯（methyl ester of rugosin A）的α-葡萄糖苷酶抑制率为97.77%，IC50为0.0004 mg/mL。

在样品浓度为2.5mg/mL时，(-)-表儿茶素（(-)-epicatechin）的α-葡萄糖苷酶抑制率为103.29%，IC50为0.2087 mg/mL。

在样品浓度为0.625mg/mL时，3,5,7-三羟基-4'-甲氧基黄酮（3,5,7-trihydroxy-4'-methoxyflavone）的α-葡萄糖苷酶抑制率为91.98%，IC50为0.0019 mg/mL。

有益效果：

本发明α-葡萄糖苷酶抑制剂抑制率高，是从天然植物中提取，提取工艺简便、安全，获得的α-葡萄糖苷酶抑制剂效果优良，为制备新型的降血糖活性药物提供依据，可为降低糖尿病餐后血糖提供一种潜在的药物。其关键技术为α-葡萄糖苷酶抑制剂药物的提取方法和筛选，方法合理，最终筛选出对α-葡萄糖苷酶有显著抑制效果的单体化合物。另外本发明筛选出的抑制剂可用于以抑制α-葡萄糖苷酶为目的的产品的研发，尤其可用于降低糖尿病餐后血糖药物的开发，具有产业化意义。

本申请中的α-葡萄糖苷酶抑制剂是从青藏高原分布比较广泛的一种天然植物矮生二裂委陵菜中提取的，是一种单体化合物，纯度高，抑制率高，提取工艺简便、安全，获得的α-葡萄糖苷酶抑制剂的α-葡萄糖苷酶抑制活性为首次发现，且抑制效果优良，可为制备新型的降血糖活性药物提供依据，该发明可为降低糖尿病餐后血糖的药物。

以上所述仅是本申请的具体实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本申请的保护范围。