一种检测多环芳烃暴露人群氧化应激损伤后的长链非编码RNA及其引物和试剂盒的制作方法

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种检测多环芳烃暴露人群氧化应激损伤后的长链非编码rna及其引物和试剂盒。

背景技术：

多环芳烃是煤，石油，木材，烟草，有机高分子化合物等有机物不完全燃烧时产生的挥发性碳氢化合物，是重要的环境和食品污染物，广泛分布于环境中，与日常工作和生活息息相关。除了我们所熟知的致癌、致突变以及致心血管损伤外，长期接触多环芳烃可使体内氧化应激水平增加。

8-羟基脱氧鸟苷是一种重要的dna氧化损伤的生物标志物，8-异前列腺素-f2α则是脂质过氧化的可靠生物标志物结合，这两者可用来代表人体的氧化应激水平。长期接触多环芳烃的暴露人群会出现8-羟基脱氧鸟苷和8-异前列腺素-f2α的增高，因此对氧化应激损害进行快速、准确的诊断具有重要的临床意义。

lncrna是基因转录组的重要组成部分，其长度大于200个核苷酸，且不具有蛋白质编码功能。lncrna广泛表达于免疫细胞中，参与免疫细胞分化与活化，通过激活或抑制转录因子，调节信使核糖核酸和微小rna(microrna)的稳定性，从而参与多种疾病发生。lncrna通常会形成较为稳定的二级结构，为在血浆中检测lncrna提供了可能性，通过检测外周血循环系统中异常表达的lncrna有望成为某些疾病的早期诊断依据，具有潜在的临床价值。

综上所述，目前有必要探寻新的有效的非编码rna作为多环芳烃暴露人群氧化应激损伤检测的标记物，为诊断多环芳烃暴露人群氧化应激损伤提供依据。

技术实现要素：

针对上述现有技术的不足，本发明提供一种检测多环芳烃暴露人群氧化应激损伤后的长链非编码rna及其引物和试剂盒，可以快速检测出与多环芳烃暴露人群氧化应激损伤的风险的相关lncrna，结果准确可靠。

本发明提供的技术方案：一种基于微滴式数字pcr定量检测多环芳烃暴露人群氧化应激损伤后的长链非编码rna，所述长链非编码rna为enst00000542697，所述enst00000542697的核酸序列如seqidno:1所示。

一种长链非编码rna在检测多环芳烃暴露人群氧化应激期损伤的分子标志物中的用途。

一种引物，用于检测多环芳烃暴露人群氧化应激损伤的enst00000542697的长链非编码rna表达水平，enst00000542697的上游引物核苷酸序列为：5'-aaatgggctaacactgaaagaacc-3'，下游引物核苷酸序列为：5'-cctgccgaggcttggattac-3'。

一种检测多环芳烃暴露人群氧化应激损伤的试剂盒，包含上述的引物。

一种检测多环芳烃暴露人群氧化应激损伤的试剂盒，所述试剂盒还包括内参基因β-actine的引物和探针序列、enst00000542697的探针序列；

内参基因β-actine的上游引物序列：5’-catcctcaccctgaagta-3’，

内参基因β-actine的下游引物序列：5’-aggtctcaaacatgatctg-3’，

内参基因β-actine的探针序列：5’-acggcatcgtcaccaactgg-3’，hex荧光基团，bhq淬灭基团；

enst00000542697的探针序列：

5'-tgcagaatctcagcaacgtcacagagg-3'，fam荧光基团，

bhq淬灭基团。

所述检测多环芳烃暴露人群氧化应激损伤的试剂盒，还包括反转录所需试剂：反转录缓冲液、dntp混合液、rna酶蛋白质抑制剂、反转录酶和无核酸酶纯水。

所述的检测多环芳烃暴露人群氧化应激损伤的试剂盒，其特征在于还包括微滴式数字pcr所需的下列试剂：微滴式数字pcr预混液，无核酸酶纯水，微滴分析专用油，微滴发生专用油。

一种基于微滴式数字pcr定量检测多环芳烃暴露人群氧化应激损伤后的非编码rna分子标志物的方法，所述检测方法包括以下步骤：

(1)收集多环芳烃暴露人群及对照人群的静脉血，分离血浆，进行芯片扫描；

(2)以步骤(1)中血浆进行提取总rna，以总rna为扩增模板逆转成cdna，采用所述检测试剂盒中的引物，然后基于微滴式数字pcr扩增lncrnaenst00000542697与β-actine；

(3)读取和分析步骤(2)中微滴式数字pcr反应扩增结果，得到lncrnaenst00000542697与β-actine的拷贝数，得到非编码rna分子标志物的表达水平。

所述的基于微滴式数字pcr定量检测多环芳烃暴露人群氧化应激损伤后的非编码rna分子标志物的方法，所述步骤(2)中血浆总rna采用血浆mirna提取试剂盒进行提取。(qiagen公司的血浆mirna提取试剂盒)。

所述的基于微滴式数字pcr定量检测多环芳烃暴露人群氧化应激损伤后的非编码rna分子标志物的方法，步骤(2)中逆转录的反应体系如下：总rna12ul，5x缓冲液4ul，rna酶抑制剂(20u/ul)1ul，10mmdntp2ul，逆转录酶(200u/ul)1ul，共20ul体系，混匀后，逆转录反应程序如下：25℃，5min；42℃，6min；70℃，5min；

步骤(2)中微滴式数字pcr的反应体系如下：2×pcr预混液10μl、lncrnaenst00000542697上游引物浓度20μmol/μl1μl、lncrnaenst00000542697下游引物浓度20μmol/μl1μl、lncrnaenst00000542697探针20μmol/μl0.5μl(fam)，β-actine上游引物20μmol/μl1μl，β-actine下游引物浓度20μmol/μl1μl、β-actine探针20μmol/μl0.5μl(hex)，扩增模板3μl，补水至20μl，微滴式数字pcr的反应程序如下：a)预变性：95℃，10min；b)40个循环：95℃，15s；60℃，1min。

所述试剂盒能够通过检测血浆中lncrnaenst00000542697表达水平来诊断多环芳烃暴露人群是否有氧化应激损伤。

本发明具有如下优点：(1)本发明提供的分子标记可以快速检测出与多环芳烃暴露人群氧化应激损伤的风险的相关lncrna，及早评估人群在多环芳烃暴露的情况下氧化应激的严重程度。(2)本方法使用微滴式数字pcr定量检测中相关lncrna的方法，可以检测血浆中极低量的rna，结果准确可靠。(3)多环芳烃暴露人群相关lncrna的检出，发现在多环芳烃暴露的情况下对人群的氧化应激严重程度，为及时采取相关措施提供科学依据。

附图说明

图1：差异lncrna筛选。

图2为血浆lncrnaenst00000542697表达筛选，12对多环芳烃暴露人群与对照人群，匹配年龄、性别和吸烟状态。

图3为尿总多环芳烃与血浆lncrnaenst00000542697的箱式图，在403位多环芳烃工作者中，测试了尿总多环芳烃与血浆lncrnaenst00000542697，尿总多环芳烃按从小到大划分成五个分位，各组进行两两比较的方差分析，用星号(*)表示有统计学差异，且两个指标均以自然对数为底进行转换。

图4-a为血浆lncrnaenst00000542697与8-羟基脱氧鸟苷，图4-b为血浆lncrnaenst00000542697与8-异前列腺素-f2α，与氧化应激各指标(8-羟基脱氧鸟苷和8-异前列腺素-f2α)的散点图和线性拟合回归，在403位多环芳烃工作者中，测试了血浆lncrnaenst00000542697且enst00000542697以10为底进行对数转换,氧化应激各指标均以自然对数为底进行转换。

图5是本发明的试剂盒的示意图；

图中：1—试剂盒外盒包装，2—enst00000542697上游引物序列，3—enst00000542697下游引物序列，4—enst00000542697探针序列，fam荧光基团，bhq淬灭基团；5—内参β-actine上游引物序列；6—内参β-actine下游引物序列；7—内参β-actine探针序列，hex荧光基团，bhq淬灭基团；8—反转录试剂盒；9—微滴式数字pcr所需要的相关试剂。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步的说明。具体实施方式应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作和/或它们的组合。术语解释：lncrnaenst00000542697：长链非编码核糖核酸enst00000542697，通过ucsc网站提供的命名方式进行命名，enst代表其命名来自数据库ensemble，后面的数字是来自于该数据库中的id。

一种基于微滴式数字pcr定量检测多环芳烃暴露人群氧化应激损伤后的长链非编码rna，所述长链非编码rna为enst00000542697，所述enst00000542697的核酸序列如seqidno:1所示。

一种长链非编码rna在检测多环芳烃暴露人群氧化应激期损伤的分子标志物中的用途。

一种引物，用于检测多环芳烃暴露人群氧化应激损伤的enst00000542697的长链非编码rna表达水平，enst00000542697的上游引物核苷酸序列为：5'-aaatgggctaacactgaaagaacc-3'，下游引物核苷酸序列为：5'-cctgccgaggcttggattac-3'。

一种检测多环芳烃暴露人群氧化应激损伤的试剂盒，包含上述的引物。

一种检测多环芳烃暴露人群氧化应激损伤的试剂盒，所述试剂盒还包括内参基因β-actine的引物和探针序列、enst00000542697的探针序列；

内参基因β-actine的上游引物序列：5’-catcctcaccctgaagta-3’，

内参基因β-actine的下游引物序列：5’-aggtctcaaacatgatctg-3’，

内参基因β-actine的探针序列：5’-acggcatcgtcaccaactgg-3’，hex荧光基团，bhq淬灭基团；

enst00000542697的探针序列：

5'-tgcagaatctcagcaacgtcacagagg-3'，fam荧光基团，

bhq淬灭基团。

所述检测多环芳烃暴露人群氧化应激损伤的试剂盒，还包括反转录所需试剂：反转录缓冲液、dntp混合液、rna酶蛋白质抑制剂、反转录酶和无核酸酶纯水。

所述的检测多环芳烃暴露人群氧化应激损伤的试剂盒，其特征在于还包括微滴式数字pcr所需的下列试剂：微滴式数字pcr预混液，无核酸酶纯水，微滴分析专用油，微滴发生专用油。

实验对象与诊断方法

(1)实验对象纳入与排除标准：发现与验证阶段的人群来源于2010年湖北省某焦化厂多环芳烃暴露的员工。a)发现阶段：选择多环芳烃高暴露和对照的个体各12名进行芯片筛选，匹配年龄、性别和吸烟状态。b)验证阶段：选择了403名焦化厂员工进行微滴式数字pcr验证。

(2)测定方法：使用高效液相色谱法对尿8-羟基脱氧鸟苷进行测定；使用酶联免疫吸附试剂盒测定尿8-异前列腺素-f2α。

试剂盒

在本发明的一个典型实施方式中，提供了检测lncrnaenst00000542697的试剂盒在制备用于诊断多环芳烃暴露人群氧化应激损伤产品中的应用，lncrnaenst00000542697高表达与氧化应激损伤的发生发展相关，结果如图3和图4。

所述产品为试剂盒(图5)，包括lncrnaenst00000542697和β-actine的正向引物、反向引物和探针。检测体系包括反转录反应体系和微滴式数字pcr反应体系，所述检测试剂盒包括用于配制反转录反应体系的试剂和用于配制微滴式数字pcr反应体系的试剂。所述配制反转录反应体系的试剂和用于配制微滴式数字pcr反应体系的试剂等均通过购买得到。enst00000542697的正向引物5'-aaatgggctaacactgaaagaacc-3'，反向引物5'-cctgccgaggcttggattac-3'和探针序列5'-tgcagaatctcagcaacgtcacagagg-3'(fam荧光基团，bhq淬灭基团)。内参β-actine正向引物5’-catcctcaccctgaagta-3’，反向引物5’-aggtctcaaacatgatctg-3’和探针序列5’-acggcatcgtcaccaactgg-3’(hex荧光基团，bhq淬灭基团)。

lncrnaenst00000542697的核酸序列seqidno:1:

agagggccctcttggagtcagaccacctaggttcaaattctggatcctgcttccggctcctttcctctgtcccccttctcccctcggtgccctccaaccagtgggcctgggaaagcgtgttcatgctggaaatgcctgcccagcccttgcccagtcacacagagcaagtgccccagaaatgtcctgaacctcagtttactgaggggaaactaagaaccttctggctacagctcttgggctgagcagggattaggctcgggtctgcgatcccaggccctgcggcctcccagaggcttggttgagagctctggctctcactcccccacctccacccagcacctgccccggtccaggctcaccccctacccctccacctggtcagtggtggctcggcctcctctcagcccctccacccctcctggctgtacacaccctcaagctaacggaattcaaactggtggaggaaggcctgccctgtccctcccagcccctgcctctccctccctactcccagcctcactggaccactttcaagtcctccagtgctccaggctccatcttcatgcctccaggcctttgcacgtgctggtccctctcccattctcctggttaactcctccacctccatccgagctaggatcttcccctggagagtgtcccggttagcactaccccacaacacacacacacaccgacatacacgccccacatcacagggaccacatcccacacaggcacagacacactgcatgacgcagatcacaggcacaaaggtgcatgcgtgcacacatacacactcccactccatatgccaatacacttatccccctactcccacatcacacagacggttccacacactcctcacacgctctggccacacagtaaacacacacagaccacagagctcatgtctgggctgccctggtgccctcctctgggctcgtgcccccagcctcagcatttaccccccattgagggcagggacccacccagctccgttttcctccatttcagctcagggccctgcaccaagtctctcccagttgttgcttggacccggactcctcccacagtcaccactgtcacagtcccacctccttcaaggtctcaaacacccctcccctgtttctggcaggagccgtcctcactccctctattgcctctccagacccagacttcaccctcaggtcaccctcacctggactttggggtgccccacaccccgccccaggccctggcctctggaatatttggaaacttgaactgggccagaggcttaagctcacatctgtctggagcctcaactttctcctctgtaaaatgggctaacactgaaagaaccttgcagaatctcagcaacgtcacagaggacattgttagcacagccagcgggctcctgctgggctgagtttgtgggtaatccaagcctcggcaggtacagttcctccctcaggtgagtgttccacccccaagtgagcatcctgctgcccttcctgcaaatcaggcccctgggacacttagtgctgagccttgggggtggggtatttgatcggggttcctgacaagtggctgggttgtctgttccctctcttcagagggagcctccatgggtggcctgggctcacatcggctcctccagtccagcagagcacccccccctggctgcccagcttgttgagagaacttgctgagcaggacagtgagcccttcctggtggggaaccggaatcaggagaagacagaggggaggtggcaggccccaggatggagggagggcagctgagctgcctgccctcatcctccctgcccttcaggtattagggcccttcccatggcccagtaggaacccagcggctcacctgagcccggactaaggatggggcattttaccccatatgcagagatgagaaacagaggcccaaggagggaagggactgaacacagggtggaacagccctgggctgcgcctgtgtttccatccgccttcctcctgcctgtgctcgagtcacgtgctggtgtgcagggaacaggaagacagccgctgccctcacaggctcagggtctagcagagtccacagtgaccacaggcgaataaacaaaggcagtgagacagaggtgggcaaggagaggtgctgggatggggagcaagggggtacccatgctcatgggtatgaacacatggacccatatacccatatgtatgtcccagagtttcttccagaacttttttttttttcccaagacagagtcttgttctgtagcccaagctggaggttgcagtgagccgagatggcgccactgcactccagcctgggcgacagagcgagactctgtctcaa。

实施例1

1)本发明通过人类8x60klncrna芯片(康成生物)检测，筛选得到lncrnaenst00000542697能够作为多环芳烃暴露人群氧化应激损伤诊断标志物，收集多环芳烃暴露人群及对照人群的静脉血(每组各12例)，分离血浆，进行芯片扫描；

2)在大样本人群中(392人)，以步骤1)中血浆进行提取总rna，以总rna为扩增模板逆转成cdna，然后基于微滴式数字pcr扩增lncrnaenst00000542697与β-actine；

3)读取和分析步骤2)中微滴式数字pcr反应扩增结果，得到lncrnaenst00000542697与β-actine的拷贝数；

4)构建lncrnaenst00000542697与氧化应激各指标的箱式图、散点图以及线性拟合回归。

步骤1)中lncrnaenst00000542697的筛选方法是由康城生物公司的通过人类8x60klncrna芯片扫描后，进行go分析和pathyway分析挑选出与氧化应激相关的lncrna，再按照归一化强度平均值≥9(两组之间归一化强度的平均值)，倍数变化≥8，fdr(错误发现率)<0.05，选出lncrnaenst00000542697。

所述步骤2)中血浆总rna采用血浆mirna提取试剂盒进行提取。具体为qiagen公司的血浆mirna提取试剂盒。

步骤2)中所述逆转录反应体系如下：总rna12ul，5x缓冲液4ul，rna酶抑制剂(20u/ul)1ul，10mmdntp2ul，逆转录酶(200u/ul)1ul，共20ul体系。混匀后，逆转录反应程序如下：25℃，5min；42℃，6min；70℃，5min。

步骤2)中所述微滴式数字pcr的反应体系如下：2×pcr预混液10μl、lncrnaenst00000542697上游引物(20μmol/μl)1μl、的lncrnaenst00000542697下游引物浓度(20μmol/μl)1μl、lncrnaenst00000542697探针(20μmol/μl)0.5μl(fam)，β-actine上游引物(20μmol/μl)1μl，β-actine下游引物浓度(20μmol/μl)1μl、β-actine探针(20μmol/μl)0.5μl(hex)，扩增模板3μl，补水至20μl。微滴式数字pcr的反应程序如下：a)预变性：95℃，10min；b)40个循环：95℃，15s；60℃，1min。

人群验证结果

1.统计学分析：

所有资料均经过统一培训的人员录入整理后，建立数据库，使用spss20软件(spssinc.,usa)进行统计分析。使用1-samplek-s检验对连续变量进行正态性检验，采用均数±标准误表示连续型变量的分布，采用方差分析多组连续型变量的组间差异。使用多元线性回归分析尿总多环芳烃对lncrna的影响以及lncrna与氧化应激的关系，并且通过散点图、箱式图和线性拟合回归来判断诊断能力。所有统计分析均为双侧检验，p＜0.05为差异具有统计学意义。

2.结果：

(1)芯片检测结果：

在12对匹配样本中，分层聚类分析图(图1)可以清楚地鉴别差异性表达的lncrna，统计出差异表达的mrna共1567个，与对照组相比，多环芳烃暴露人群高暴露组中表达量上调的lncrna有805个，表达量下调的lncrna有1234个。lncrnaenst00000542697在高暴露组的表达比对照组显著降低，p<0.05，如图2所示。

(2)微滴式数字pcr验证lncrnaenst00000542697表达：

i)尿总多环芳烃与lncrnaenst00000542697的箱式图。

图3，以连续型变量尿总多环芳烃划分为五分位作为自变量，以enst00000542697为因变量构建各组的箱式图，并进行两两比较的方差分析，用星号(*)表示有统计学差异。结果发现随着尿总多环芳烃的分位数增加，enst00000542697表达水平下降。分别与尿总多环芳烃的第一、三和四分位组相比，其第五分位组(最高浓度组)的enst00000542697表达量更低，且有统计学意义(p<0.05)。

以上结果发现随着尿总多环芳烃的分位数增加，enst00000542697表达量均有所下降。

ii)lncrnaenst00000542697与氧化应激各指标的散点图和拟合线性回归。

图4中的(a)，以enst00000542697为自变量、以8-羟基脱氧鸟苷为因变量构建散点与拟合线性回归图。随着enst00000542697的增加，8-羟基脱氧鸟苷降低。

图4中的(b)，以enst00000542697为自变量、以8-异前列腺素-f2α为因变量构建散点与拟合线性回归图。随着enst00000542697的增加，8-异前列腺素-f2α降低。

结果发现随着enst00000542697的增加，氧化应激指标(8-羟基脱氧鸟苷与8-异前列腺素-f2α)降低。

综上所述，结果表明随着尿总多环芳烃暴露含量增加，其lncrna表达量降低，氧化应激都会增加，结果表明lncrna在尿总多环芳烃暴露对氧化应激指标增加的关联中产生影响。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何属于本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求的保护范围为准。

序列表

<110>华中科技大学

<120>一种检测多环芳烃暴露人群氧化应激损伤后的长链非编码rna及其引物和试剂盒

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>2341

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

agagggccctcttggagtcagaccacctaggttcaaattctggatcctgcttccggctcc60

tttcctctgtcccccttctcccctcggtgccctccaaccagtgggcctgggaaagcgtgt120

tcatgctggaaatgcctgcccagcccttgcccagtcacacagagcaagtgccccagaaat180

gtcctgaacctcagtttactgaggggaaactaagaaccttctggctacagctcttgggct240

gagcagggattaggctcgggtctgcgatcccaggccctgcggcctcccagaggcttggtt300

gagagctctggctctcactcccccacctccacccagcacctgccccggtccaggctcacc360

ccctacccctccacctggtcagtggtggctcggcctcctctcagcccctccacccctcct420

ggctgtacacaccctcaagctaacggaattcaaactggtggaggaaggcctgccctgtcc480

ctcccagcccctgcctctccctccctactcccagcctcactggaccactttcaagtcctc540

cagtgctccaggctccatcttcatgcctccaggcctttgcacgtgctggtccctctccca600

ttctcctggttaactcctccacctccatccgagctaggatcttcccctggagagtgtccc660

ggttagcactaccccacaacacacacacacaccgacatacacgccccacatcacagggac720

cacatcccacacaggcacagacacactgcatgacgcagatcacaggcacaaaggtgcatg780

cgtgcacacatacacactcccactccatatgccaatacacttatccccctactcccacat840

cacacagacggttccacacactcctcacacgctctggccacacagtaaacacacacagac900

cacagagctcatgtctgggctgccctggtgccctcctctgggctcgtgcccccagcctca960

gcatttaccccccattgagggcagggacccacccagctccgttttcctccatttcagctc1020

agggccctgcaccaagtctctcccagttgttgcttggacccggactcctcccacagtcac1080

cactgtcacagtcccacctccttcaaggtctcaaacacccctcccctgtttctggcagga1140

gccgtcctcactccctctattgcctctccagacccagacttcaccctcaggtcaccctca1200

cctggactttggggtgccccacaccccgccccaggccctggcctctggaatatttggaaa1260

cttgaactgggccagaggcttaagctcacatctgtctggagcctcaactttctcctctgt1320

aaaatgggctaacactgaaagaaccttgcagaatctcagcaacgtcacagaggacattgt1380

tagcacagccagcgggctcctgctgggctgagtttgtgggtaatccaagcctcggcaggt1440

acagttcctccctcaggtgagtgttccacccccaagtgagcatcctgctgcccttcctgc1500

aaatcaggcccctgggacacttagtgctgagccttgggggtggggtatttgatcggggtt1560

cctgacaagtggctgggttgtctgttccctctcttcagagggagcctccatgggtggcct1620

gggctcacatcggctcctccagtccagcagagcacccccccctggctgcccagcttgttg1680

agagaacttgctgagcaggacagtgagcccttcctggtggggaaccggaatcaggagaag1740

acagaggggaggtggcaggccccaggatggagggagggcagctgagctgcctgccctcat1800

cctccctgcccttcaggtattagggcccttcccatggcccagtaggaacccagcggctca1860

cctgagcccggactaaggatggggcattttaccccatatgcagagatgagaaacagaggc1920

ccaaggagggaagggactgaacacagggtggaacagccctgggctgcgcctgtgtttcca1980

tccgccttcctcctgcctgtgctcgagtcacgtgctggtgtgcagggaacaggaagacag2040

ccgctgccctcacaggctcagggtctagcagagtccacagtgaccacaggcgaataaaca2100

aaggcagtgagacagaggtgggcaaggagaggtgctgggatggggagcaagggggtaccc2160

atgctcatgggtatgaacacatggacccatatacccatatgtatgtcccagagtttcttc2220

cagaacttttttttttttcccaagacagagtcttgttctgtagcccaagctggaggttgc2280

agtgagccgagatggcgccactgcactccagcctgggcgacagagcgagactctgtctca2340

a2341