糖基转移酶变体及其应用的制作方法

[0001]
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及糖基转移酶变体及其应用。


背景技术：

[0002]
环糊精糖基转移酶(又称环糊精糖苷转移酶或糊精葡聚糖转移酶e.c.2.4.1.19)通过催化分子内转糖基作用可将淀粉或类淀粉多糖转化为环糊精。多数环糊精糖基转移酶同时具有对淀粉糖苷键及其他多糖的
ɑ-糖苷键降解活性以及对糖苷转移活性。这使得环糊精糖基转移酶不仅用于淀粉工业与环糊精的生产，同时也被用于某些糖苷类衍生化化合物的合成。
[0003]
有许多菌属种均被发现能够产生环糊精糖苷转移酶，包括芽孢杆菌属、短杆菌属、梭菌属、棒状杆菌属等。不同环糊精糖苷转移酶对于淀粉糖苷键的降解活性、环化催化活性及糖苷转移酶活性则各有不同。其中，来自于嗜热地衣芽孢杆菌(geobacillus stearothermophilus)的环糊精糖基转移酶具备催化淀粉环化成
ɑ-环糊精和β-环糊精能力(appl.environ.microbiol.1992，58(12),4016-4025)，同时该酶还具备较好的热稳定性，因而具备良好的工业应用价值。同时，嗜热地衣芽孢杆菌的环糊精糖基转移酶可催化维生素c(又称l-抗坏血酸)的c-2位置上的羟基通过转糖基作用糖基化生成2-o-α-d-吡喃葡萄糖基抗坏血酸或2-o-α-d-多糖糖基抗坏血酸。其中2-o-α-d-吡喃葡萄糖基抗坏血酸，又称抗坏血酸葡萄糖苷、vc糖苷、维c葡糖苷、维生素c葡萄糖苷、l-抗坏血酸-2-葡萄糖苷，是一种在美妆、保健、护肤领域中是一种公认的美白、护肤、抗衰老的功效成分。
[0004]
日本专利(公开号：no.183,492/91)中公开了利用多糖糖苷转移酶(包括环糊精糖基转移酶)催化抗坏血酸与α-糖苷多糖(包括淀粉、糊精)合成2-o-α-d-吡喃葡萄糖基抗坏血酸的技术方案。
[0005]
中国专利(公布号cn104531629a)中公开了利用嗜热地衣芽孢杆菌no2(geobacillus stearothermophilus no2)的环糊精葡萄糖基转移酶酶促合成2-o-α-d-吡喃葡萄糖基抗坏血酸，同时其公开了该酶的三种突变体，包括在228位赖氨酸突变为精氨酸(k228r)，及第367位天冬氨酸突变为突变成丝氨酸(d367s)，以及228位与367位的双突变体(k228r/d367s)。
[0006]
维生素c(简称为vc)，化学名称l-抗坏血酸，是一种水溶性维生素，由于人体自身无法合成，主要通过膳食获得。vc进入人体后参与多种生理活动，在促进和维持人体健康方面起到重要的作用。此外，vc作用于皮肤可以起到美白抗氧化和促进胶原蛋白合成的功效。但是vc本身的化学结构不稳定，尤其是c-2位置上的羟基非常容易受到温度、ph及一些金属离子影响而发生氧化还原反应使其失去功效。这大大限制了vc的应用，所以如何在保持vc生理活性的同时增加其稳定性成为需要解决的问题。
[0007]
vc衍生物是解决这一问题的有效手段。2-o-α-d-吡喃葡萄糖基抗坏血酸(2-o-α-d-吡喃葡萄糖基抗坏血酸)是一种vc的糖类衍生物，与其他vc衍生物相比，2-o-α-d-吡喃葡萄糖基抗坏血酸是天然存在的，更安全；与vc相比，2-o-α-d-吡喃葡萄糖基抗坏血酸对温
度、ph及金属离子等具有更强的耐受性，具有非还原活性使其在水溶液中稳定，更方便配方，在糖苷酶的作用下水解释放出vc，可以持续发挥功效，起到缓释同时避免短时过量供用。所以，2-o-α-d-吡喃葡萄糖基抗坏血酸是vc的最佳替代品。
[0008]
目前2-o-α-d-吡喃葡萄糖基抗坏血酸合成的主要方式是酶法转化，用的主要酶为环糊精糖基转移酶。但是现有环糊精糖基转移酶对vc底物转化效率不高，添加大量的酶不利于2-o-α-d-吡喃葡萄糖基抗坏血酸的工业化生产。


技术实现要素：

[0009]
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供糖基转移酶变体及其应用，该突变体具有更高的糖基转移催化活力，特别适用于工业化生产2-o-α-d-吡喃葡萄糖基抗坏血酸或其他糖苷化合物。
[0010]
本发明提供了bacillus stearothermophilus no2菌株cgt酶的突变体，其含有如下突变中的至少一个：r45h、k229r、f256v、v352i、a546v、n593e。
[0011]
本发明所述的cgt酶的原始氨基酸序列如seq id no:1所示。
[0012]
所述突变体为在如seq id no:1所示氨基酸序列的45位r突变为h(氨基酸序列如seq id no:6)；
[0013]
所述突变体为在如seq id no:1所示氨基酸序列的229位k突变为r(氨基酸序列如seq id no:8)；
[0014]
所述突变体为在如seq id no:1所示氨基酸序列的256位f突变为v(氨基酸序列如seq id no:10)；
[0015]
所述突变体为在如seq id no:1所示氨基酸序列的352位v突变为i(氨基酸序列如seq id no:12)；
[0016]
所述突变体为在如seq id no:1所示氨基酸序列的546位a突变为v(氨基酸序列如seq id no:14)；
[0017]
所述突变体为在如seq id no:1所示氨基酸序列的593位n突变为e(氨基酸序列如seq id no:16)；
[0018]
所述突变体为在如seq id no:1所示氨基酸序列的45位r突变为h，且229位k突变为r(氨基酸序列如seq id no:18)；
[0019]
所述突变体为在如seq id no:1所示氨基酸序列的45位r突变为h，且256位f突变为v(氨基酸序列如seq id no:20)；
[0020]
所述突变体为在如seq id no:1所示氨基酸序列的45位r突变为h、229位k突变为r，且256位f突变为v(氨基酸序列如seq id no:22)；
[0021]
所述突变体为在如seq id no:1所示氨基酸序列的45位r突变为h、229位k突变为r、256位f突变为v，且593位n突变为e(氨基酸序列如seq id no:24)；
[0022]
所述突变体为在如seq id no:1所示氨基酸序列的45位r突变为h、229位k突变为r、256位f突变为v、352位v突变为i，且593位n突变为e(氨基酸序列如seq id no:26)；
[0023]
所述突变体为在如seq id no:1所示氨基酸序列的45位r突变为h、229位k突变为r、256位f突变为v、352位v突变为i、546位a突变为v，且593位n突变为e(氨基酸序列如seq id no:28)。
[0024]
氨基酸序列如seq id no：6、8、10、18、20、22、24、26、28所示的突变体，相对酶活性更高，转化率可达50％以上。
[0025]
本发明还提供了编码本发明所述突变体的dna分子。
[0026]
本发明所述的dna分子的核苷酸序列如seq id no:5、7、9、17、19、21、23、25、27所示。
[0027]
具体的，编码seq id no:6所示突变体的dna分子的核苷酸序列如seq id no:5所示。
[0028]
编码seq id no:8所示突变体的dna分子的核苷酸序列如seq id no:7所示。
[0029]
编码seq id no:10所示突变体的dna分子的核苷酸序列如seq id no:9所示。
[0030]
编码seq id no:12所示突变体的dna分子的核苷酸序列如seq id no:11所示。
[0031]
编码seq id no:14所示突变体的dna分子的核苷酸序列如seq id no:13所示。
[0032]
编码seq id no:16所示突变体的dna分子的核苷酸序列如seq id no:15所示。
[0033]
编码seq id no:18所示突变体的dna分子的核苷酸序列如seq id no:17所示。
[0034]
编码seq id no:20所示突变体的dna分子的核苷酸序列如seq id no:19所示。
[0035]
编码seq id no:22所示突变体的dna分子的核苷酸序列如seq id no:21所示。
[0036]
编码seq id no:24所示突变体的dna分子的核苷酸序列如seq id no:23所示。
[0037]
编码seq id no:26所示突变体的dna分子的核苷酸序列如seq id no:25所示。
[0038]
编码seq id no:28所示突变体的dna分子的核苷酸序列如seq id no:27所示。
[0039]
本发明还提供了包含编码本发明所述突变体的dna序列的重组载体。
[0040]
本发明所述的重组载体的骨架载体为pet30a(+)、pet28a(+)、pet20b(+)、pmal-c4x、pet-sumo。
[0041]
本发明还提供了表达本发明所述突变体的宿主细胞。
[0042]
本发明所述宿主细胞为大肠杆菌bl21(de3)、bl21(de3)plyss、jm109、origami(de3)。
[0043]
所述宿主细胞的构建方法包括：
[0044]
将seq id no:3所示的dna片段连接入pet30a(+)载体，构建获得pet30a-cgt；以pet30a-cgt为模板，以含有突变位点的引物分别进行pcr扩增，所得扩增产物用dpni酶切去除质粒模板，酶切产物直接转化感受态宿主细胞，经卡那霉素筛选获得所述宿主细胞。
[0045]
本发明所述的突变体，或宿主细胞在制备2-o-α-d-吡喃葡萄糖基抗坏血酸中的应用。
[0046]
本发明提供了一种制备2-o-α-d-吡喃葡萄糖基抗坏血酸的方法，其以l-抗环血酸和β-环糊精为底物，以cgt酶进行反应，然后以糖化酶处理，制得2-o-α-d-吡喃葡萄糖基抗坏血酸；
[0047]
所述cgt酶为本发明所述的突变体或破碎的宿主细胞。
[0048]
本发明提供的方法中，所述的宿主细胞的培养基含有蛋白胨10g/l、酵母粉5g/l、氯化钠8g/l、甘油10g/l、硫酸镁1g/l、磷酸二氢钾1g/l、磷酸氢二钾2g/l；
[0049]
本发明提供的方法中，宿主细胞的培养温度为37℃，氨水控制ph7.0，反应后5h开始补料30％甘油至od
600
达到20后，以浓度为0.4mm的iptg于25℃诱导22h。
[0050]
本发明提供的方法中，所述cgt酶的反应缓冲液是浓度为40mm，ph值为5.0的柠檬
hcl终止反应，5min后加入50μl 3m naoh中和ph，然后加入100μlα-葡萄糖苷酶于60℃反应60min，加入100μl 1m na2co3溶液将ph调节到8.0以上，在401nm处测定吸光值。eps经过酶解释放的对硝基苯酚的浓度与401nm的吸光值成正比，1mol eps完全酶解释放1mol对硝基苯酚。一个cgt酶的酶活单位(u)定义为在该测定条件下每分钟转化1μmol eps所需的酶量。
[0059]
突变文库的构建：将所选的氨基酸位点核苷酸序列替换成nnk简并序列，并合成对应的pcr引物。以含有野生型cgt基因序列的质粒为模板，进行pcr扩增整个质粒，获得的产物用dpni酶去除模板后转化大肠杆菌bl21(de3)感受态，复苏后涂布卡那霉素抗性平板，长出转化子即为单个位点的饱和突变文库。筛选出产量提高的单个位点突变的突变体后，针对这些突变重新设计定点突变引物，用单点突变的突变体的质粒作为模板，设计第二突变点的突变引物pcr扩增整个质粒，以dpni酶去除模板后转化至新的大肠杆菌感受态宿主，获得具有双突变体。以此类推，在双突变的基础上，利用pcr定点突变，将这些突变依次叠加，可构建多突变点的组合突变文库。
[0060]
文库的筛选：随机挑取若干个转化子，进行诱导表达，收集菌体后用溶菌酶破壁处理并离心取上清，用于酶活性检测。对酶活性提高的突变体进行测序确认突变的核苷酸序列。
[0061]
对酶活性提高的突变体进行扩大培养，诱导表达后收集菌体，进行合成2-o-α-d-吡喃葡萄糖基抗坏血酸反应。将适量抗坏血酸和β-环糊精溶于缓冲液中，用氢氧化钠调节ph至5.0，加入湿菌体后调节温度35℃反应。反应结束后加入糖化酶，60℃处理，获得产物2-o-α-d-吡喃葡萄糖基抗坏血酸。
[0062]
应用本发明提供的cgt酶，2-o-α-d-吡喃葡萄糖基抗坏血酸产量可达130g/l，l-抗坏血酸的转化率可达67.7％。所述l-抗坏血酸的转化率计算方法为：催化反应所生成的2-o-α-d-吡喃葡萄糖基抗坏血酸的物质的量(mol)与催化反应初始l-抗坏血酸浓度对应的理论2-o-α-d-吡喃葡萄糖基抗坏血酸产量。
[0063]
本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。
[0064]
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
[0065]
实施例1：原始酶的大肠杆菌表达系统的构建
[0066]
根据ncbi上登录的bacillus stearothermophilus no2菌株野生型cgt基因序列(序列号x59042.1，如seq id no:1所示)，对其进行密码子优化(优化后的序列如seq id no:3所示)。将密码子优化后的cgt基因序列合成并亚克隆至大肠杆菌表达载体pet30a(+)(基因合成与亚克隆过程委托苏州金唯智公司完成，pet30a(+)为已公开的商品化大肠杆菌表达载体)。由本公司将带有野生型cgt基因的重组质粒pet30a-cgt转化大肠杆菌bl21(de3)宿主，获得表达bacillus stearothermophilus no2原始cgt酶的重组大肠杆菌。
[0067]
实施例2：单点饱和突变文库的构建
[0068]
本实施例采用nnk简并性引物设计方式(20种氨基酸/32种密码子)构建cgt各个突变位点的突变氨基酸残基定点饱和突变文库，以获取具有更高糖基转移催化活性的cgt酶变体。定点饱和突变文库所选择的突变位点为酶与底物结合活性中心附近的关键氨基酸位点。本实施例中所选择的关键氨基酸位点以及该位点所对应的nnk兼并性引物如表1所列。
[0069]
以实施例1中的重组质粒pet30a-cgt为模板，以所设计的不同位点的引物(将突变位点密码子替换为简并密码子nnk)分别进行pcr扩增整个质粒。pcr体系参照kod-plus-neo
(toyobo)说明书配制，每个反应体积为10μl。pcr程序为95℃预变性3min，然后95℃变形30s、66℃退火30s、72℃延伸4min，18个循环，最后72℃延伸10min。将获得的pcr产物用dpni酶切去除质粒模板，酶切产物直接转化大肠杆菌bl21(de3)感受态细胞，涂布卡那霉素抗性平板，37℃培养过夜，即获得不同位点的饱和突变文库。
[0070]
表1饱和突变文库所使用简并性引物及对应的cgt饱和突变位点详单
[0071]
[0072]
[0073]
[0074]
[0075][0076]
实施例3：突变文库的筛选与鉴定
[0077]
针对不同位点文库，随机挑选单克隆在含有lb培养基(卡那霉素抗性)的96孔细胞培养板中37℃培养过夜，同时每个细胞培养板中均选择6孔接入表达原始cgt酶的重组大肠杆菌作为对照。然后按2％转接入含有新鲜lb培养基(卡那霉素抗性)的96孔板中37℃培养2h(od600约0.6-1.0)，最后添加终浓度0.4mm的iptg诱导，降温至25℃培养过夜。
[0078]
离心收集诱导后的菌体，每孔添加1g/l溶菌酶0.2ml,30℃振荡2h破壁，离心收集上清，即为粗酶液。各突变体粗酶液的酶活测定采用4,6-亚乙基-对硝基苯-α-d-麦芽七糖苷(eps)显色法(其方法与过程可参考公开文献：the three transglycosylation reactions catalyzed by cyclodextrin glycosyltransferase from bacillus circulans(strain 251)proceed via different kinetic mechanisms；doi:10.1046/j.1432-1327.2000.01031.x)，以对突变体酶活性进行高通量筛选。测定过程如下，取600μl含有终浓度4mm的eps和20mm的麦芽糖溶液于50℃水浴保温10min，加入0.1ml适当稀释的酶液，反应10min，加入50μl 3m hcl终止反应，5min后加入50μl 3m naoh中和酸性，然后加入100μlα-葡萄糖苷酶(品类，来源)于60℃反应60min，加入100μl 1m na2co3溶液将ph调节到8.0以上，用酶标仪测定401nm吸光值。eps经过酶解释放的对硝基苯酚的浓度与401nm的吸光值成正比，1mol eps完全酶解释放1mol对硝基苯酚。一个cgt酶活单位(u)定义为在所述的4,6-亚乙基-对硝基苯-α-d-麦芽七糖苷(eps)显色法测定条件下每分钟转化1μmol eps所需的酶量。根据所述的eps显色法筛选各个重组酶突变体的活性。
[0079]
选取突变体酶活性高于原始cgt的重组表达菌株，pcr扩增其表达质粒并对pcr扩增产物进行基因测序(本实施例中突变体质粒的基因测序工作交由苏州金唯智公司完成)。之后，将突变体质粒上的cgt序列与原始cgt序列进行对比，从而获知突变体基因序列的突变位点。之后，按照获知的突变位点，制备具有上述突变位点定点突变的突变体重组酶，进行表达并利用eps显示法验证酶活，以确认该突变位点确实为有利于酶活提高的正突变。本实施例中，突变文库中共筛选获得6个酶活高于原始菌株的突变位点(见表3，突变体1-6)，其突变位点及突变种类见表3所述。
[0080]
实施例4：组合突变文库的构建与筛选
[0081]
对实施例3中筛选所得突变位点进行随机组合，构建组合文库。以表3中突变体1质粒为模板，以所设计的不同位点的引物(表2)分别进行pcr扩增整个质粒。pcr体系参照kod-plus-neo(toyobo)说明书配制，每个反应体积为10μl。pcr程序为95℃预变性3min，然后95℃变形30s、66℃退火30s、72℃延伸4min，18个循环，最后72℃延伸10min。将获得的pcr产物用dpni酶切去除质粒模板，酶切产物直接转化大肠杆菌bl21(de3)感受态细胞，涂布卡那霉素抗性平板，37℃培养过夜，即获得双突变体组合。以上述所得双突变质粒为模板，以所设计的不同位点的引物(表2)再次进行pcr扩增整个质粒，即可获得三突变体组合。同样的方法，构建完成四突变、五突变及六突变体组合。
[0082]
表2组合突变文库所使用的定点突变引物详单
[0083][0084]
将获得的组合突变体按照实施例3的方法进行筛选。本实施例中，组合突变文库中共筛选获得6个酶活高于原始菌株的突变位点(见表3，突变体7-12)，其突变位点及突变种类见表3所述。
[0085]
表3突变位点测序与酶活性比较结果
[0086]
[0087][0088]
实施例5：原始酶重组菌株与突变体酶重组菌株的培养诱导条件
[0089]
摇瓶培养采用lb培养基(蛋白胨10g/l、酵母粉5g/l、氯化钠10g/l)，将原始酶重组菌株或变体酶重组菌株接种摇瓶后，在37℃培养至浊度od600为0.6-1.0后，添加iptg(异丙基硫代半乳糖苷)的诱导cgt表达(摇瓶内终浓度为0.4mm)，同时降温至25℃培养8-14h。最后，离心收集菌体作为cgt重组酶粗酶。所述的cgt粗酶可在4℃或-20℃保存备用，也可细胞破碎后用于纯酶的进一步制备，另外也能直接用于催化反应。
[0090]
发酵罐培养采用发酵培养基(蛋白胨10g/l、酵母粉5g/l、氯化钠8g/l、甘油10g/l、硫酸镁1g/l、磷酸二氢钾1g/l、磷酸氢二钾2g/l)，补料培养基(4％蛋白胨、2％酵母粉、30％甘油)，氨水控制ph7.0。接种发酵罐后37℃培养5h开始补料，od
600
为20时开始诱导，加入终浓度0.4mm的iptg并降温至25℃培养，发酵22h放罐。之后离心收集菌体作为cgt重组酶粗酶。所述的cgt粗酶可在4℃或-20℃保存备用，也可细胞破碎后用于纯酶的进一步制备，另外也能直接用于催化反应。
[0091]
实施例6：2-o-α-d-吡喃葡萄糖基抗坏血酸含量的hplc检测方法
[0092]
检测条件如下：
[0093]
液相：安捷伦1290
[0094]
色谱柱：安捷伦sb-c18 4.6*150mm 2.7μm
[0095]
流动相：0.1％磷酸水：乙腈＝97:3
[0096]
流速：0.8ml/min
[0097]
检测器：uv
[0098]
检测波长：245nm
[0099]
柱温：25℃
[0100]
取反应液0.1ml加入0.9ml流动相中，12000rpm离心1min，取上清过膜，进样检测。采用外标法，将供试样品2-o-α-d-吡喃葡萄糖基抗坏血酸的峰面积带入标准曲线，计算出对应产物浓度。
[0101]
实施例7：原始酶与突变体酶催化合成2-o-α-d-吡喃葡萄糖基抗坏血酸的应用
[0102]
按照实施例5所述摇瓶培养的培养方法，分别获取原始酶与各个突变体酶(表3，突变体1-12)的粗酶(即发酵后离心收集的湿菌体)。
[0103]
2-o-α-d-吡喃葡萄糖基抗坏血酸的合成方法为：将l-抗坏血酸溶于柠檬酸-na2hpo4缓冲液(40mm ph5.0)中，用naoh调节ph至5.0，加入β-环糊精和粗酶。使反应液中包含l-抗坏血酸100g/l，β-环糊精200g/l，粗酶20g/l。35℃、600rpm，搅拌反应48h，添加糖化酶(山东西唐生物科技有限公司生产)提高温度至60℃处理2h，反应完毕，取样按实施例6所述的检测条件对反应液中的2-o-α-d-吡喃葡萄糖基抗坏血酸含量进行检测，结果见表4：
[0104]
表4原始菌株与突变体合成2-o-α-d-吡喃葡萄糖基抗坏血酸的反应验证
[0105][0106]
实施例8：原始酶与突变体10催化合成2-o-α-d-吡喃葡萄糖基抗坏血酸应用
[0107]
按照实施实例5发酵罐培样的方法分别制备原始酶与突变体10粗酶(即发酵后离心收集的湿菌体)。
[0108]
2-o-α-d-吡喃葡萄糖基抗坏血酸合成的反应液体积为6l，溶剂为去离子水，添加600g l-抗环血酸，1200gβ-环糊精，120g粗酶(突变体10或原始酶)，30g无水亚硫酸钠，用naoh调节并维持ph5.0，去离子水定容后开始反应，35℃，600rpm，反应48h后添加30g糖化酶，60℃处理2h，终止反应，取样按照实施例6所述方法测定2-o-α-d-吡喃葡萄糖基抗坏血酸含量。经测定，突变体10酶反应液中2-o-α-d-吡喃葡萄糖基抗坏血酸含量为130g/l，转化率达67.7％，相同条件下，作为对照原始酶反应液的2-o-α-d-吡喃葡萄糖基抗坏血酸产量为97.7g/l，转化率为50.9％。
[0109]
实施例9：本发明所述突变体与其它已公开的突变体酶活性比较
[0110]
按专利cn104531629a(对照文件1)的所述方法我们构建了所述对比文件中已经公开的(k228r)，(d367s)，以及双突变体(k228r/d367s)三个突变体，其中双突变体(k228r/d367s)具有最高活性。按照本申请实施实例1所述方法将对照文件1所述的双突变体(k228r/d367s)基因亚克隆至大肠杆菌表达载体pet30a(+)，并转入大肠杆菌bl21(de3)表达，并按照本申请实施实例7进行酶活验证，其结果如表4所示。
[0111]
表5.已公开的其它突变体酶活性
[0112]
酶产量(g/l)转化率(％)野生酶77.7
±
5.541.0k228r/d367s84.5
±
5.344.0
[0113]
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。