人脐带间充质干细胞无血清培养基和制备方法及人脐带间充质干细胞无血清培养液获取方法与流程

本发明属于干细胞培养技术领域，涉及人脐带间充质干细胞无血清培养基，人脐带间充质干细胞无血清培养基制备方法，以及人脐带间充质干细胞无血清培养液的培养方法。

背景技术：

间充质干细胞是干细胞家族的重要成员，来源于发育早期的中胚层和外胚层。间充质干细胞最早在骨髓中发现，因其具有多项分化潜能、造血支持、促进干细胞植入、免疫调节和自我复制等特点而日益受到人们的关注。骨髓间充质干细胞已经在临床上得到广泛应用，目前研究表明脐带来源的间充质干细胞也将有更大的应用潜能。

huc-mscs(humanumbilicalcordmesenchymalstemcells,人脐带间充质干细胞)即脐带间充质干细胞，表达多种干细胞的特有标志，具有分化潜力大，增殖能力强，免疫原性低，取材方便，无道德伦理问题限制，易于工业化制备等特征。

人脐带间充质干细胞不仅可以应用到临床治疗中，而且其细胞培养过程中产生的培养上清液也具有非常好的美容护肤作用。

人脐带间充质干细胞调节培养液(即人脐带间充质干细胞培养上清液)含有大量的细胞生长因子和胶原蛋白等营养物质，该营养物质能够有效的促进皮肤细胞的新陈代谢；促进细胞外透明质酸、糖蛋白等大分子的合成和分泌，增强皮肤的亲水性；促进表皮细胞的生长、分化和修复，使衰老死亡的细胞得以及时补充；同时能够加速角质层修复，加速基底新老细胞更替，使肌肤回到年轻姿态。

近年来，间充质干细胞的体外扩增是在补充有胎牛血清或补充有人的自体血清或基本等同相似的血清的培养基中进行。然而，牛血清、人血清或其它动物血清可能含有血液传播的病原体，牛血清还会激发抗异性生物质蛋白抗体的产生，异型生物质蛋白可激发受体患者的免疫应答，另外，牛血清还会显示出批次间差异，导致性能不一致。

目前虽然市场上存在一些可购买的人脐带间充质干细胞培养的血清替代物，但是效果仍不甚理想，容易受到某些机械因素和化学因素的影响，致使影响干细胞的贴壁、增殖以及稳定性的维持。

技术实现要素：

本发明的第一个目的在于提供一种人脐带充间质干细胞无血清培养基，能够实现人脐带间充质干细胞的体外培养，细胞贴壁性和形态良好，细胞增殖速率高。

本发明的第二个目的在于提供一种人脐带间充质干细胞无血清培养基的制备方法，解决现有技术中人脐带间充质干细胞的贴壁生长速度、增殖缓慢以及稳定性差的问题。

本发明的第三个目的在于提供一种人脐带间充质干细胞无血清培养液的培养方法，其制得的培养液中细胞因子和胶原蛋白含量稳定。

本发明所采用的第一个技术方案是：一种人脐带间充质干细胞无血清培养基，包括基础培养基和无血清培养浓缩液，还包括如下组分及其浓度：维生素组合物为5-100ng/ml，葡多酚为50-200μg/ml，重组人表皮细胞生长因子为1～50ng/ml，重组人碱性成纤维细胞生长因子为1～50ng/ml，重组血小板衍生生长因子-c为1～10ng/ml，重组人胰岛素样生长因子-1为1～10ng/ml，β-巯基乙醇为50～200μm，人血白蛋白1～100μg/ml，谷胱甘肽为1-100μg/ml，碳酸氢钠为1.2-3.7g/l。

本发明的第一个特点还在于，

基础培养基的体积百分比为90～98％，无血清培养浓缩液的体积百分比为2～10％。

基础培养基是指f12或dmem/f12。

维生素组合物是维生素b、维生素c的一种或两种任意比例组合物。

本发明所采用的第二个技术方案是：一种人脐带间充质干细胞无血清培养基的制备方法，包括以下具体步骤：

步骤1：制备无血清培养上清浓缩液

人脐带间充质干细胞接种于无血清培养基中进行培养，当细胞融合度为80-90％时，收集人脐带间充质干细胞上清液；过滤，超滤浓缩，加水测定总蛋白，得到无血清培养上清浓缩液；

步骤2：制备生长因子浓配液

将重组人表皮细胞生长因子、重组人碱性成纤维细胞生长因子、重组血小板衍生生长因子-c、重组人胰岛素样生长因子-1四款生长因子配制成浓配液，在无菌条件下分装，冻存；

步骤3：制备人脐带间充质干细胞无血清培养基

将维生素组合物、葡多酚、β-巯基乙醇、人血白蛋白、谷胱甘肽溶解于基础培养基中，混合均匀然后加入碳酸氢钠，过滤，得到混合液；

将步骤1的无血清培养上清浓缩液、步骤2的生长因子浓配液加入混合液中混合均匀，得人脐带间充质干细胞无血清培养基。

本发明的第二个特点还在于，

基础培养基的体积百分比为90～98％，无血清培养上清浓缩液的体积百分比为2～10％；维生素组合物浓度为5-100ng/ml，葡多酚浓度为50-200μg/ml，重组人表皮细胞生长因子浓度为1～50ng/ml，重组人碱性成纤维细胞生长因子浓度为1～50ng/ml，重组血小板衍生生长因子-c浓度为1～10ng/ml，重组人胰岛素样生长因子-1浓度为1～10ng/ml，β-巯基乙醇浓度为50～200μm，人血白蛋白浓度为1～100μg/ml，谷胱甘肽浓度为1-100μg/ml，碳酸氢钠浓度为1.2-3.7g/l。

步骤1中加水至测定的总蛋白浓度为10mg/ml。

步骤1中超滤浓缩至原人脐带间充质干细胞上清液体积的1/15～1/20。

步骤2中浓配液中各细胞生长因子的浓度为50ug/ml。

本发明所采用的第三个技术方案是：一种人脐带间充质干细胞培养液的制备方法，利用一种人脐带间充质干细胞无血清培养基进行制备，具体包括以下步骤：

步骤a、提取人脐带间充质干细胞：

清理脐带、剪碎，加入基础培养基进行培养，得到原代人脐带间充质干细胞，在原代人脐带间质干细胞中加入基础培养基进行传代培养，收集p1代到p5代细胞作为种子细胞进行冻存；

步骤b、扩增培养人脐带间充质干细胞：

取步骤a中的种子细胞进行复苏，当细胞融合度为80％-90％时，胰蛋白酶消化细胞传代培养，传代培养基采用人脐带间充质干细胞无血清培养基，传代培养条件为：温度为37℃，5％co2；

步骤c、收集人脐带间质干细胞无血清调节培养液：

收集p6到p15代培养过程中的人脐带间充质干细胞培养上清，即得人脐带间充质干细胞无血清调节培养液。

本发明的有益效果是：

(1)利用人脐带间充质干细胞无血清培养基替代传统含动物血清的培养基来培养人脐带间充质干细胞，避免了干细胞被病原体或动物源性成分污染及异种蛋白引起人体免疫反应等不安全因素；

(2)在制备人脐带间充质干细胞无血清培养基时，添加了四种重组细胞生长因子和葡多酚，四种重组生长因子的作用是维持和刺激间充质干细胞的增殖，葡多酚的作用是提高间充质干细胞增殖活性，促进细胞分裂；

(3)在制备人脐带间充质干细胞无血清培养基时，添加了无血清培养上清液，同时对该上清液经过系列处理，上清液含有干细胞自身分泌的多种生长因子、胶原蛋白及营养物质，可以作为血清替代物存在；

(4)人脐带间充质干细胞无血清调节培养液可以有效地应用于抗皱、祛疤、皮肤浅表面创伤愈合修复等皮肤美容医学领域；

(5)采用本发明的人脐带间充质干细胞无血清培养基进行人脐带间充质干细胞培养，可以有效的改善人脐带间充质干细胞的贴壁生长及扩增能力。

附图说明

图1为本发明人脐带间充质干细胞无血清培养基实施例1～3的人脐带间充质干细胞无血清培养基作用于人脐带间充质干细胞的增殖情况；

图2(a)是本发明实施例一人脐带间充质干细胞无血清培养基进行人脐带间充质干细胞培养的生长情况；

图2(b)是本发明实施例二人脐带间充质干细胞无血清培养基进行人脐带间充质干细胞培养的的生长情况；

图2(c)是本发明实施例三人脐带间充质干细胞无血清培养基进行人脐带间充质干细胞培养的生长情况；

图2(d)是本发明p5代人脐带间充质干细胞在含10％胎牛血清fbs培养基中的生长情况；

图3利用本发明人脐带间充质干细胞无血清培养液培养方法制备的培养液在不同时间段、不同蛋白浓度下对hsf的增殖作用。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明。

一种人脐带间充质干细胞无血清培养基，包括基础培养基和无血清培养上清浓缩液；还包括如下组分及其浓度：维生素组合物为5-100ng/ml，葡多酚(gpc)为50-200μg/ml，重组人表皮细胞生长因子(rh-egf)为1～50ng/ml，重组人碱性成纤维细胞生长因子(rh-bfgf)为1～50ng/ml，重组血小板衍生生长因子-c(rh-pdgf-c)为1～10ng/ml，重组人胰岛素样生长因子-1(rh-igf-1)为1～10ng/ml，β-巯基乙醇为50～200μm，人血白蛋白为1～100μg/ml，谷胱甘肽为1-100μg/ml，碳酸氢钠为1.2-3.7g/l。

基础培养基的体积百分比为90～98％、无血清培养上清浓缩液的体积百分比为2～10％。

基础培养基是指f12或dmem/f12。

维生素组合物是维生素b、维生素c的一种或两种任意比例组合物。维生素为细胞的生长代谢提供必要的维生素，能够促进细胞生长、延长细胞活性，降低代谢产物堆积。

葡多酚是指主要成分是不同数量的儿茶素和表儿茶素单体以不同的空间结构聚合成的原花青素。葡多酚对人脐带间充质干细胞、人体血管内皮细胞、成纤维细胞等都表现出促进和保护细胞活性，是一种天然人体细胞增殖活性促进剂。

一种人脐带间充质干细胞无血清培养基的制备方法，包括以下具体步骤：

步骤1：制备无血清培养上清浓缩液

人脐带间充质干细胞接种于无血清培养基中进行培养，当细胞融合度为80-90％时，收集人脐带间充质干细胞上清液；过滤，超滤浓缩，加水测定总蛋白浓度为10mg/ml，得到无血清培养上清浓缩液。

步骤1中人脐带间充质干细胞以5×10³～8×10³/cm²接种于市售无血清培养基中。

步骤1中过滤2次，其中一次采用0.8μm微滤膜，另一次采用0.45μm微滤膜。

步骤1中超滤浓缩采用截留分子量为3kd的超滤系统进行切向流超滤浓缩。

步骤1中超滤浓缩至原人脐带间充质干细胞上清液过滤后液体体积的1/15～1/20。

步骤2：制备生长因子浓配液

将重组人表皮细胞生长因子、重组人碱性成纤维细胞生长因子、重组血小板衍生生长因子-c、重组人胰岛素样生长因子-1四款生长因子配制成浓配液，在无菌条件下分装，-80℃冻存；

步骤2中浓配液中各生长因子的浓度为50ug/ml。

步骤2中重组人表皮细胞生长因子(rh-egf)浓度为1～50ng/ml，重组人碱性成纤维细胞生长因子(rh-bfgf)浓度为1～50ng/ml，重组血小板衍生生长因子-c(rh-pdgf-c)浓度为1～10ng/ml，重组人胰岛素样生长因子-1(rh-igf-1)浓度为1～10ng/ml。

步骤3：制备人脐带间充质干细胞无血清培养基

将维生素组合物、葡多酚、β-巯基乙醇、人血白蛋白、谷胱甘肽溶解于基础培养基中，混合均匀然后加入碳酸氢钠，过滤，得到混合液；

将步骤1的无血清培养上清浓缩液、步骤2的生长因子浓配液加入混合液中混合均匀，得人脐带间充质干细胞无血清培养基。

一种人脐带间充质干细胞无血清培养液的获取方法，采用一种人脐带间充质干细胞无血清培养基获取，具体包括有以下步骤：

步骤a：人脐带间充质干细胞的提取：

将脐带清理剪碎，加入基础培养基培养，得到原代人脐带间充质干细胞，继续采用基础培养基进行传代培养，将p1代到p5代细胞作为种子细胞进行冻存；

步骤b：人脐带间充质干细胞的扩增培养：

取种子细胞进行复苏，当细胞融合度为80％-90％时，用胰蛋白酶消化细胞，采用人脐带间充质干细胞无血清培养基进行传代培养；传代培养条件为：37℃，5％co2；

步骤c：收集人脐带间充质干细胞无血清调节培养液：

收集传代p6～p15代过程中的上清液，即得人脐带间充质干细胞无血清调节培养液。

步骤a中采用脐带为取捐献者新生儿脐带，产妇需要进行适合性检查，其中包括：一般查体、常规检查、alt、tp、hiv、hbv、hcv、cmv、ebv、htlv的检验；以上各项指标合格后，方可作为来源脐带，同时捐献者需要签署知情同意书；

清理脐带具体步骤为：将脐带血迹洗涤干净，剖开脐带，剔除动脉血管及静脉血管，剥离华通氏胶。

一种人脐带间充质干细胞无血清培养液应用于皮肤美容医学领域，其人脐带间充质干细胞培养液不含动物血清，可添加到一些医用修复凝胶，修护贴、喷雾等医疗器械及药用产品中；用于皮肤皱纹、色斑以及瘢痕的修复治疗。

实施例1

一种人脐带间充质干细胞无血清培养基制备方法，具体包括以下步骤：

步骤1：制备无血清培养上清浓缩液

人脐带间充质干细胞以5×10³/cm²接种于无血清培养基中进行培养，当细胞融合度为80％时收集培养上清液，得体积为5l的上清液，将5l的上清液经平板滤器过滤，过滤滤膜孔径分别为0.8μm，0.45μm；再采用截留分子量为3kda的醋酸纤维素超滤膜进行超滤浓缩，浓缩至原过滤后液体体积的1/15时停止浓缩，得浓缩后的液体305ml，采用bca蛋白试剂盒检测浓缩液蛋白含量为11.2mg/ml，向浓缩后的液体中补充37ml注射用水，最终形成蛋白含量为10mg/ml的浓缩后的无血清培养上清液342ml，分装至50ml无菌离心管中-80℃冻存。

步骤2：制备生长因子浓配液

将市售重组人表皮细胞生长因子(rh-egf)、重组人碱性成纤维细胞生长因子rh-bfgf)、重组血小板衍生生长因子-c(rh-pdgf-c)、重组人胰岛素样生长因子-1(rh-igf-1)分别溶解在注射用水或灭菌的超纯水中，保证各细胞生长因子浓度为50ug/ml，然后分装于1.5ml无菌离心管中存放于-20℃，避免反复冻融；

步骤3：制备人脐带间充质干细胞无血清培养基

将50μg维生素b，30μg维生素c、55mg原花青素、3.9mgβ-巯基乙醇，52.6mg人血白蛋白，58mg谷胱甘肽溶解于1ldmem/f12基础培养基中，搅拌混合均匀后加入1.2g碳酸氢钠，然后过0.22μm滤膜，得到a液；

将步骤1的无血清培养上清浓缩液52.6ml和步骤2的生长因子浓配液(重组人表皮细胞生长因子(rh-egf)126μl、重组人碱性成纤维细胞生长因子(rh-bfgf)104μl、重组血小板衍生生长因子-c(rh-pdgf-c)109μl、重组人胰岛素样生长因子-1(rh-igf-1)115μl)，加入到a液中混合均匀即得人脐带间充质干细胞无血清培养基。

本实施例得到的人脐带间充质干细胞无血清培养基，总体积为1052ml，其中，基础培养基95％(v/v)，无血清培养上清浓缩液5％(v/v)，维生素组合物浓度76ng/ml，葡多酚浓度52.3μg/ml，rh-egf浓度6.0ng/ml，rh-bfgf浓度5.0ng/ml，rh-pdgf-c浓度8.2ng/ml，rh-igf-1浓度5.5ng/ml，β-巯基乙醇浓度50μm，人血白蛋白浓度50ug/ml，谷胱甘肽浓度55μg/ml，碳酸氢钠浓度1.2g/l。

实施例2

制备一种人脐带间充质干细胞无血清培养基，其方法如下：

步骤1：制备无血清培养上清浓缩液

人脐带间充质干细胞以6×10³/cm²接种于无血清培养基中进行培养，当细胞融合度为85％时收集培养上清液，得体积为30l的上清液，将30l的上清液依次经平板滤器过滤，过滤滤膜孔径分别为0.8μm，0.45μm；再采用截留分子量为3kda的醋酸纤维素超滤膜进行超滤浓缩，单块膜包面积为0.5m²，共计6块膜包，采用切向流工艺进行浓缩，透过端液体废弃处理，浓缩至原微滤液体积的1/18时停止浓缩，打空超滤系统中液体，得浓缩后的上清液1678ml；再通过bca蛋白试剂盒检测浓缩后上清液蛋白含量为12.2mg/ml，向浓缩液中补充369ml注射用水，最终形成蛋白含量为10mg/ml的浓缩后的无血清培养上清液2047ml，分装至500ml无菌瓶、50ml无菌离心管中-80℃冻存。

步骤2：制备生长因子浓配液

将市售重组人表皮细胞生长因子(rh-egf)、重组人碱性成纤维细胞生长因子rh-bfgf)、重组血小板衍生生长因子-c(rh-pdgf-c)、重组人胰岛素样生长因子-1(rh-igf-1)分别溶解在注射用水或灭菌的超纯水中，保证各细胞生长因子浓度为50ug/ml，然后分装于1.5ml无菌离心管中存放于-20℃，避免反复冻融；

步骤3：制备人脐带间充质干细胞无血清培养基

将9μg维生素c，124mg原花青素，14.04mgβ-巯基乙醇，1.22mg人血白蛋白，96.9mg谷胱甘肽溶解于1lf12基础培养基中，搅拌混合均匀后加入3.7g碳酸氢钠，然后过0.22μm滤膜，得到a液。

将步骤1的蛋白含量为10mg/ml的浓缩后的无血清培养上清浓缩液20.5ml和步骤2的生长因子浓配液(重组人表皮细胞生长因子(rh-egf)980μl、重组人碱性成纤维细胞生长因子(rh-bfgf)490μl、重组血小板衍生生长因子-c(rh-pdgf-c)92μl、重组人胰岛素样生长因子-1(rh-igf-1)49μl)，加入到a液中混合均匀即得人脐带间充质干细胞无血清培养基。

本实施例得到的人脐带间充质干细胞无血清培养基，总体积为1021ml，其中，基础培养基98％(v/v)，无血清培养上清浓缩液2％(v/v)，维生素组合物浓度8.8ng/ml，葡多酚浓度196μg/ml，rh-egf浓度48ng/ml，rh-bfgf浓度24ng/ml，rh-pdgf-c浓度4.5ng/ml，rh-igf-1浓度2.4ng/ml，β-巯基乙醇浓度180μm，人血白蛋白浓度1.2ug/ml，谷胱甘肽浓度95μg/ml，碳酸氢钠浓度3.7g/l。

实施例3

制备一种人脐带间充质干细胞无血清培养基，其方法如下：

步骤1：制备无血清培养上清浓缩液

人脐带间充质干细胞以8×10³/cm²接种于无血清培养基中进行培养，当细胞融合度为90％时收集培养上清液，得体积为7.5l的上清液，将7.5l的上清液依次经平板滤器过滤，过滤滤膜孔径分别为0.8μm，0.45μm；再采用截留分子量为3kda的醋酸纤维素超滤膜进行超滤浓缩，超滤膜以及超滤系统厂家为millipore，单块膜包面积为0.5m²，共计4块膜包，采用切向流工艺进行浓缩，透过端液体废弃处理，浓缩至原微滤液体积的1/20时停止浓缩，打空超滤系统中液体，得浓缩液390ml，bca蛋白试剂盒检测浓缩液蛋白含量为13.6mg/ml，补充140ml注射用水，最终形成蛋白含量为10mg/ml浓缩后的无血清培养上清液，分装至50ml无菌离心管中-80℃冻存。

步骤2：制备生长因子浓配液

将市售重组人表皮细胞生长因子(rh-egf)、重组人碱性成纤维细胞生长因子rh-bfgf)、重组血小板衍生生长因子-c(rh-pdgf-c)、重组人胰岛素样生长因子-1(rh-igf-1)分别溶解在注射用水或灭菌的超纯水中，保证各细胞生长因子浓度为50ug/ml，然后分装于1.5ml无菌离心管中存放于-20℃，避免反复冻融；

步骤3：制备人脐带间充质干细胞无血清培养基

将93.1μg维生素b，87.6mg原花青素、6.86mgβ-巯基乙醇，87.62mg人血白蛋白，2.74mg谷胱甘肽溶解于1ldmem/f12基础培养基中，搅拌混合均匀后加入1.2g碳酸氢钠，然后过0.22μm滤膜，得到a液；

将步骤1蛋白含量为10mg/ml浓缩后的无血清培养上清浓缩液95.3ml和步骤2的生长因子浓配液(重组人表皮细胞生长因子(rh-egf)504μl、重组人碱性成纤维细胞生长因子(rh-bfgf)986μl、重组血小板衍生生长因子-c(rh-pdgf-c)33μl、重组人胰岛素样生长因子-1(rh-igf-1)202μl)加入到上述a液中混合均匀即得人脐带间充质干细胞无血清培养基。

本实施例得到的人脐带间充质干细胞无血清培养基，总体积为1095ml，其中，基础培养基91.3％(v/v)，无血清培养上清浓缩液8.7％(v/v)，维生素组合物浓度85ng/ml，葡多酚浓度80μg/ml，rh-egf浓度23ng/ml，rh-bfgf浓度45ng/ml，rh-pdgf-c浓度1.5ng/ml，rh-igf-1浓度9.2ng/ml，β-巯基乙醇浓度88μm，人血白蛋白浓度80ug/ml，谷胱甘肽浓度2.5μg/ml，碳酸氢钠浓度1.2g/l。

实施例4

人脐带间充质干细胞无血清培养基性能分析

(一)增殖能力

对比对照组和样品组在培养7天中，对人脐带间充质干细胞增殖活力的影响，细胞活力是指总细胞群中活细胞所占的百分比，活细胞越多，光密度值(od)就越高。通过酶标仪测定活细胞的数量，od值越高表示活细胞数量越多。

对照组——10％胎牛血清(fbs)的dmem/f12培养基

样品组——实施例1、实施例2、实施例3得到的人脐带间充质干细胞无血清培养基

收集对数生长期人脐带间充质干细胞，重悬于完全培养液中，血细胞计数板计数，调整细胞浓度为3×10⁴个/ml，100μl/孔接种于96孔板上，做6复孔，96孔板四周采用无菌pbs填充，37℃，5％co2培养箱中培养24h；

24h后吸去细胞孔上清液，每孔加入100μl维持培养液继续培养24h；

24h后吸去上清液，每孔加入样品组200μl分别进行培养1d、2d、3d、4d、5d、6d、7d，同时以维持培养液作为对照组；

培养时间到时取出96孔板，每孔中加入5mg/mlmtt溶液20μl孵育4h后，将孔板中液体倒出，每孔加入二甲基亚砜200μl，于37℃避光振摇15min，测定各孔的光密度值(od)，检测波长492nm，以630nm为参比波长。检测结果见图1。

从检测结果可以看出，相对于对照组的10％fbs的培养基，采用本发明的人脐带间充质干细胞无血清培养基(实施例1、实施例2、实施例3)进行人脐带间充质干细胞培养表现出良好的细胞增殖能力，说明本发明的人脐带间充质干细胞无血清培养基各组分配比合理，能够提高人脐带间充质干细胞增殖活性。

(二)形态及生长

取p5代人脐带间充质干细胞种子细胞进行复苏，分别采用实施例1、实施例2、实施例3中人脐带间充质干细胞无血清培养基进行培养，对照组采用含10％fbs的dmem/f12培养基，培养72h后，细胞贴壁生长，形态为梭形，活细胞数量均达到1×10⁵/ml以上，显微镜下观察细胞形态见图2。b1、b2、b3是分别采用实施例1、实施例2、实施例3中人脐带间充质干细胞无血清培养基进行人脐带间充质干细胞培养的显微镜照片，b4为采用对照组培养基进行人脐带间充质干细胞培养的显微镜照片。

从细胞的显微镜照片可以看出，本发明的人脐带间充质干细胞无血清培养基较含血清完全培养基在培养人脐带间充质干细胞过程中细胞状态表现出无差异性。

实施例5

人脐带间充质干细胞无血清调节培养液获取

(一)脐带来源

新生儿父母签署捐赠知情同意书，产妇需要进行适合性检查，其中包括：一般查体、常规检查、alt、tp、hiv、hbv、hcv、cmv、ebv、htlv的检验，各项指标合格后采集分娩的脐带。

(二)步骤a：人脐带间充质干细胞的提取：

将脐带血迹洗涤干净，剖开脐带，剔除动脉血管及静脉血管，剥离华通氏胶，将其组织剪碎，加入含fbs的dmem/f12的完全培养基培养，每隔四天换液，当细胞融合度达到85％时，弃去含血清的上清液，即得p0代人脐带间充质干细胞。继续采用含fbs的dmem/f12培养基进行传代培养，将p1代到p5代细胞作为种子细胞进行冻存。

(三)步骤b：人脐带间充质干细胞的扩增培养：

人脐带间充质干细胞的扩增培养，并收集人脐带间充质干细胞无血清调节培养液。

取p3代种子细胞进行复苏，采用实施例1中无血清培养基进行培养，收集不同代数(p6-p15)细胞产生的培养上清混合后即得人脐带间充质干细胞无血清调节培养液，记做人脐带间充质干细胞-001。

取p4代种子细胞进行复苏，采用实施例2中无血清培养基进行培养，收集不同代数(p6-p15)细胞产生的培养上清混合后即得人脐带间充质干细胞无血清调节培养液，记做人脐带间充质干细胞-002。

取p5代种子细胞进行复苏，采用实施例3中无血清培养基进行培养，收集不同代数(p6-p15)细胞产生的培养上清混合后即得人脐带充间质干细胞无血清调节培养液，记做人脐带间充质干细胞-003。

实施例6

人脐带间充质干细胞无血清调节培养液分析

对实施例5得到的人脐带间充质干细胞无血清调节培养液(人脐带间充质干细胞-001，人脐带间充质干细胞-002，人脐带间充质干细胞-003)进行细胞因子等含量检测。

检测方法采用质谱prm技术，有针对的选择数据进行质谱数据的信号采集，对符合规则的离子进行信号记录，去除不符合规则的离子信号干扰，通过对数据的统计分析，从而获取质谱定量信息。通过合成同位素标记肽段，结合prm定量分析对目标蛋白(生长因子)绝对定量。

检测的目标蛋白种类为rh-egf，rh-bfgf，rh-pdgf-c，rh-igf-1，i型胶原的α1链和α2链。

首先采用化学合成法合成目标蛋白，根据已知蛋白的序列表，选出靶蛋白的特异肽段，选择同位素标记的氨基酸，按照特异肽段的氨基酸序列脱水缩合，合成肽段，lc-ms分析合成多肽的纯度。

每个样品取2μg(经浓缩-重溶-去除sdc-脱盐等处理)多肽经nano-uplc液相系统easy-nlc1200进行分离，并使用在线质谱仪(q-exactive)进行检测。分析采用100μmid×30cm反相色谱柱。流动相a液为0.1％甲酸乙腈水溶液(乙腈为2％)，b液为0.1％甲酸乙腈水溶液(乙腈为80％)，色谱柱以100％的a液平衡。

样品由自动进样器直接上样到色谱柱，再经色谱柱分离，流速300nl/min，梯度时长240min。流动相b：35％持续212min，35-45％持续20min，45–100％持续2min，100％持续2min，100–2％持续2min，2％持续2min。

酶解产物经nano-uplc分离后联用q-exactive质谱仪(thermofinnigan)在线进行质谱分析。分析时长：120min/sample，正离子检测模式，母离子扫描范围：uniquepeptidesm/z。dda采集方式为：每次全扫描(fullscan)后采集20个碎片图谱(ms2scan，hcd)。ms1在m/z200时分辨率为70,000，ms2在m/z200时分辨率为17,500；ms1agc为3e+6，ms2agc为1e+5，最大离子注入时间(maxit)：ms1，50ms，ms2，45ms。标准化碰撞能量(nce)为28％，隔离窗口为2m/z，动态排除时间60s。

通过内标肽段或者蛋白浓度标准曲线，计算靶蛋白绝对含量，结果见下表1。从检测结果可以看出：本发明制得的几种人脐带间充质干细胞无血清调节培养液中细胞因子和胶原蛋白含量稳定，说明人脐带间充质干细胞无血清调节培养液质量稳定。

表1人脐带间充质干细胞无血清调节培养液中几种细胞因子及胶原蛋白含量

实施例7

人脐带间充质干细胞无血清调节培养液的应用

(一)mtt法考察不同蛋白浓度的人脐带间充质干细胞无血清调节培养液对细胞的增殖能力

采用人皮肤成纤维细胞(humanskinfibroblast，hsf)为靶细胞，对比对照组和样品组在培养7天中，不同蛋白浓度的人脐带间充质干细胞无血清调节培养液对hsf增殖活力的影响，细胞活力是指总细胞群中活细胞所占的百分比，活细胞越多，光密度值(od)就越高。通过酶标仪测定活细胞的数量，od值越高表示活细胞数量越多。

对照组——0.4％fbs

样品组——不同蛋白含量的培养液(取实施例5中的人脐带间充质干细胞-003，浓缩后用维持培养液稀释至不同蛋白含量的培养液，蛋白浓度分别为1.0mg/ml，2.0mg/ml，3.0mg/ml，4.0mg/ml，5.0mg/ml，6.0mg/ml)

收集对数生长期hsf，重悬于完全培养液中，血细胞计数板计数，调整细胞浓度为3×10⁴个/ml，100μl/孔接种于96孔板上，做6复孔，96孔板四周采用无菌pbs填充，37℃，5％co2培养箱中培养24h；

24h后吸去细胞孔上清液，每孔加入100μl维持培养液继续培养24h；

24h后吸去上清液，每孔加入样品组200μl分别进行培养48h，72h，96h，同时以维持培养液作为对照组；

培养时间到时取出96孔板，每孔中加入5mg/mlmtt溶液20μl孵育4h后，将孔板中液体倒出，每孔加入二甲基亚砜200μl，于37℃避光振摇15min，测定各孔的光密度值(od)，检测波长492nm，以630nm为参比波长。

如图3及表2，试验结果显示，相对于对照组，人脐带间充质干细胞无血清调节培养液表现出非常好的促hsf增殖能力，且培养液中蛋白浓度在3～5mg/ml时，增殖能力尤为明显，同时表现出延缓细胞凋亡的特性。

表2实验结果统计(48、72、96h)

(二)人脐带间充质干细胞无血清调节培养液体外抗衰评价

在皮肤老化过程中，细胞内mapk信号通路被激活，该通路抑制转化生长因子β(tgf-β)的表达同时上调基质金属蛋白酶(mmp)的水平，最终导致细胞中col-i分泌量降低，引起皮肤老化。所以col-i的分泌量是反应皮肤衰老的最直观指标。

采用人皮肤成纤维细胞(humanskinfibroblast，hsf)为靶细胞，考察人脐带间充质干细胞无血清调节培养液是否会促进hsf分泌更多的胶原蛋白，即是否具有抗衰功效。通过elisa试剂盒检测hsf培养上清中col-i含量。

以实施例3中得到的人脐带间充质干细胞无血清调节培养液为培养基，无血清dmem为对照组，在6孔板中接种hsf，细胞密度为2×10⁵/孔，采用上述培养基进行培养，收集24h的培养上清用于col-i检测。

elisa试剂盒96孔板加样，每孔加入标准品或待测样品100μl，将反应板充分混匀后置37℃反应40分钟；用洗涤液将反应板充分洗涤4-6次，向滤纸上印干；每孔加入蒸馏水和第一抗体工作液各50μl(空白除外)，将反应板充分混匀后置37℃20分钟；用洗涤液将反应板充分洗涤4-6次，向滤纸上印干；每孔加入酶标抗体工作液100μl，将反应板充分混匀后置37℃10分钟；用洗涤液将反应板充分洗涤4-6次，向滤纸上印干；每孔加入底物工作液100μl，置37℃反应暗处反应15分钟；每孔加入100μl终止液混匀，30分钟内用酶标仪在450nm处测吸光值。

根据标准品的浓度及对应的od值，计算出标准曲线的回归方程，再根据样品的od值计算对应的col-i浓度。

检测结果显示人脐带间充质干细胞无血清调节培养液作用于hsf24h后，col-i的分泌量较空白组提高了1.88倍，说明人脐带间充质干细胞无血清调节培养液能有效提高hsf中col-i合成，因此可以说明人脐带间充质干细胞无血清调节培养液可用作用防止皮肤衰老的抗皱物质。

通过上述方式，本发明的人脐带间充质干细胞无血清培养基，利用人脐带间充质干细胞无血清培养基替代传统含动物血清的培养基来培养人脐带间充质干细胞，避免了干细胞被病原体或动物源性成分污染及异种蛋白引起人体免疫反应等不安全因素。

人脐带间充质干细胞无血清培养基制备方法，在制备人脐带间充质干细胞无血清培养基时，添加了四种重组细胞生长因子和葡多酚，四种复合重组生长因子的作用是维持和刺激间充质干细胞的增殖，葡多酚的作用是提高间充质干细胞增殖活性，促进细胞分裂；添加了无血清培养上清液，同时对该上清液经过系列处理，上清液含有干细胞自身分泌的多种生长因子、胶原蛋白及营养物质，可以作为血清替代物存在。

人脐带间充质干细胞无血清培养液的培养方法可以有效地应用于抗皱、祛疤、皮肤浅表面创伤愈合修复等皮肤美容医学领域。采用本发明的人脐带间充质干细胞无血清培养基进行人脐带间充质干细胞培养，可以有效的改善人脐带间充质干细胞的贴壁生长及扩增能力。