一种天然小分子化合物诱导脐带间充质干细胞成骨分化的用途的制作方法

本发明属于干细胞领域，涉及间充质干细胞的增殖和诱导分化，具体涉及一种天然小分子化合物诱导脐带间充质干细胞成骨分化的用途。

背景技术：

骨缺损的发病率一直高居不下，由此引起的肢体功能障碍会严重影响患者生活质量。虽然，骨移植可以作为一种治疗手段，但是存在供源紧缺、完全愈合率低、术后并发症及免疫排斥反应等问题，临床应用受限。以干细胞为核心的组织工程与再生医学带来了新的希望。

间充质干细胞(mesenchymalstemcells，mscs)是一种具有自我更新能力的多能干细胞，具有免疫调节功能、来源丰富、易获取等特点，是骨组织工程优良的种子细胞。诱导mscs向成骨分化是骨组织工程治疗的重要步骤。在诱导干细胞成骨分化的众多方法中，利用天然小分子化合物促进干细胞分化具有明显的优势。天然小分子化合物不仅来源广、种类多、数量足、易获得、结构可控，而且可以高效、可逆、定向和准确地诱导细胞分化，乃至实现体细胞重编程和转分化。这些优点为干细胞组织工程疗法的大规模应用提供了可能。目前，已经公开的可以诱导mscs成骨分化的天然小分子化合物包括槲皮素、葛根素、白藜芦醇、姜黄素、egcg、小檗碱、人参皂苷rg1、齐墩果酸、虫草素等(王怡晴等，天然小分子化合物诱导间充质干细胞向成骨分化的研究进展，中草药，第50卷第11期2019年6月)。

远志酸是远志中的一种天然小分子化合物，目前未见其在间充质干细胞领域的活性报导。

技术实现要素：

本发明是为了提供一种天然小分子化合物诱导脐带间充质干细胞成骨分化的用途。

实现本发明目的的技术方案为：

一种天然小分子化合物体外诱导间充质干细胞成骨分化的用途，所述天然小分子化合物为远志酸。

优选地，所述间充质干细胞为脐带间充质干细胞。

一种天然小分子化合物体外促进间充质干细胞增殖并诱导其成骨分化的用途，所述天然小分子化合物为远志酸。

优选地，所述间充质干细胞为脐带间充质干细胞。

一种天然小分子化合物用于制备体外促进间充质干细胞增殖并诱导其成骨分化的培养基的用途，所述天然小分子化合物为远志酸。

优选地，所述间充质干细胞为脐带间充质干细胞。

有益技术效果：

本发明研究发现，天然小分子化合物远志酸不仅可以体外促进脐带间充质干细胞增殖，还可以促进其成骨分化；也就是说，脐带间充质干细胞经含有远志酸的培养基体外培养后，可以获得具有数量优势的骨组织工程细胞，用于骨组织工程与再生医学。

附图说明

图1为第4代脐带间充质干细胞的倒置显微镜观察结果；

图2为脐带间充质干细胞体外增殖曲线；

图3为茜素红染色结果(a)和westernblot检测结果(b)。

具体实施方式

下面通过具体实施例阐述本发明的实质性内容，但不能以此限定本发明的保护范围。

一、实验材料

胎牛血清(fbs)、α-mem培养基购自美国gibco公司。

ⅱ型胶原酶购自北京百奥莱博科技有限公司。

胰蛋白酶上海士锋生物科技有限公司。

青链双抗上海逍鹏生物科技有限公司。

远志酸购自成都瑞芬思生物科技有限公司，cas#:22338-71-2，hplc纯度≥98％。

二、实验方法

1、脐带间充质干细胞的分离及鉴定

取新鲜健康新生儿脐带于无菌条件下剔除血管及被膜，分离得到沃顿胶，清洗、剪碎，置于离心管中，加入ⅱ型胶原酶37℃水浴消化120min，震荡、离心后加入α-mem培养基中，混匀并转移至培养皿内，于37℃、5％co2培养箱中培养，培养液中含10％fbs和1％双抗，待细胞生长到75％左右，用0.25％胰蛋白酶消化传代，取第4代细胞于倒置显微镜下观察其细胞形态，并用于后续实验。

2、分组及培养

分为对照组和实验组，对照组使用含有10％胎牛血清和1％双抗的α-mem培养基培养，实验组使用含有25μm远志酸、10％胎牛血清和1％双抗的α-mem培养基培养。

3、mtt法测定脐带间充质干细胞的体外增殖活力

取第4代脐带间充质干细胞，消化，用含有10％胎牛血清和1％双抗的α-mem培养基制成浓度为1×10⁵/ml的细胞悬液，接种于96孔培养板，每孔150μl，对照组和实验组各6孔，3块96孔板平行操作，于37℃、5％co2培养箱中培养24h后，对照组更换为新的含有10％胎牛血清和1％双抗的α-mem培养基继续培养，实验组更换为含有25μm远志酸、10％胎牛血清和1％双抗的α-mem培养基继续培养，继续培养48、72、96h后分别取出一块96孔板，弃去培养基，pbs洗涤，每孔分别加入100μlα-mem培养基、20μl5mg/mlmtt溶液，于37℃、5％co2培养箱中培养4h后，吸弃上清，每孔加入dmso150μl，摇床振荡10min，测定490nm波长处吸光度od值，绘制对照组和实验组增殖曲线。

4、茜红素染色法测定脐带间充质干细胞成骨分化

取第4代脐带间充质干细胞，消化，用含有10％胎牛血清和1％双抗的α-mem培养基制成浓度为1×10⁵/ml的细胞悬液，接种于24孔板，对照组和实验组各5孔，于37℃、5％co2培养箱中培养24h后，对照组更换为新的含有10％胎牛血清和1％双抗的α-mem培养基继续培养，实验组更换为含有25μm远志酸、10％胎牛血清和1％双抗的α-mem培养基继续培养，每3d更换一次培养基，培养12d后，调节对照组和实验组至相同的细胞密度，茜素红染色，在倒置显微镜下观察、拍照。

5、westernblot法测定脐带间充质干细胞成骨分化

取第4代脐带间充质干细胞，消化，用含有10％胎牛血清和1％双抗的α-mem培养基制成浓度为1×10⁵/ml的细胞悬液，接种于24孔板，对照组和实验组各5孔，于37℃、5％co2培养箱中培养24h后，对照组更换为新的含有10％胎牛血清和1％双抗的α-mem培养基继续培养，实验组更换为含有25μm远志酸、10％胎牛血清和1％双抗的α-mem培养基继续培养，培养120h后，收集细胞，pbs洗涤，裂解细胞，收集细胞蛋白，用westernblot法测定对照组和实验组相同质量的细胞蛋白中成骨分化相关蛋白runx2和opn的表达水平，内参为gapdh。

6、数据处理

采用spss17.0进行统计学分析，数据以均值±标准差表示，采用单因素方差分析one-wayanova检验方差齐性，并用student’s-ttest进行分析，p<0.05表示具有显著性差异。

三、实验结果

1、脐带间充质干细胞的分离及鉴定结果

第4代脐带间充质干细胞的倒置显微镜观察结果如图1所示，从图1中可以看出，其呈现旋涡集落状排布生长，细胞均一度高，符合脐带间充质干细胞的细胞形态学特征。

2、远志酸对脐带间充质干细胞体外增殖活力的影响

脐带间充质干细胞体外增殖曲线如图2所示，培养48、72、96h后，实验组细胞密度均显著高于对照组，尤其是96h增加最为明显。该增殖曲线表明，远志酸可以显著促进脐带间充质干细胞体外增殖。

3、远志酸对脐带间充质干细胞成骨分化的影响

茜素红染色结果如图3中(a)所示，从图3(a)可以看出，对照组成骨钙结节不明显，而实验组出现显著的成骨钙结节。westernblot检测结果如图3中(b)所示，从图3(b)可以看出，对照组成骨分化相关蛋白runx2和opn表达极弱，而实验组出现显著的强表达。茜素红染色结果和westernblot检测结果均表明，远志酸可以显著促进脐带间充质干细胞成骨分化。

上述实施例表明，天然小分子化合物远志酸不仅可以体外促进脐带间充质干细胞增殖，还可以促进其成骨分化；也就是说，脐带间充质干细胞经含有远志酸的培养基体外培养后，可以获得具有数量优势的骨组织工程细胞，用于骨组织工程与再生医学。