一株禽传染性支气管炎病毒的天然弱毒株及其应用的制作方法

本发明属于生物技术领域，涉及一株禽传染性支气管炎病毒的天然弱毒株及其应用。

背景技术：

禽传染性支气管炎(ib)是由禽传染性支气管炎病毒(ibv)引起的一种急性、高度接触性传染病。ibv感染发病后临床症状与病理变化主要集中在呼吸道、肾脏及生殖道，进而造成家禽肉料比降低，产蛋量与产蛋品质下降，继发感染后死亡率增加，给我国养禽业带来巨大经济损失。ibv最早于20世纪80年代初在我国分离报道，随后在我国广泛流行。该病病原的血清型很多，不同血清型毒株的交叉保护效果差，虽然ibv疫苗(mass、4/91及tl/ch/ldt3/03型疫苗)广泛使用，但ib仍然频繁爆发，而且新的血清型、基因型或变异株不断出现，ib的防控带来巨大挑战。

qx毒株于1997年在我国最早报道，随后在亚洲、欧洲及非洲等许多国家开始流行。该型病毒最早报道qxibv毒株主要导致腺胃病变，属于腺胃型。但近些年报道显示该型毒株主要致肾脏与呼吸道病变，并且可以引起雏鸡死亡。有文献报道我国1995至2009年间分离ibv毒株中超过50％属于qx型ibv，而这一比例在我国南部部分地区可能更高。在ib流行地区使用mass、4/91及tl/ch/ldt3/03型弱毒苗，如h120、h52、4/91及ldt3-a，部分地区甚至进行联合使用，但免疫后该型ibv仍然频繁爆发与分离报道，同样有文献报道mass型弱毒苗h120不能预防该型病毒。综上所述，我国目前频繁使用的商品化疫苗不能有效预防qx型ibv发病。

为了控制该病的流行和发生，经对发病鸡进行病原分离鉴定和序列分析，并进行了相关动物免疫试验，取得了较好效果。

技术实现要素：

发明目的：本发明基于发明人对ibv(ck/ch/2014/ql1403)的分离和鉴定，提供了一种可以作为疫苗的ibv分离毒株。所述病毒是最近在中国的一个鸡群中进行常规病原监测过程中分离出来的，由禽类预防医学省部共建教育部实验室保管。该分离病毒有囊膜的单链rna病毒，属巢病毒(nidovirales)目冠状病毒科(coronaviridae)。该禽传染性支气管炎病毒的天然弱毒株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2019年1月27日，保藏编号为cctccno：v201907，其分类命名为鸡传染性支气管炎病毒ql1403。本发明涉及已知的冠状病毒科成员相关的分离的一株禽传染性支气管炎病毒。

本发明所要解决的技术问题是提供了该禽传染性支气管炎病毒的天然弱毒株在制备预防或治疗禽传染性支气管炎药物方面的应用。

本发明还要解决的技术问题是提供了一种预防或治疗禽传染性支气管炎滴剂。

本发明最后要解决的技术问题是提供了一种预防禽传染性支气管炎疫苗。

技术方案：为实现上述技术目的，本发明采取如下的技术方案：一株禽传染性支气管炎病毒的天然弱毒株，该禽传染性支气管炎病毒的天然弱毒株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2019年1月27日，保藏编号为cctccno：v201907，其分类命名为鸡传染性支气管炎病毒ql1403。

其中，应用重组技术分析发现，ck/ch/2014/ql1403天然弱毒株的基因组20395-24840片段发生了重组。进一步对基因组序列重组来源分析显示ck/ch/2014/ql1403来源于qx与tc07-2型毒株自然重组，通过进化树分析分析得到该毒株属于ibv新型毒株。

本发明内容还包括所述的禽传染性支气管炎病毒的天然弱毒株在制备预防禽传染性支气管炎疫苗方面的应用。

本发明内容还包括一种预防禽传染性支气管炎疫苗，所述疫苗包括所述的禽传染性支气管炎病毒的天然弱毒株。

其中，所述禽传染性支气管炎为鸡传染性支气管炎。

与现有技术相比，本发明具有如下优点和有益效果：

1、本发明涉及的禽传染性支气管炎病毒的天然弱毒株

ibvck/ch/2014/ql1403，动物实验显示该毒株不引起spf鸡产生临床症状与病理变化，属于天然弱毒株。

2、本发明涉及的ibv疫苗，是由本发明的发明人将分离的禽传染性支气管炎病毒的天然弱毒株ibvck/ch/2014/ql1403接种spf鸡胚增殖后收集制成。免疫spf鸡14天后，鸡群ibv抗体反应全部阳性；免疫spf鸡28天后，用qx基因型ibv的野毒株攻击接受新疫苗的鸡群。新的疫苗提供了足够的针对qx基因型ibv的抗体滴度，并为鸡群提供了有效的保护。

附图说明

图1显示ibvck/ch/2014/ql1403s1基因(genbank检索号ku361188)进化树分析结果。s1基因进化树分析显示ck/ch/2014/ql1403与ck/ch/ibtz/2012(genbank检索号kf663559)及ck/ch/sd09/005(genbank检索号kf668605)株同属一个基因分支，属于ibv新型毒株，系统树是通过邻接法构建的，自引导值是从1000个重复中推断得出的。

图2a显示ibvck/ch/2014/ql1403基因组序列(genbank检索号ku361188)位点同源性分析结果。参考株ck/ch/sd09/005(genbank检索号kf668605)与ck/ch/2014/ql1403基因组序列位点同源性以红线显示；参考株sdib821/2012(genbank检索号kf574761)与ck/ch/2014/ql1403基因组序列位点同源性以蓝线显示；参考株m41(genbank检索号dq834384)与ck/ch/2014/ql1403基因组序列位点同源性以灰线显示。

图2b显示ibvck/ch/2014/ql1403基因组序列(genbank检索号ku361188)不同片段进化树分析结果。进化树分析显示ck/ch/2014/ql1403基因组序列片段1至20394和24841至27691与sdib821/2012(genbank检索号kf574761)及yx10(genbank检索号jx840411)株同属一个基因分支，属于ibvqx型毒株；ck/ch/2014/ql1403基因组序列片段20395～24840与ck/ch/ibtz/2012(genbank检索号kf663559)及ck/ch/sd09/005(genbank检索号kf668605)株同属一个基因分支，属于ibv新型毒株。系统树是通过邻接法构建的。自引导值是从1000个重复中推断得出的。

具体实施方式

下面申请人将结合具体的实施例对本发明产品的制备过程及应用过程做详细说明，便于本领域技术人员清楚地理解本发明。但应该理解，以下实施例不应以任何方式被解释为对本申请权利要求书请求保护范围的限制。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

ibv分离株ck/ch/2014/ql1403分离自江苏某鸡群。具体分离方法如下：取临床送检鸡，采集气管、肺、肾脏、输卵管等。组织样品用pbs(含10000u青霉素和100μg链霉素，ph7.2)制成10％w/v匀浆，4℃，5000×g离心10min，取上清置37℃恒温箱作用20min，处理好的样品通过绒毛尿囊腔接种9～11日龄spf鸡胚，0.2ml/只，37℃培养观察120h，弃去24h内死亡鸡胚，无菌收集尿囊液，盲传3代后观察到ibv感染后的特征性病变。分离得到的ibv分离株ck/ch/2014/ql1403保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2019年1月27日，保藏编号为cctccno：v201907，其分类命名为ql1403。

感染该病毒的鸡胚发育不良，胚体偏小且蜷缩，肾脏尿酸盐沉积。一般初次接种后鸡胚病变不明显。

randomhexamer购自华大基因。

ribolockrnaseinhibitor购自thermo，产品目录号为eo0381。

m-mlv反转录酶购自takara，产品目录号为d2639a。

lataqdna聚合酶购自购自takara，产品目录号为rr25a。

5’-fullrace试剂盒购自takara，产品目录号为d315。

3’-fullrace试剂盒购自takara，产品目录号为d314。

spf鸡胚购自法国梅里亚公司。

实施例1ibvck/ch/2014/ql1403的分离与序列测定

1、将病毒ql1403经绒毛尿囊腔途径接种9-11日龄spf鸡胚，48小时后无菌收取鸡胚尿囊液；

2、提取ck/ch/2014/ql1403尿囊液病毒ql1403的rna；

3、以病毒ql1403的rna(vrna)为模板进行反转录。

反转录过程如下：

randomhexamerprimer2.0μl

vrna8.0μl

总体积10μl

依次加入上述各成分，均匀混合，瞬时离心。70℃保温10min，迅速冰浴3min得到反应液。其中vrna指步骤2提取得到的病毒的rna。

随后在上述体系中继续加入如下成分：

反应液10.0μl

m-mlv反转录酶1.0μl

5×m-mlvbuffer4.0μl

ribolockrnaseinhibitor0.5μl

dnips1.0μl

ddh2o3.5μl

总体积20μl

均匀混合，瞬时离心。30℃保温10min，42℃保温60min，70℃保温15min。将反转录后的cdna产物作为pcr反应的模板。

4、pcr扩增

pcr反应体系如下：

其中cdna为步骤3得到的ck/ch/2014/ql1403病毒的cdna。

其中所用引物序列如表1：

表1ibvck/ch/2014/ql1403全序列扩增引物序列

依次加入以上各成分，然后分别加入上游引物和下游引物，瞬时离心混匀，进行pcr反应；分别得到目的片段。

pcr反应条件如下：

基因组cdna5’端与3’端序列分别用5’-fullrace与3’-fullrace试剂盒扩增。

6、鉴定pcr扩增产物，各个目的片段大小正确后测序，将测序结果拼接后得到ibvck/ch/2014/ql1403s1基因序列(全基因可以从sequenceid：ku361188.1获得，s1基因序列accessiongenbankku361198)。

7、对ibvck/ch/2014/ql1403s1基因(genbank检索号ku361198，参见seqidno：47)进化树分析结果。s1基因进化树分析显示ck/ch/2014/ql1403与ck/ch/ibtz/2012(genbank检索号kf663559)及ck/ch/sd09/005(genbank检索号kf668605)株同属一个基因分支，属于ibv新型毒株，系统树是通过邻接法构建的，自引导值是从1000个重复中推断得出的。

8、对ibvck/ch/2014/ql1403基因组序列(genbank检索号ku361188)位点同源性分析，参考株ck/ch/sd09/005(genbank检索号kf668605)与ck/ch/2014/ql1403基因组序列位点同源性以红线显示；参考株sdib821/2012(genbank检索号kf574761)与ck/ch/2014/ql1403基因组序列位点同源性以蓝线显示；参考株m41(genbank检索号dq834384)与ck/ch/2014/ql1403基因组序列位点同源性以灰线显示；

9、将ibvck/ch/2014/ql1403基因组序列(genbank检索号ku361188)的不同片段进化树分析结果。进化树分析显示ck/ch/2014/ql1403基因组序列片段1至20394和24841至27691与sdib821/2012(genbank检索号kf574761)及yx10(genbank检索号jx840411)株同属一个基因分支，属于ibvqx型毒株；ck/ch/2014/ql1403基因组序列片段20395～24840与ck/ch/ibtz/2012(genbank检索号kf663559)及ck/ch/sd09/005(genbank检索号kf668605)株同属一个基因分支，属于ibv新型毒株。系统树是通过邻接法构建的。自引导值是从1000个重复中推断得出的。

实施例2ibvck/ch/2014/ql1403的免疫原性与安全性检测

1、将30只1日龄spf鸡随机分为a、b两组，每组15只鸡。a组为实验组，分别经滴鼻点眼途径每只免疫10^4.8个eid50的ibvck/ch/2014/ql1403；b组为对照组，分别经滴鼻点眼途径接种pbs0.2ml/只，观察28天。

2、免疫后21、28天通过翅静脉采血，分离各组鸡的血清，用于测定血清的抗体反应情况。

3、血清的抗体反应测定

1)分别将ibv新型ck/ch/2014/ql1403及qx型ck/ch/2014/fj14尿囊液病毒(genbank登录号mn262521)按照100个eid50/0.1ml的浓度进行稀释。

2)将步骤1)中病毒液等体积与血清混合，37℃水浴锅中作用30min。

3)将步骤2)中反应液以0.2ml/只量接种10日龄spf鸡胚，37℃培养观察7天。结果如表2所示。

表2ibvck/ch/2014/ql1403免疫鸡只产生的抗体反应结果

表2表明，用ibvck/ch/2014/ql1403免疫spf鸡21天后，血清中的抗体均呈阳性，且能够有效中和100个eid50的ibv新型ck/ch/2014/ql1403及qx型ck/ch/2014/fj14尿囊液病毒。

4、在整个过程中，所有ibvck/ch/2014/ql1403攻毒的spf鸡完全正常。而且，已经用ibvck/ch/2014/ql1403病毒免疫的spf鸡表现出良好的血清学反应，阳性血清抗体可以有效中和ibv，这是有效的ibv疫苗的基本要求。

实施例3ibvck/ch/2014/ql1403的保护性检测

1、将40只7日龄spf鸡随机分为a、b、c三组，分别包含15、15、10只鸡。a组为实验组，在第1天分别经滴鼻点眼途径每只免疫10^4.5个eid50的ibvck/ch/2014/ql1403，第28天分别经滴鼻点眼途径每只攻毒10^4.6个eid50的ibvqx型ck/ch/2014/fj14；b组为阳性对照组，在第1天分别经滴鼻点眼途径接种pbs0.2ml/只，第28天分别经滴鼻点眼途径每只攻毒10^4.5个eid50的ibvqx型ck/ch/2014/fj14；c组为阴性对照组，分别在第1天与第28天经滴鼻点眼途径接种pbs0.2ml/只。观察56天。

2、攻毒后每天观察鸡群发病情况，包括鸡群临床症状、死亡情况与鸡群增重情况，临床症状包括咳嗽、甩鼻、张口呼吸及气管啰音等呼吸道症状。分别于第28、56天给鸡群称重。

鸡群体重计算方法：所有鸡只质量之和/总鸡只数±标准误差

结果如表4所示

表4鸡群体重统计表

3、计算免疫保护率

免疫保护率计算方法：未发病鸡只数/总鸡只数。

结果如表3所示

表3ibvck/ch/2014/ql1403毒株保护率

根据上述结果显示ibvck/ch/2014/ql1403的免疫保护率均为100％。说明ibvck/ch/2014/ql1403可以用于保护鸡免受ibvqx型病毒(ck/ch/2014/fj14)的感染。

序列表

<110>扬州大学

<120>一株禽传染性支气管炎病毒的天然弱毒株及其应用

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