一种CTLA-4单克隆抗体5H7及其用于抗肿瘤的用途的制作方法

本发明涉及抗体领域，更具体的涉及一种ctla-4单克隆抗体及其用于抗肿瘤的用途。

背景技术：

细胞毒性t淋巴细胞相关抗原4(cytotoxictlymphocyte-associatedantigen-4,ctla-4)，表达于活化的cd4+和cd8+t细胞的跨膜受体，是一种白细胞分化抗原，与t细胞表面的协同刺激分子受体(cd28)具有同源性，结合相同配体b7-1/b7-2。ctla-4能平衡cd28介导的信号，防止淋巴细胞过渡激活。t细胞的活化需要两组信号的刺激，t细胞抗原识别受体与主要组织相容性复合体抗原肽结合作为第一信号、第二信号来自抗原呈递细胞(apc)与t细胞表面协同刺激受体的结合。t细胞表面受体细胞毒性t淋巴细胞相关抗原4(ctla-4)与apc表面的配体b7是一对协同共刺激信号，在t细胞的激活中起负性调节作用。研究显示，ctla-4在自身免疫性疾病的发生发展中起重要作用。格雷夫斯病(graves'disease，gd)、系统性红斑狼疮(systemiclupuserythematosus，sle)、乳糜泻疾病(celiacdisease，cd)等多种自身免疫性疾病患者血清中可溶性ctla-4的水平较健康对照组高，但这种高表达的生物学意义尚未完全阐明。

有研究发现，ctla-4在自身免疫应答过程中通过调节抗炎/促炎细胞因子的平衡，进而调节疾病进程。小鼠ctla-4废除实验表明，ctla-4缺陷影响中枢和外周的免疫耐受及调节性t细胞(regulatorytcell，treg)介导的免疫抑制。ctla-4在t细胞激活中的重要调节作用，让以ctla-4参与的共刺激通路为切入点探究治疗自身免疫性疾病的新途径受到广泛关注。ctla-4又被称作cd152，属于免疫球蛋白超家族成员。ctla-4是由ctla-4基因编码的t细胞表面跨膜蛋白，主要在活化的cd+4和cd+8t淋巴细胞以及活化的b淋巴细胞表面表达。人类ctla-4基因位于第2号染色体长臂33带，包含4个外显子，分别编码引导序列、配体结合区域、跨膜区域以及胞质尾区。ctla-4有两种亚型，分别是由4种外显子编码的全长型ctla-4(flctla-4)和除编码跨膜区域外的其他3种外显子编码的可溶型ctla-4(sctla-4)；sctla-4来源于可以导致一个半胱氨酸残基丢失的选择性剪接，是存在于血清的可溶性单体蛋白。活化的t细胞低表达sctla-4蛋白，高表达flctla-4蛋白。

关于ctla-4的功能和作用机制已研究多年，但至今尚未形成定论，比较公认的是ctla-4在t细胞的活化中起负调控作用，从而保持t细胞的活化平衡。在t细胞活化所必需的共刺激信号中，b7/cd28信号起着十分重要的作用，cd28分子在t细胞表面组成性表达，且能在同源apc/t细胞相互作用时结合apc表面的配体b7-1(cd80)和b7-2(cd86)，通过cd28传递的信号促进t细胞活化、增殖以及细胞因子的产生。b7分子的另一个受体是ctla-4，与cd28相反，ctla-4并不在t细胞组成性表达，只有在t细胞过度激活的时才上调。

越来越多的证据表明，ctla-4阳性细胞可修饰apc的表型，从而调节幼稚t细胞的启动。需要注意的是，ctla-4能通过反式内吞作用下调apc上共刺激配体的表达，从而抑制t细胞的增殖活化。ctla-4阳性细胞作为调节剂存在的情况下，静止t细胞应答的抑制效应依赖于ctla-4的表达，且与apc的数目极度相关。在低数目的apc或低水平配体下，ctla-4依赖性抑制非常有效；而在较高数目的apc或高水平配体下，抑制丧失。故抑制程度与保留在apc上cd86的表达水平有关。

目前关于ctla-4调控免疫应答的具体机制尚未完全明了，研究结果相悖的情况也常发生。schneider等报道，ctla-4通过破坏zap-70微团簇的形成而传递抑制信号，而此前研究认为ctla-4并不影响zap-70的招募或磷酸化作用。ctla-4是少数免疫基因之一，缺失会导致致命性的淋巴组织增生性疾病，但也有研究报道，在成年小鼠模型中消除ctla-4不会引起自发性自身免疫性疾病，提示ctla-4在不同时期不同情形下的作用还需要进一步明确。simone等研究自身免疫性疾病与ctla-4的关系时发现，自身免疫性疾病组血清sctla-4的水平较健康对照组升高。用双向混合淋巴细胞反应诱导发现，自身免疫性疾病患者血清sctla-4能抑制t细胞增殖，减少γ干扰素、白细胞介素(interleukin，il)-2、il-13的分泌，提高转化生长因子β(transforminggrowthfactor-β，tgf-β)和il-10的水平，提示sctla-4对细胞因子的产生具有双重作用，即精细调节免疫应答过程中激活因子与抑制因子间的平衡。将ctla-4作为免疫检查点来研究治疗自身免疫性疾病的新途径已渐成趋势，使用abatacept(ctla4-ig)阻断b7通路是近年来研究的热点，并显示出成效。也有研究采用人多发性硬化动物模型eae模型探索b7通路阻塞的影响发现，阻断b7通路会导致更严重的疾病。ctla-4作为调节t细胞活化平衡的重要分子，为自身免疫性疾病的治疗开辟了新的途径。

ctla-4阻断性抗体广泛用于治疗前列腺癌、肾癌、黑色素瘤等。表达4-1bbl的肿瘤细胞疫苗结合ctla-4阻断剂，较单独使用组相比较，联合组明显降低小鼠前列腺癌rm-1肿瘤并明显增加存活率，联合组导致更高的ctl，及混合细胞培养上清中细胞因子ifn-γ、tnf-α和il-2的分泌增加。以上结果提示结合4-1bb与ctla-4阻断可能为前列腺癌免疫治疗提供了一种新的策略。实际上，抗cla-4抗体对于弱免疫原性的肿瘤效果不明显，但与gm-csf表达的肿瘤疫苗或其它抗体相结合则可明显增强疗效。与冷冻消融术或ctla-4阻断单独使用相比，联合使用减缓或防止了大量继发性肿瘤的生长。减少了cd4+和cd8+效应细胞的扩增，同时效应t细胞与调节性t细胞的比值上升。

第一个被批准的ctla-4单抗yervoy(伊匹单抗)，2011年获批治疗转移/不可切除黑色素瘤，2015年10月扩大适应症用于治疗黑色素瘤，与opdivo联合用药可以显著提高客观缓解率，延长无进展生存期。该药2017年一季度销售额约为3.3亿美元。基于该抗体的巨大商业利益，针对该靶点研究也变得非常热门。

但是现有技术中针对ctla-4的抗体虽然也有涉及，但是种类还不够多，特异性表位的抗体以及活性高的抗体还不能满足需求。

技术实现要素：

本发明一方面提供一种ctla-4的抗体,其能够高亲和力的结合ctla-4抗体。

具体的，抗ctla-4单克隆抗体，轻链可变区的氨基酸序列如seqidno:1所示，重链可变区的氨基酸序列如seqidno:5所示。

更具体的，在全人源抗ctla-4单克隆抗体中，重链恒定区为同种型人ch的恒定区，轻链恒定区为人cl的恒定区。

一种抗ctla-4单克隆抗体，含有重链和轻链(重链和轻链通过二硫键连接)，重链可变区含有cdr1、cdr2和cdr3三个高变区，轻链可变区含有cdr1、cdr2和cdr3三个高变区，lc-cdr1-3序列如seqidno：2-4所示；hc-cdr1-3如seqidno：6-8所示。

更具体的所述序列如下所示：

5h7轻链序列：

diqltqspssvsasvgdrvtitcqravpsyqqvvwyqqkpgkapklliyklsqpdtgvpsrfsgsgsgteftltisslqpedfatyycstggsfydgifgpgtkvdik(seqidno:1)；

lc-cdr1:qravpsyqqvv(seqidno:2)

lc-cdr2:klsqpdt(seqidno:3)

lc-cdr3:stggsfydgi(seqidno:4)

5h7重链序列：qvqlqqsgpglvkpsqtlsltcaisgdtvspsggsmqwirqspsrglewlgrtyqavssrrteedtsynnrmtinadtsknqvslhlnsvtpedtavyycaraygsdiqpswgqgtlvtvss(seqidno:5)；

hc-cdr1:psggsmq(seqidno:6)

hc-cdr2:rtyqavssrrteedtsynn(seqidno:7)

hc-cdr3:aygsdiqps(seqidno:8)

进一步的，本发明还提供一种如上述抗ctla-4单克隆抗体的编码基因。

进一步的，抗ctla-4单克隆抗体编码基因的表达载体。

更进一步的，本发明提供了ctla-4抗体在制备抗肿瘤药物中的应用。

有益效果

本发明提供一种ctla-4抗体，该抗体能够特异性的结合ctla-4蛋白的特定表面抗原，并且结合效果较好，具有较好的应用价值及市场前景，可以用于医药领域。

附图说明

图1为sds-page电泳图，图中条带为ctla-4蛋白。

图2为抗ctla-4抗体的体内活性分析图，其中5h7抗体肿瘤抑制效果明显，nc对肿瘤没有抑制作用。

具体实施方式

本领域技术人员将容易了解的是，本发明非常适于执行所提及的目标并获得结果和优点以及其中固有的那些。本文所提供的实施例代表优选的实施方案，为示例性的，并且不旨在为对本发明的范围的限制。

实施例1ctla-4蛋白的制备

以人血液dna为模板，以引物f(xbaⅰ)：atgcacgtggcccagcctgc，r(nheⅰ)：tcacattctggctctgttgg进行常规pcr扩增；xbaⅰ和nheⅰ双酶切真核表达质粒pvax1表达载体,回收纯化；ctla-4dna片段与回收纯化的xbaⅰ和nheⅰ双酶切真核表达质粒pvax1产物在t4连接酶作用下16℃连接过夜；产物转化感受态e.colitop10f,挑取单克隆于3mllb培养基37℃培养过夜；碱裂解法抽提质粒,单酶切和双酶切进行鉴定；大量抽提鉴定正确的真核表达质粒pvax1-ctla-4质粒,用notⅰ酶切使其线性化,纯化回收；cho/dg44细胞传代于六孔板中,使其在转染日细胞融合度为80％～90％。采用脂质体转染试剂盒共转染线性化了的pvax1-ctla-4，按其说明书进行(同时以pvax1空载体作为对照)。转染50h后改用含10％透析血清的α-mem培养基培养(不含次黄嘌呤和胸腺嘧啶)。14d后出现阳性克隆,胰酶消化挑出多个生长旺盛的单克隆改用无血清培养基继续培养,适应后用10^-7mol/l的dex诱导48h使其表达。收集诱导48h的细胞培养上清,离心去杂质,超滤法浓缩细胞上清。浓缩的细胞培养上清用proteina-agarose纯化。最后收集在预冷2mol/l的tris-hcl的中和缓冲液(ph9.0)中。将洗脱下的蛋白常规的sds-page方法进行蛋白检测。结果如图1所示，本发明制备得到了较为纯净的ctla-4蛋白。将所述蛋白以10mg/ml的浓度贮藏备用。

实施例2单克隆抗体的制备

用实施例1制备得到ctla-4蛋白加弗氏佐剂免疫6～8周龄雌性balb/c小鼠，3周后用融合蛋白加不完全佐剂强化免疫2次，末次免疫3d后取小鼠脾细胞与sp2/0融合。elisa筛选仅与实施例1融合蛋白反应的阳性单克隆杂交瘤细胞，经3次亚克隆及elisa检测完全阳性后，扩大培养并建株。具体的，筛选得到了2株单克隆抗体效果最有显著，其中1株具体的类型及效价检测结果如表1所示：

腹腔积液单抗的制备、纯化灭菌pbs溶液洗涤杂交瘤细胞，重悬至2×10⁶/ml，采用腹腔注射方式将重悬的杂交瘤细胞注射到降植烷预致敏的balb/c小鼠体内(0.5ml/只)。7-10d后待腹水形成收集腹水；室温下3000r/min离心10min，收集腹水上清(其内即含单克隆抗体)，对腹水上清中的单克隆抗体进行纯化，并保存被用。

实施例3不同单抗识别ctla-4蛋白抗原表位的区域确定

将ctla-4蛋白按照如下的截短体形式分别进行原核表达，具体截短体形式如下：mhvaqpavvlassrgiasfvceyaspgkatevrvtvlrqadsqvtevcaatymmgneltflddsictgt、mhvaqpavvlassrgi、asfvceyaspgkatevrvtv、lrqadsqvtevcaatymmgneltflddsictgt、tevcaatymmgn、ssgnqvnltiqglramdtglyickvelmypppyylgigngtqiyviakekkpsynrglcenapnrarm、ssgnqvnltiqgl、ramdtglyickvelmypppyylgigngtqiyviakekkpsynrglcenapnrarm、gigngtqiyviake、gigngtqiyviakekkpsynrglcenapnrarm。将实施例2制备得到的单抗用elisa检测与不同ctla-4蛋白截短体的反应，综合单抗与不同截短体蛋白的elisa和westernblot检测结果，确定了单抗识别位点所在的区域是:5h7抗体的抗原表位为asfvceyaspgkatevrvtv。

实施例4流式细胞术测评抗体结合细胞膜表面ctla-4抗原的结合能力

收集处于对数生长期的膜表面过表达人ctla-4的cho/dg44细胞系，用pbs洗细胞2次后用facs缓冲液(含2％胎牛血清的pbs溶液)重悬细胞。调节密度，以2x105个细胞/孔铺板于96孔u底板中，300g离心5分钟，倾去上清，添加已梯度稀释的ctla-4抗体溶液而后置于冰上孵育40分钟。洗细胞2次，添加100μl/孔藻红蛋白荧光标记的羊抗小鼠二抗，4度避光孵育40分钟后，洗细胞3次，而后每孔加100μl的facs缓冲液重悬，吹匀细胞后上机检测。使用bd公司cantoii型号流式细胞仪测定每孔细胞的荧光强度。使用graphpadprism软件进行数据处理，得出5h7抗体结合细胞的ec50浓度值为38.9pm。另外，使用常用kd检测方法(elasa法)检测得到5h7抗体抗体的kd为120.3pm,具有较好的结合特性，而本领域常用的对照抗体(伊匹单抗(ipilimumab))其ec50浓度值为15.6nm，其kd为25.3nm。

实施例5抗ctla-4抗体的体内活性分析

使用结肠癌mc38细胞在肿瘤生长的小鼠模型体内测试二种单抗的活性。在第0天，用2×10⁶个mc38细胞皮下接种小鼠。从第8天开始，给小鼠腹膜内注射剂量(每只动物200μg)的5h7抗体，对照为pbs。在整个实验过程中测量肿瘤大小。实验的结果显示在图2中显示。结果显示5h7抗体对控制肿瘤生长是有效的。而对照的小鼠肿瘤生长较为显著。在30天周肿瘤体积达到了接近1800mm³。同样天数下，5h7抗体治疗后的小鼠肿瘤体积只有不到200mm³，体积明显缩小。

应当理解的是，本发明在其应用上并不一定局限于在以下说明中所描述和/或在附图中所说明的组件的构造和布置的细节。本发明能够具有除所述和以不同方式实践或进行的那些实施方案之外的实施方案。而且，应理解本文所采用的短语和术语以及摘要出于描述目的并且不应视为限制性的。

这样，本领域技术人员将了解在基于本公开时的概念可容易用作设计用于执行本发明的若干目的的其他结构、方法和系统的基础。因此，重要的是权利要求书应被认为是包括此类等效结构至它们不背离本发明的精神和范围的程度。

虽然已描述并详细举例说明本发明至足以使本领域技术人员制备和使用它，但是在不背离本发明的精神和范围的情况应清楚各种替代方案、修改和改进。本文所提供的实施例代表优选的实施方案，为示例性的，并且不旨在为对本发明的范围的限制。其中的修改和其他用途将是本领域技术人员能够想到的。在本发明的精神内涵盖这些修改并且由权利要求书的范围限定这些修改。

序列表

<110>苏州立豪生物科技有限公司

<120>一种ctla-4单克隆抗体5h7及其用于抗肿瘤的用途

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