基于双重链置换和三向DNA结构检测妥布霉素的比色方法与流程

本发明涉及一种基于双重链置换和三向dna结构检测妥布霉素的比色方法，属于食品安全、医药分析及环境污染检测领域。

背景技术：

氨基糖苷类抗生素是由两个或多个通过糖苷键与己糖环连接的氨基糖组成的抗生素，对常见的细菌性疾病具有良好的治疗效果。妥布霉素是一种广谱氨基糖苷类抗生素，主要用于治疗某些革兰氏阳性和好氧革兰氏阴性微生物引起的感染。其机制是与核糖体结合，从而破坏合成蛋白，导致细胞膜损伤和细胞死亡。由于妥布霉素具有良好的水溶性，低成本和广泛的抗菌谱特性，因此被广泛用于畜牧业。然而，过量和错误使用妥布霉素导致动物源性食品（如牛奶，鸡蛋和肉类）和环境中大量残留，这些残留物会对人类健康产生严重的副作用，如过敏，肾毒性和神经毒性。

到目前为止，已有多种传统和可靠的方法用于测定氨基糖苷类抗生素（包括妥布霉素），包括高效液相色谱（hplc），毛细管区域电泳，酶联免疫吸附测定（elisa）和表面等离子共振用于转移定位等。但是，这些方法存在一些缺点，如检测限高，设备昂贵，测试周期长，人员培训和样品制备复杂。因此，有必要建立一种简单，快速，准确的检测食品和环境中妥布霉素残留的检测方法。

g-四链体是一种特殊的dna构型，通过在特定离子条件下折叠富含鸟嘌呤的核酸序列形成，并且与单价阳离子和hoogsteen氢键稳定。当g-四链体与血红素结合时，形成的g-四链体/血红素复合物具有辣根过氧化物酶活性，其能够催化h2o2介导的氧化还原反应以产生电化学信号和比色信号。同时，与传统的生物酶相比，g-四链体/血红素具有成本低，稳定性好，易于制备的优点，因此被广泛应用于各种生物传感器的开发中。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种基于双重链置换和三向dna结构检测妥布霉素的比色方法，其具有高灵敏、高特异性、低成本、结果可视化等优点。

本发明的技术方案，本发明具体包括非完全互补双链设计和三向dna连接结构的序列设计；bsmdna聚合酶通过强链置换反应合成完全互补的双链，nt.bstnbi切刻内切酶切割双链上的识别位点，产生大量的报告探针；三向dna结构与报告探针杂交，触发λ核酸外切酶辅助的环路扩增，刺激报告探针再生并置换出大量s1（含有g-四链体形成序列）；g-四链体/血红素复合物催化abts^2-/h2o2系统产生显色反应并通过uv-vis分光光度计测量吸光度，如图1所示。

步骤如下：首先将序列t1和t2以相同的浓度混合，t1和t2高温变性并退火形成双链，t2的3’末端被阻断，确保在没有靶标的情况下不存在非特异性扩增。当存在妥布霉素时，靶标与t1上的适配体区域结合，暴露t2的3’末端。然后加入引物1、引物2、nt.bstnbi切刻内切酶、bsmdna聚合酶和游离的脱氧核糖核苷三磷酸到反应体系中，随后bsmdna聚合酶通过强链置换反应合成含有nt.bstnbⅰ识别位点的dna双链体，并且可以将其切割以释放报告探针。同时，随着引物2的延伸，由于聚合酶的强链置换活性，妥布霉素可以与t1-妥布霉素复合物解离，并且释放的妥布霉素可以识别新的t1-t2双链体以启动下一轮等温扩增，产生更多的报告探针。因此，妥布霉素触发的聚合酶和核酸内切酶辅助的等温扩增系统具有多循环信号放大机制并产生大量报告探针。

同时，设计了三向dna结构复合物。s1、s2和s3经高温变性和退火形成的三向dna结构，将三向dna连接结构高温变性，三向dna连接结构与报告探针杂交，触发λ核酸外切酶辅助的环路扩增，刺激报告探针再生并置换出大量s1（含有g-四链体形成序列）。在加入血红素后，此后，g-四链体/血红素复合物催化abts^2-/h2o2系统产生显色反应并通过uv-vis分光光度计测量吸光度。利用吸光值与妥布霉素的浓度的线性关系计算样品中的妥布霉素含量。

进一步地，所述t1、t2、引物1和引物2序列具体为：

t1:5’-ctgccgtgactaggcactagtctcaacgagtcgcgt-3’；

t2:5’-ttttttttttttagtcatgcttgatgactcgttgacttatcccaattgtcacggcag-3’；

引物1:5’-ctgccg-3’；

引物2:5’-ttttttttttttagtcatgctacgcgactcg-3’。

所述s1、s2及s3序列具体为：

s1:5’-p-ttttttttttttagtcatgcttctcggtgtgacaggcaactccgggttgggcgggatgg-3’；

s2:5’-ttaattataataaccagttgcctggatgatcgaga-3’；

s3:5’-p-ttttttttttttagtcatgctcccatcccgcccaacccccttattataattaa-3’。

进一步地，所述s1和s3为5’端修饰磷酸基团的dna序列。

基于双重链置换和三向dna结构检测妥布霉素的比色方法，具体步骤如下：

（1）靶标识别：t1包含妥布霉素适配体序列及与t2和引物2互补的序列，将t1和t2以相同的浓度混匀，在95℃高温变性后再于37℃复性形成部分互补双链；将10~50nm双链与4μl不同浓度的妥布霉素溶液混匀，在37℃孵育30min；

（2）等温扩增体系：取步骤（1）所得混合液，加10~60nm引物1、10~60nm引物2、1~6unt.bstnbi切刻内切酶、1.6~9.6ubsmdna聚合酶、1×缓冲液以及2μl，10mmol·l^-1游离的脱氧核糖核苷三磷酸，混匀后在55℃孵育30~150min，产生大量的报告探针；

（3）准备三向dna结构：首先将均为0.5~4μmol·l^-1的，10μl的s1，10μl的s2和10μl的s3混合，在95℃下加热5min，然后逐渐冷却至室温。此后，取混合后的30μldna混合物在25℃温育60min以构建三向dna结构；

（4）形成g-四链体/血红素：将步骤（2）所得混合液与步骤（3）所得混合溶液混匀，在37℃孵育120min。加入1~6uλ核酸外切酶，1×λ核酸外切酶反应缓冲液，混匀后在37℃酶促反应30~150min产生大量单链s1；然后加入400μl工作缓冲液和10μl氯化血红素，并将混合物在25℃温育60min以形成g-四链体/血红素复合物；

（5）吸光度检测和标准曲线绘制：在步骤（4）反应溶液中加入20μl50mmol·l^-1abts和10μl体积浓度为0.3%的h2o2并在37℃下孵育10min，使用uv-vis分光光度计读取空白以及含有妥布霉素的溶液在420nm的吸光值；

根据测定吸光值与加入妥布霉素的浓度之间的关系，绘制出相应的线性关系曲线；

（6）实际样品检测：将含有妥布霉素的水样以步骤（1）~（5）所述操作，测定出相应的吸光值，从标准曲线中计算出相应的妥布霉素浓度。

进一步地，步骤（2）中的缓冲液具体为含有100mmol·l^-1nacl，50mmol·l^-1tris-hcl，10mmol·l^-1mgcl2，0.1mg·ml^-1bsa的混合溶液。

进一步地，步骤（4）所述λ核酸外切酶反应缓冲液具体为含有67mmol·l^-1glycine-koh，2.5mmol·l^-1mgcl2，50mg·ml^-1bsa的混合溶液；

工作缓冲液具体为50mmol·l^-1tris-hcl，150mmol·l^-1nh4cl，20mmol·l^-1kcl，体积浓度为0.03%triton-x-100，ph7.5；

氯化血红素储备溶液溶解于二甲基亚砜，用上述工作缓冲液稀释氯化血红素储备溶液至20μmol·l^-1。

进一步地，步骤（5）中abts储备溶液溶解于二甲基亚砜。

进一步地，步骤（6）中妥布霉素的浓度具体为20~800nmol·l^-1。

本发明的有益效果：本发明通过适配体捕获妥布霉素触发nt.bstnbi切刻内切酶和bsmdna聚合酶介导的双重链置换反应产生大量的报告探针，同时，报告探针触发λ核酸外切酶辅助的环路扩增，实现了比色信号的多重放大。通过比色信号的多重放大，使该方法检测范围扩大，提高检测灵敏度。该方法相比于检测妥布霉素的传统方法，特异性强，灵敏度高，操作简单。

附图说明

图1基于双重链置换和三向dna结构检测妥布霉素的比色方法的原理图。

图2妥布霉素比色检测标准曲线。

具体实施方式

实施例1妥布霉素浓度标准曲线的绘制

将t1和t2以相同的浓度混匀，在95℃高温变性5min后再于37℃复性120min。将2μl（10μmol·l^-1）双链与4μl不同浓度的妥布霉素溶液混匀，在37℃孵育30min。向上述混合液中加2μl（10μmol·l^-1）引物1、2μl（10μmol·l^-1）引物2、5unt.bstnbi切刻内切酶、8ubsmdna聚合酶以及2μl（10mmol·l^-1）游离的脱氧核糖核苷三磷酸，1×缓冲液（100mmol·l^-1nacl，50mmol·l^-1tris-hcl，10mmol·l^-1mgcl2，0.1mg·ml^-1bsa），混匀后在55℃孵育120min，产生大量的报告探针，在75℃灭活10min后，4℃储存备用。

将10μl的s1,10μl的s2和10μl的s3（均为10^-6mol·l^-1）混合，在95℃下加热5min，然后逐渐冷却至室温。此后，取30μldna混合物在25℃温育60min以构建三向dna结构。将含有报告探针的混合液与三向dna结构混合溶液混匀，在37℃孵育120min。然后加入5uλ核酸外切酶，1×λ核酸外切酶反应缓冲液（67mmol·l^-1glycine-koh，2.5mmol·l^-1mgcl2，50mg·ml^-1bsa），混匀后在37℃酶促反应120min产生大量单链s1。之后加入400μl工作缓冲液和10μl氯化血红素（氯化血红素储备溶液溶解于二甲基亚砜，用工作缓冲液稀释氯化血红素储备溶液（20μmol·l^-1）），并将混合物在25℃温育60min以形成g-四链体/血红素复合物。最后将20μl50mmol·l^-1abts（abts储备溶液溶解于二甲基亚砜）和10μl0.3％(v/v)h2o2加入到g-四链体/血红素溶液中并在37℃下孵育10min，使用uv-vis分光光度计读取空白以及含有妥布霉素溶液在420nm的吸光值。根据测定吸光值与加入妥布霉素的浓度之间的关系，绘制出相应的线性关系曲线。

如图2所示，吸光值随着妥布霉素浓度的增加而增加，其线性回归方程是y=0.0002x+0.29042，r²=0.9961，其中y表示吸光值，x表示妥布霉素浓度（nmol·l^-1），该方法的检测限为12.24nmol·l^-1。

实施例2实际水样中妥布霉素含量的测定

为了进一步验证该方法在测定实际样品中妥布霉素含量时的准确性，选用了无预处理的太湖水将妥布霉素稀释成不同的浓度。采用与妥布霉素标准样品完全相同的方法进行反应，所得反应溶液使用uv-vis分光光度计读取溶液在420nm的吸光值，代入标准曲线可计算出妥布霉素浓度。

具体样品和检测结果如表1所示。

表1

序列表

<110>江南大学

<120>基于双重链置换和三向dna结构检测妥布霉素的比色方法

<141>2019-09-20

<160>7

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>36

<212>dna

<213>序列t1(2ambystomalateralexambystomajeffersonianum)

<400>1

ctgccgtgactaggcactagtctcaacgagtcgcgt36

<210>2

<211>57

<212>dna

<213>序列t2(2ambystomalateralexambystomajeffersonianum)

<400>2

ttttttttttttagtcatgcttgatgactcgttgacttatcccaattgtcacggcag57

<210>3

<211>6

<212>dna

<213>引物1(2ambystomalateralexambystomajeffersonianum)

<400>3

ctgccg6

<210>4

<211>31

<212>dna

<213>引物2(2ambystomalateralexambystomajeffersonianum)

<400>4

ttttttttttttagtcatgctacgcgactcg31

<210>5

<211>59

<212>dna

<213>单链dnas1(2ambystomalateralexambystomajeffersonianum)

<400>5

ttttttttttttagtcatgcttctcggtgtgacaggcaactccgggttgggcgggatgg59

<210>6

<211>35

<212>dna

<213>单链dnas2(2ambystomalateralexambystomajeffersonianum)

<400>6

ttaattataataaccagttgcctggatgatcgaga35

<210>7

<211>53

<212>dna

<213>单链dnas3(2ambystomalateralexambystomajeffersonianum)

<400>7

ttttttttttttagtcatgctcccatcccgcccaacccccttattataattaa53