细胞色素酶CYP26A1在制备治疗神经病理性疼痛的药物中的应用的制作方法

本发明属于医药技术领域，具体涉及细胞色素酶cyp26a1作为靶点在制备治疗神经病理性疼痛的药物中的应用。

背景技术：

疼痛作为躯体感觉的一种，可以在机体受到伤害时起到警示作用，引起机体一系列防御性保护反应避免受到进一步伤害。但当疼痛失去了正常保护功能，数月或数年的持续存在，就变成了危害身心健康的病理性疼痛(慢性疼痛)。据世界卫生组织报告，慢性疼痛是最常见也是疾病负担最重的疾患。有资料统计，大约30％的成年人患有慢性疼痛。神经病理性疼痛(neuropathicpain)是慢性疼痛中的一类，临床上常见的炎症、手术、神经创伤、病毒感染(如带状疱疹)、癌症、代谢性疾病(如糖尿病)、免疫性疾病(如多发性硬化、艾滋病)等都可以引起神经病理性疼痛。患者会产生对伤害性刺激敏感性增强和反应阈值降低的痛觉过敏，以及非痛刺激(如触摸)引起的触诱发痛表现，严重影响患者的身心健康和生活质量。

神经病理性疼痛是临床镇痛的难点，现有的镇痛药物多是阿片类镇痛药、非阿片类辅助镇痛药(非甾体类抗炎药、抗抑郁药、抗惊厥药)。阿片类镇痛药如吗啡、美沙酮、芬太尼、羟考酮等，常伴随有呼吸抑制和循环抑制副作用，常见为便秘、头晕、恶心、呕吐，瘙痒、口干等症状。非甾体类抗炎药常用环氧化酶-2抑制剂塞来昔布，其伴随有消化道副作用，包括腹痛、消化不良和恶心等症状。抗惊厥药、抗精神病药物为主的辅助性镇痛药，如卡马西平、可乐定、氯胺酮等，都有不同种类的不良反应，如疲乏、头疼、血小板减少、皮肤瘙痒、充血性皮疹、失眠、便秘等症状。因此进一步研究神经病理性疼痛的发生发展机制，从新的角度寻找有效的药物作用靶点具有重要的学术价值和现实意义。

cyp26a1属于细胞色素p450(cytochromep450，cyp450)超家族，cyp26家族，cyp26a亚家族成员，是特异性代谢维甲酸的氧化酶。在cyp450超家族众多成员中，cyp1、cyp2、cyp3家族在疼痛领域研究较多，它们参与多种麻醉镇痛药物的代谢，会引起药物动力学改变，导致药物效能改变，这对临床指导用药有重要意义。但cyp450超家族成员直接参与调节神经病理性疼痛的发生发展鲜有报道。有研究报道细胞色素cyp26a1也是肿瘤治疗的重要靶点，而不论是肿瘤本身还是利用化疗药治疗肿瘤时都可导致痛觉过敏，产生神经病理性疼痛，在治疗癌症引起的神经病理性疼痛中，以cyp26a1作为药物靶点可能还会有一箭双雕的效果。

技术实现要素：

针对上述现有技术，本发明的目的是提供细胞色素酶cyp26a1作为靶点在筛选神经病理性疼痛治疗药物、制备神经病理性疼痛治疗药物或制备神经病理性疼痛诊断药物中的应用。

为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：

细胞色素酶cyp26a1在筛选神经病理性疼痛治疗药物、制备神经病理性疼痛治疗药物或制备神经病理性疼痛诊断药物中的应用。

进一步地，所述药物抑制cyp26a1的表达或功能，可以为核酸分子、碳水化合物、脂类、小分子化学药、抗体药、多肽、蛋白、干扰慢病毒或干扰腺相关病毒。

通过小鼠snl模型诱导神经病理性疼痛，提取脊髓腰5节段的mrna进行基因芯片检测，申请人发现cyp26a1mrna水平在神经病理性疼痛模型维持阶段升高近22倍，提示cyp26a1可能在神经病理性疼痛维持阶段发挥作用。通过实时荧光定量pcr和westernblot实验进一步证实cyp26a1mrna水平和蛋白水平在神经病理性疼痛模型维持阶段显著升高，抑制cyp26a1表达或抑制其功能都能够有效缓解神经病理性疼痛，说明cyp26a1参与神经病理性疼痛的维持发展。上述结果都说明可以细胞色素酶cyp26a1作为研发治疗神经病理性疼痛药物的潜在靶点。

基于上述技术思路，本发明还提供了多种cyp26a1mrna的抑制剂，包括：

一种抑制cyp26a1mrna的核酸分子，所述核酸分子为sirna或shrna；所述sirna或shrna包含与如seqidno：1所示的核苷酸序列相同的rna序列。

进一步地，所述sirna包括正义链和反义链，所述正义链和反义链的核苷酸序列如seqidno：2和seqidno：3所示。

进一步地，所述sirna可采用甲氧基或胆固醇进行修饰。

一种抑制cyp26a1mrna的重组载体，包含能转录出上述核酸分子的序列以及载体，所述序列嵌入载体中。

进一步地，所述载体为慢病毒载体或腺相关病毒载体。

一种抑制cyp26a1mrna的慢病毒，由上述重组载体经病毒包装后获得。

一种抑制cyp26a1mrna的腺相关病毒，由上述重组载体经病毒包装后获得。

上述核酸分子、重组载体、慢病毒或腺相关病毒在制备预防或治疗神经病理性疼痛的药物中的应用。

cyp26a1功能抑制剂在制备预防或治疗神经病理性疼痛的药物中的应用。

进一步地，所述cyp26a1功能抑制剂为他拉罗唑。

有益效果：本发明通过利用小鼠脊髓腰5(l5)脊神经结扎(spinalnerveligation,snl)方法诱导神经病理性疼痛，发现cyp450家族成员cyp26a1在神经病理性疼痛的维持阶段表达增加，促进神经病理性疼痛维持发展，抑制cyp26a1表达或抑制其功能都能够有效缓解神经病理性疼痛，可将细胞色素酶cyp26a1作为靶点，以抑制其表达和功能的抑制剂作为神经病理性疼痛的有效治疗药物。

附图说明

图1为实施例1中l5脊神经结扎(snl)诱发小鼠同侧后爪产生机械性触诱发痛。

图2为实施例1中snl诱导脊髓cyp26a1mrna水平升高。a为mrna芯片检测snl模型组和假手术组脊髓差异表达mrna聚类分析。b为mrna芯片分析细胞色素p450家族差异表达mrna相对升高倍数。c为实时荧光定量pcr验证snl模型中cyp26a1mrna表达水平。

图3为实施例1中snl诱导脊髓cyp26a1蛋白表达升高。a、b为cyp26a1蛋白westernblot检测结果。c-k为免疫荧光双标染色定位脊髓cyp26a1蛋白表达的细胞类型。

图4为实施例2中sirna抑制cyp26a1表达能够缓解snl诱导的机械性触诱发痛。a为筛选出针对小鼠cyp26a1mrna具有高效干扰效果的sirna(sirna-003)。b为脊髓鞘内注射经甲氧基和胆固醇修饰的sirna(sirna-003-2ome+5chol)不同剂量，机械性触诱发痛检测结果。c为实时荧光定量pcr检测脊髓鞘内注射sirna-003-2ome+5chol的基因干扰效果。

图5为实施例3中cyp26a1抑制剂talarozole能够缓解snl诱导的机械性触诱发痛。a为snl第7天脊髓鞘内注射talarozole不同剂量，机械性触诱发痛检测结果。b为snl第3天脊髓鞘内注射高剂量talarozole，机械性触诱发痛检测结果。c为实时荧光定量pcr检测cyp26b1mrna在snl模型中的表达变化。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步说明。

由于实验性神经损伤，如脊神经结扎、慢性压迫坐骨神经或神经根，产生热痛觉过敏和触诱发痛，与临床上的一些神经病理性疼痛相似，所以本发明利用小鼠脊髓腰5(l5)脊神经结扎(spinalnerveligation,snl)方法诱导神经病理性疼痛，在手术后10天提取手术组和假手术组小鼠脊髓腰5节段的mrna进行基因芯片检测，筛选神经病理性疼痛相关基因，为研发治疗神经病理性疼痛药物寻找潜在靶点。聚类分析发现细胞色素p450家族成员26a1(cytochromep45026a1,cyp26a1)的mrna在神经病理性疼痛模型组升高近22倍。进一步用实时荧光定量pcr验证了snl后7-14天cyp26a1表达都有显著性升高，同时也显示在snl后3天表达无变化。结果提示cyp450家族成员cyp26a1在神经病理性疼痛的维持阶段发挥功能。

基于上述研究，本发明针对cyp26a1基因转录本设计了sirna，并对其进行甲氧基修饰和胆固醇修饰，用以证明抑制cyp26a1表达能够缓解snl诱导的机械性触诱发痛。另外，通过已知的cyp26a1抑制剂证明抑制cyp26a1的功能能够缓解snl诱导的机械性触诱发痛。在下述实施例中选用了cyp26a1抑制剂他拉罗唑进行验证试验，但作为cyp26a1抑制剂不仅限于他拉罗唑，还包括其他抑制剂。

实施例1

cyp26a1在snl诱导的神经病理性疼痛维持阶段表达增加

1、实验方法

(1)小鼠脊神经结扎(spinalnerveligation,snl)神经病理性疼痛模型建立

spf级8周雄性icr小鼠腹腔注射复合麻药后，用剃毛器将腰背部毛发剃除，碘酒酒精消毒后，在后正中线左外侧约5mm处做一纵切口，长约1cm，2/3的切口在髂嵴之上。然后切开胸腰筋膜，钝性分离竖脊肌并向外牵拉，在手术显微镜下显露第6腰椎的横突并咬断，用玻璃分针轻柔地分离出l5脊神经，用6-0号的丝线紧紧结扎l5脊神经，然后逐层缝合切口。假手术组手术过程同上，但不结扎脊神经。

(2)机械性触诱发痛检测方法

行为检测前，小鼠单独放在机械性痛觉测试架上的有机玻璃盒子内适应环境至安静，室温在23±1℃，连续适应3天。按照dixon等报道的“upanddown”方法，使用vonfreyfilament检测小鼠左后爪底机械性触诱发痛感受阈值。测量时从0.16g的vonfreyfilament开始，刺激小鼠左后爪底，以filament稍弯曲作为完全受力的标准，持续刺激2秒，小鼠如出现缩爪、甩爪、舔爪等现象记为疼痛，再使用小一级克数的filament刺激，如不痛则使用高一级克数的filament刺激，刺激间隔为3分钟，记录6个刺激结果，最后对照阈值表查出缩爪阈值(pawwithdrawalthreshold)，单位为“g”。缩爪阈值越低说明机械性触诱发痛越严重。

(3)rna提取及实时荧光定量pcr

按照trizol法抽提总rna，测定浓度后取1μg总rna，参考vazyme公司hiscriptⅱ1ststrandcdnasynthesiskit的说明进行逆转录反应。得到的cdna产物稀释8倍用于实时荧光定量pcr的模板，每个pcr体系加入2μl模板，参考vazyme公司aceqqpcrsybrgreenmastermix的说明进行，所用引物序列为：

cyp26a1forward,5′-tgcaagagcaatcaagacaaca-3′(seqidno：4)；

cyp26a1reverse,5′-cttcagagcaacccgaaacc-3′(seqidno：5)；

cyp26b1forward,5′-ctctgcccctttgctcttg-3′(seqidno：6)；

cyp26b1reverse,5′-tctttccaccttacctctctgctt-3′(seqidno：7)；

gapdhforward,5′-aaatggtgaaggtcggtgtgaac-3′(seqidno：8)；

gapdhreverse,5′-caacaatctccactttgccactg-3′(seqidno：9)。

结果分析采用2^-δδct法分析。

(4)蛋白质提取及westernblot

小鼠用生理盐水经心脏灌注后，取脊髓腰5(l5)节段放入含有蛋白酶抑制剂的组织裂解液中，冰上电动匀浆，经离心后取上清，即得组织蛋白质溶液。bca蛋白含量检测试剂盒测定样本总蛋白质浓度，加入蛋白上样缓冲液，标定蛋白统一浓度。经沸水煮5分钟后蛋白质变性，经sds—聚丙烯酰胺凝胶电泳和湿法转膜后，将膜置入5％脱脂奶粉封闭液中室温封闭2h。封闭结束孵育5％脱脂奶粉稀释的一抗，4℃过夜，经洗膜后孵育二抗，洗膜后使用li-corodysseyclx成像系统成像。图像蛋白条带分析使用imagej软件。

(5)免疫荧光染色

snl模型组小鼠经4％多聚甲醛灌注固定，取脊髓腰5(l5)节段，依次在含20％和30％蔗糖溶液中脱水，沉底后行冰冻切片，片厚30μm。0.01mpbs溶液漂洗脊髓切片3次，10min/次，1％bsa(含0.5％tritonx-100)室温孵育封闭2小时，孵育一抗：cyp26a1(rabbit,1:200,bioss)、神经元标记物neun(mouse,1:800,millipore)、星形胶质细胞标记物gfap(mouse,1:6000,millipore)、小胶质细胞标记物iba-1(goat,1:500,abcam)，4℃孵育过夜。0.01mpbs溶液漂洗切片3次，10min/次，孵育二抗：cy3-羊抗兔(1:1000,jackson)、fitc-羊抗小鼠(1:1000,jackson)、cy3-驴抗兔(1:1000,jackson)、alexafluor488-驴抗山羊(1:1000,jackson)，室温孵育2小时。0.01mpbs溶液漂洗切片3次，10min/次。裱片后荧光封片剂封片，荧光显微镜下观察拍照。

2、实验结果：

(1)snl诱发小鼠同侧后爪产生机械性触诱发痛

如附图1所示，对于vonfreyfilament刺激产生的机械性触诱发痛阈值(pwt)，snl模型组(snlmodel)与假手术组(sham)相比，从术后1天开始显著降低，持续至术后21天仍明显降低，双因素方差分析均具有统计学差异(p<0.001)。说明snl诱发小鼠产生了机械性触诱发痛，snl神经病理性疼痛模型建立成功。

(2)snl诱导脊髓cyp26a1mrna和蛋白表达增加

利用l5脊神经结扎(snl)方法诱导小鼠神经病理性疼痛，在手术后10天提取snl组和假手术组小鼠脊髓腰5(l5)节段的mrna进行基因芯片检测，结果显示，cyp450超家族中的cyp26a1mrna表达升高最多。如图2中a，用hierarchical算法对芯片检测到的所有基因表达信号值进行聚类分析。列表示某一样本中所有基因的表达情况，行表示某一基因在四个样本中的表达情况，红色表示基因表达量高，绿色表示基因表达量低，手术组(snl-1和snl-2)和假手术组(sham-1和sham-2)的组内基因表达量大致相同，但组间基因表达量差异明显，符合此特征的cyp450超家族成员有cyp26a1、cyp4b1、cyp1b1。如图2中b，snl组与假手术组相比，cyp450超家族中cyp26a1mrna表达量相对升高近22倍，升高倍数最多。为验证芯片检测结果，进一步用实时荧光定量pcr检测snl模型中脊髓cyp26a1mrna水平的时程变化。结果显示如图2中c，与假手术组相比，cyp26a1mrna在snl1天、snl3天(疼痛早期阶段)无变化，在snl7天(疼痛维持阶段)显著增加，并且持续升高到模型后14天，假手术组第7天与正常组相比，cyp26a1mrna水平无明显差异(*p<0.05，***p<0.001与组相比，n＝4-6，单因素方差分析和bonferroni校正检验)。这一结果说明，脊神经结扎诱导小鼠脊髓cyp26a1mrna水平在神经病理性疼痛模型维持阶段显著升高，提示cyp26a1可能在神经病理性疼痛维持阶段起作用。cyp216a1mrna翻译成蛋白质才能发挥生理功能，所以根据mrna水平变化显示的结果，利用westernblot检测正常组、假手术组第7天以及snl后第7天脊髓cyp26a1蛋白表达变化，结果显示如图3中a和b，与正常组和假手术组相比，snl诱导脊髓cyp26a1蛋白在术后第7天显著升高，正常组和假手术组无差异(***p<0.001与组相比，*p<0.05与假手术组相比，n＝3，单因素方差分析和bonferroni校正检验)。在蛋白水平上，进一步通过免疫荧光双标实验，明确了cyp26a1在脊髓的神经元和星形胶质细胞中表达。如图3中c-k，免疫荧光双标显示，cyp26a1与神经元标记物neun(c-e)以及星形细胞标记物gfap共存(f-h)，而不与小胶质细胞标记物iba1共存(i-k)。脊神经结扎诱导小鼠脊髓cyp26a1蛋白水平在神经病理性疼痛模型维持阶段显著升高，说明cyp26a1参与神经病理性疼痛的维持发展。

实施例2

抑制cyp26a1的表达能够缓解snl诱导的机械性触诱发痛

1、实验方法：

(1)原代星形胶质细胞培养

取新生1-2天小鼠大脑皮层于装有预冷d-hanks液的小培养皿中，在解剖显微镜下剥除脑膜，收集剥膜后大脑皮层，用剪刀剪碎组织，用移液器吹散组织至无碎块，100μm孔径网筛过滤。4℃离心，3000g，5min。弃上清，加入完全培养基重悬细胞，10μm孔径滤器过滤。以2×10⁶(个/孔)细胞数接种于6孔板中，次日换液，之后每3-4天换液一次，细胞生长汇合度达到95％时，加d-camp(终浓度150μm)诱导星形胶质细胞分化成熟，诱导3天后进行药物干预实验。

(2)设计合成小鼠cyp26a1sirna

sirna设计合成由广州市锐博生物科技有限公司(地址：广州开发区科学城科学大道182号创新大厦c3栋13-14层，邮编：510663)完成：通过美国国立生物技术信息中心(ncbi)数据库中获取小鼠cyp26a1mrna的序列全长(nm_007811.2)，跟据rnai原理，结合设计软件，设计针对小鼠cyp26a1基因转录本的3个候选sirna，经blast比对检查以保证和其他基因没有同源性，再进行化学合成。

3个候选sirna的靶序列信息如下：

(3)cyp26a1sirna干预实验

原代星形胶质细胞用d-camp诱导培养3天后，更换opti-mem培养基，分别预先转染不同sirna(1ug)24小时，再用脂多糖lps(0.1ug/ml)刺激细胞6小时，收集细胞，提取rna，用于实时荧光定量pcr检测。细胞实验分为5组：sirna-nc(对照sirna)组，sirna-nc+lps组，sirna-001+lps组，sirna-002+lps组，sirna-003+lps组。此实验从3个候选sirna中筛选出高效针对小鼠cyp26a1基因的sirna后，再由广州市锐博生物科技有限公司对此sirna进行甲氧基修饰，以提高在活体内的稳定性，同时进行胆固醇修饰，这样不需借助载体复合物可直接进入细胞发挥干扰基因表达作用，用于在体鞘内注射后行为学检测。

(4)脊髓鞘内注射药物

电推剪剃除小鼠腰背部毛后，经异氟烷吸入麻醉，酒精消毒皮肤，使用29gauge(bd公司)注射针在第四、五腰椎棘突间注射10μl药物到小鼠蛛网膜下隙，以尾巴出现颤动或突然侧向甩动为穿刺成功标志。吸入麻醉停止后，小鼠可以很快清醒，对随后的疼痛行为学检测及其它研究无影响，保证了实验结果的可靠性。

2、实验结果：

(1)筛选出高效针对小鼠cyp26a1基因的sirna

如图3中f-h实验结果显示，脊髓星形胶质细胞表达cyp26a1，在获得公司合成的3个候选sirna后，利用体外培养的原代星形胶质细胞进行实验，筛选出最有效的干扰cyp26a1表达的sirna。近年来慢性疼痛研究中一个新的概念认为，神经炎症反应是启动和维持慢性疼痛的重要原因，所以在体外实验中使用能引起炎症反应的脂多糖(lps)刺激星形胶质细胞，实时荧光定量pcr检测cyp26a1mrna水平变化。如图4中a结果显示lps诱导星形胶质细胞中的cyp26a1mrna水平升高近26倍。3个候选sirna中sirna-001和sirna-003有显著干扰效果，抑制了lps诱导的cyp26a1mrna升高，敲减率分别达到近76.9％和92.3％，sirna-002无干扰效果(***p<0.001与sirna-nc组相比，^###p<0.001与sirna-nc+lps组相比，n＝4，单因素方差分析和bonferroni校正检验)。因此筛选出sirna-003干扰靶基因效果最好，选用此sirna进行甲氧基修饰和胆固醇修饰，使sirna在体内更稳定且不用借助于转染试剂直接在体注射发挥干扰作用，用于行为学实验。

sirna-003序列信息为：

正义链5’-gcaagagcaaucaagacaa-3’(seqidno：2)

反义链5’-uugucuugauugcucuugc-3’(seqidno：3)

(2)sirna抑制cyp26a1表达能够缓解snl诱导的机械性触诱发痛

在snl第7天鞘内注射针对cyp26a1基因的经甲氧基修饰和胆固醇修饰的sirna，特异性抑制cyp26a1表达，行为学检测小鼠机械性触诱发痛阈值变化。如图4中b结果显示，snl7d鞘内注射sirna-003-2ome+5chol低剂量(2ug)有抑制小鼠械性触诱发痛的趋势但无显著性差异，而高剂量(5ug)在6小时和1天有明显的减轻小鼠械性触诱发痛的作用(*p<0.05与snl+sirna-nc-2ome+5chol组相比，n＝6-8，双因素重复测量方差分析，bonferroni校正检验进行两两比较)。实时荧光定量pcr结果显示，如图4中c，鞘内注射sirna-003-2ome+5chol(5ug)后，snl模型小鼠脊髓中的cyp26a1mrna水平显著下降(**p<0.01与snl+sirna-nc-2ome+5chol组相比，n＝4-5，student’st-test)。这些结果表明抑制cyp26a1表达能够缓解snl诱导的机械性触诱发痛。

实施例3

抑制cyp26a1的功能能够缓解snl诱导的机械性触诱发痛

1、实验方法：

在脊神经结扎(snl)诱导疼痛的早期(3天)和维持(7天)阶段，鞘内注射(方法同实施例2)cyp26a1抑制剂他拉罗唑(talarozole)不同剂量：0.1ug、0.5ug、1ug，行为学检测小鼠机械性触诱发痛阈值变化。实施例中使用的他拉罗唑商购于medchemexpree公司(nj08852,usa)。他拉罗唑(talarozole)是一种口服性全反式维甲酸代谢阻断剂，有效的选择性抑制cyp26a1和cyp26b1，提高内源性全反式维甲酸(ra)的细胞内水平，用于治疗银屑病和痤疮。

2、实验结果：cyp26a1抑制剂talarozole能够缓解snl诱导的机械性触诱发痛

在snl第3天和第7天鞘内注射talarozole抑制cyp26a1功能，行为学检测小鼠机械性触诱发痛阈值变化。如图5中a结果显示，在snl第7天鞘内注射不同剂量talarozole有不同程度的缓解小鼠机械性触诱发痛的效果，其中talarozole0.5ug在鞘内注射3小时与对照组比有显著的缓解作用，talarozole1ug在1小时就出现明显的缓解作用，持续到6小时，talarozole缓解了小鼠机械性触诱发痛呈剂量依赖性(***p<0.001，^###p<0.001与vehicle组相比，n＝8-10，双因素重复测量方差分析，bonferroni校正检验进行两两比较)。而如图5中b所示，在snl第3天鞘内注射talarozole未显示镇痛作用，进一步说明了cyp26a1在神经病理性疼痛维持阶段发挥作用，而非早期。由于cyp26a1抑制剂talarozole同时对cyp26b1也有抑制效果，但实时荧光定量pcr检测如图5中c所示，cyp26b1mrna在snl诱导的神经病理性疼痛模型中表达并无变化(n＝5–6，单因素方差分析和bonferroni校正检验)，所以鞘内注射talarozole的镇痛效果是通过其抑制cyp26a1的作用。

序列表

<110>南通大学

<120>细胞色素酶cyp26a1在制备治疗神经病理性疼痛的药物中的应用

<130>20190917

<160>11

<170>siposequencelisting1.0

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