一种真姬菇原生质体单核体的制备方法与流程

本发明涉及真菌遗传与育种技术，具体而言，涉及一种真姬菇原生质体单核体的制备方法。

背景技术：

真姬菇(hypsizigusmarmorens)又名玉蕈、斑玉蕈等，是一种珍稀食用菌，其子实体提取物具有清除体内自由基、降血压、提高免疫力和延缓衰老等功效。2016年全国真姬菇(包含海鲜菇、蟹味菇和白玉菇)工厂化生产总量达到日产1000吨，占食用菌工厂化生产总量的10％，是我国工厂化栽培食用菌中的重要品类。在食用菌的遗传育种工作中，原生质体技术具有十分重要的意义。原生质体无细胞壁障碍，可对膜和细胞器进行基础研究，同时可进行遗传操作。此外，获得单核体是基因组测序工作的前提和基础。在获得单核体的方法中，原生质体单核化法所获得的单倍体菌株不经过重组，可以更完整地展示遗传信息，进行遗传分析。

目前，真姬菇原生质体制备过程中，存在无法获得原生质体再生菌落的问题。

鉴于此，特提出本发明。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种真姬菇原生质体单核体的制备方法。该方法可以解决无法获得原生质体再生菌落的问题。

本发明是这样实现的：

真姬菇原生质体单核体的制备方法，其包括将真姬菇木屑种接种至培养基中培养。

本发明使用真姬菇木屑种作为供种菌，将其接种至培养基中培养，可以避免真姬菇节孢子的干扰，在后续酶解后可以获得真姬菇的原生质体，经单菌落培养可以筛选获得无锁状联合的原生质体的单核体。而使用常规的真姬菇平板菌，受节孢子的干扰，节孢子的萌发时间短，原生质体的萌发时间长，节孢子抑制了原生质体的再生，从而无法获得原生质体的再生菌落。

真姬菇木屑种购自上海丰科生物科技股份有限公司。真姬菇木屑种又称为木屑栽培真姬菇，通过在木屑上栽培生产真姬菇，可以获得特殊的一种真姬菇种。

在本发明应用较佳的实施例中，上述真姬菇木屑种的木屑种类选自杨木，枫木，桦木，松木或杉木；

优选的，真姬菇木屑种的木屑种类选自杨木或枫木。

杨木和枫木木屑更适合于真姬菇菌丝的生长和栽培，且品质较好。

在本发明应用较佳的实施例中，上述培养基为液体培养基，液体培养基为ymgp培养基、pdb培养基或ymg培养基；

优选的，液体培养基为ymgp培养基。

在ymgp培养基培养条件下有利于更多原生质体的再生，可以获得更多的真姬菇原生质体单核体。

在本发明应用较佳的实施例中，上述真姬菇木屑种的接种量为1-5g/l；

优选的，真姬菇木屑种的接种量为3g/l。

在本发明提供的接种量范围内获得的真姬菇原生质体单核体数量最多，品质更好。

上述制备方法还包括：共培养结束后，富集菌丝，进行酶解分离获得真姬菇原生质体，将获得的真姬菇原生质体涂布培养，挑选单菌落培养获得真姬菇原生质体单核体。

在本发明应用较佳的实施例中，上述富集菌丝包括将共培养后的真姬菇菌丝过滤收集菌丝，将收集的菌丝用第一高渗剂处理；

优选的，第一高渗剂为蔗糖，甘露醇或硫酸镁；

更优选的，第一高渗剂为蔗糖。

蔗糖的浓度为0.5-0.7mm，甘露醇的浓度为0.5-0.7mm，硫酸镁的浓度为0.5-0.7mm。通过添加第一高渗剂可以将菌丝内的水透过细胞膜吸出，从而有利于下一步的酶解分离。

在本发明应用较佳的实施例中，上述酶解分离包括将富集得到的菌丝用酶解液酶解，过滤收集滤液，将滤液离心分离置于第二高渗剂中处理获得真姬菇原生质体；

优选的，第二高渗剂为蔗糖，甘露醇或硫酸镁；

更优选的，第二高渗剂为蔗糖。

酶解液为溶壁酶液(购于广州微生物研究所)，质量体积浓度为1-3％，酶解液可以破坏真姬菇菌丝的细胞壁，从而有利于细胞膜和细胞器膜的溶出分离。通过过滤可以截留大部分的细胞壁等不溶物，通过第二高渗剂渗透处理，可以保证真姬菇原生质体处于低水或无水水平，防止制备的原生质体在低渗透水平涨破，影响后续单核体的制备。

离心分离的转速控制在2500-3500rpm，转速过高容易导致制备的原生质体破碎，过低制备过程缓慢。采取低温3-4℃离心，温度过低会影响原生质体的活力。

在本发明应用较佳的实施例中，上述涂布培养包括将真姬菇原生质体涂布在平板培养基上进行暗培养；真姬菇原生质体的涂布数量为10³-10⁵个；

优选的，真姬菇原生质体的涂布数量为10⁴-10⁵个。

涂布数量过高，容易导致真姬菇原生质体堆积，不易后续进行单菌落的挑选。

在本发明应用较佳的实施例中，上述平板培养基为pdas培养基，pdms培养基或ymgs培养基；暗培养的温度为22-23℃；

优选的，暗培养的温度为22℃。

在22℃下暗培养，获得的真姬菇原生质体单核体数量最多。

在本发明应用较佳的实施例中，上述挑选单菌落培养获得真姬菇原生质体单核体包括：从涂布培养后的培养基上挑取单菌落至新的培养基上，进行暗培养，显微观察淘汰有锁状联合的双核体菌丝，获得真姬菇原生质体单核体；

优选的，暗培养的时间为7-8d，培养温度为22-23℃。

本发明具有以下有益效果：

本发明提供了真姬菇原生质体单核体的制备方法，该方法采用真姬菇木屑种作为供种菌，可以避免节孢子的萌发对后续原生质体的再生产生抑制效果，有利于筛选得到原生质体单核体。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为实施例1制备的原生质体镜检照片；

图2为实施例1萌发的单核体菌株镜检照片；

图3为对比例制备的原生质体镜检照片。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

本实施例提供了真姬菇原生质体单核体的制备方法，该方法具体包括如下步骤：

(1)制备液体摇瓶培养基(ymgp培养基)：酵母提取物4g，麦芽糖提取物10g，葡萄糖4g，蔗糖171g，蛋白胨2g，加水至1l，121℃灭菌15分钟备用。

(2)接种：在步骤(1)的培养基中接入真姬菇木屑种，接种量为3g。

(3)收集菌丝：真姬菇进行液体培养5d后，使用无纺布过滤收集菌丝。无菌蒸馏水冲洗3次，0.5mm蔗糖溶液冲洗1次，用无菌滤纸吸干水分，备用。

(4)酶解：在1g步骤(2)的菌丝中加入5ml的1.5％溶壁酶液(0.075g溶壁酶溶于5ml蔗糖，0.22μm的细菌过滤器过滤灭菌)，使得菌丝体与酶液充分混匀。在31℃，80rpm摇床上酶解4小时。

(5)取下酶解后的菌液，用4-8层滤纸过滤，收集滤液。在3000rpm，4℃下离心10min，弃上清。再加入0.5mm蔗糖溶液至8-9ml，在3000rpm，4℃下离心10min，弃上清。加入1ml0.5mm蔗糖溶液，混匀。通过多次过滤离心，可以将酶解后的细胞壁等杂质去除，有利于富集纯化原生质体。

(6)镜检：用血球计数器计算原生质体的数量。

(7)涂布：取10⁴左右的原生质体溶液100μl涂布于预先配制的pdas平板培养基(土豆200g，葡萄糖20g，蔗糖171g，琼脂粉15g，加水定容至1l，121℃灭菌15分钟)上。在22℃，黑暗培养。

(8)经过10天左右的培养，可见平板上出现零星单菌落。挑取单菌落于新的pda(pda粉末(美国bd公司)39g，加水至1l，121℃灭菌15分钟备用)平板上，在22℃，黑暗培养7d。

(9)显微观察：将步骤(8)中长有菌丝的平板置于倒置显微镜下观察，淘汰有锁状联合的双核体菌丝。

实施例2

本实施例提供了真姬菇原生质体单核体的制备方法，该方法具体包括如下步骤：

(1)制备液体摇瓶培养基(ymgp培养基)：酵母提取物4g，麦芽糖提取物10g，葡萄糖4g，蔗糖171g，蛋白胨2g，加水至1l，121℃灭菌15分钟备用。

(2)接种：在步骤(1)的培养基中接入真姬菇木屑种，接种量为3g。

(3)收集菌丝：真姬菇进行液体培养5d后，使用无纺布过滤收集菌丝。无菌蒸馏水冲洗3次，0.5mm蔗糖溶液冲洗1次，用无菌滤纸吸干水分，备用。

(4)酶解：在1g步骤(2)的菌丝中加入5ml的1.5％溶壁酶液(0.075g溶壁酶溶于5ml蔗糖，0.22μm的细菌过滤器过滤灭菌)，使得菌丝体与酶液充分混匀。在31℃，80rpm摇床上酶解4小时。

(5)取下酶解后的菌液，用4-8层滤纸过滤，收集滤液。在3000rpm，4℃下离心10min，弃上清。再加入0.5mm蔗糖溶液至8-9ml，在3000rpm，4℃下离心10min，弃上清。加入1ml0.5mm蔗糖溶液，混匀。通过多次过滤离心，可以将酶解后的细胞壁等杂质去除，有利于富集纯化原生质体。

(6)镜检：用血球计数器计算原生质体的数量。

(7)涂布：取10⁴左右的原生质体溶液100μl涂布于预先配制的pdas平板培养基(土豆200g，葡萄糖20g，蔗糖171g，琼脂粉15g，加水定容至1l，121℃灭菌15分钟)上。在23℃，黑暗培养。

(8)经过8天左右的培养，可见平板上出现零星单菌落。挑取单菌落于新的pdms平板上，在23℃，黑暗培养5d。

(9)显微观察：将步骤(8)中长有菌丝的平板置于倒置显微镜下观察，淘汰有锁状联合的双核体菌丝。

实验例1

实施例1制备得到的原生质体进行镜检，结果参照图1所示，由图1可知，实施例1提供的制备方法制得的原生质体数量多，基本无长粒状的节孢子。

对黑暗处理萌发后的单菌落进行镜检，结果参照图2所示，由图2可知，实施例1提供的制备方法制得的原生质体经过萌发形成的单菌落无锁状联合，且萌发效果好。

对比例

本对比例真姬菇原生质体单核体的制备方法具体包括如下步骤：

(1)制备液体摇瓶培养基(pdb培养基)：pdb粉末2.4g(美国bd公司)，加水至100ml，121℃灭菌15分钟备用；

(2)接种：在pdb培养基中接入真姬菇平板菌丝块，接种量为10块(0.6cm菌种块)；

(3)收集菌丝：将真姬菇进行液体培养5d后，用无纺布过滤收集菌丝。无菌蒸馏水冲洗3次，0.5mm蔗糖溶液冲洗1次，用无菌滤纸吸干水分，备用；

(4)酶解：取1g菌丝中加入5ml的1.5％溶壁酶液(0.075g溶壁酶溶于5ml蔗糖，0.22μm的细菌过滤器过滤灭菌)，将菌丝体与酶液充分混匀。在31℃，80rpm条件下使用摇床酶解4小时。

(5)取下酶解液，用4-8层滤纸过滤，收集滤液。3000rpm，4℃，离心10min，弃上清。加入0.5mm蔗糖溶液至8-9ml，3000rpm，4℃，离心10min，弃上清。加入1ml0.5mm蔗糖溶液，混匀。

(6)镜检：用血球计数器计算原生质体数量。

(7)涂布：取10⁴左右的原生质体溶液100μl涂布于预先配制的pdas平板培养基(土豆200g，葡萄糖20g，蔗糖171g，琼脂粉15g，加水定容至1l，121℃灭菌15分钟)上。在22℃，黑暗培养。

(8)经过10天左右的培养，可见平板上出现零星单菌落。挑取单菌落于新的pda(pda粉末(美国bd公司)39g，加水至1l，121℃灭菌15分钟备用)平板上，在22℃，黑暗培养7d。

(9)显微观察：将步骤(8)中长有菌丝的平板置于倒置显微镜下观察，淘汰有锁状联合的双核体菌丝。

镜检结构参照图3所示，由图3可知，对比例提供的制备原生质体的方法得到的圆形原生质体数量少，且大多数是长粒状的节孢子，节孢子在3天后大量萌发，抑制了原生质体的萌发。因此，采用实施例1的方法，采用真姬菇木屑种作为供种菌，可以避免真姬菇节孢子的干扰获得真姬菇的原生质体再生菌落，从而筛选得到原生质体单核体。

通过上述实施例和对比例，可以看出，本发明提供的真姬菇原生质体单核体的制备方法，该方法可操作性强、可重复性高、稳定可靠，采用该方法可以避免真姬菇节孢子的干扰获得真姬菇的原生质体再生菌落，从而筛选得到原生字体单核体。该方法为真姬菇生理、遗传和形态学研究提供严谨可靠方法，具有较好的科研应用前景。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。