一种DNA编码化合物库的液相色谱纯化方法与流程

本发明涉及一种dna编码化合物库的液相色谱纯化方法。
背景技术：
：在新药研发领域，针对生物靶标的高通量筛选是快速获得先导化合物的主要手段之一。然而，基于单个分子的传统高通量筛选所需时间长、设备投入巨大、库化合物数量有限(数百万)，且化合物库的建成需要数十年的积累，限制了先导化合物的发现效率与可能性。近年来出现的dna编码化合物库技术(wo2005058479、wo2018166532、cn103882532)，结合了组合化学和分子生物学技术，在分子水平上将每个化合物加上一个dna标签，能在极短的时间内合成高达亿级的化合物库。而且化合物能够通过基因测序的方法进行识别，大幅度地增加了化合物库的大小和合成效率，成为下一代化合物库筛选技术的趋势，并开始在制药行业广泛应用，产生了诸多积极的效果(accountsofchemicalresearch,2014,47,1247-1255)。dna编码化合物库(del)的构建利用组合化学的“组合-拆分”策略，可快速得到数量巨大的化合物库，并且化合物中的每一维结构信息都可以由唯一的dna片段进行标记。在dna编码化合物库的构建过程中，每一维度都需要加入过量的dna片段进行反应以保证化合物被正确标记。然而过量的dna片段会继续与下一维度的dna片段发生反应，导致后续的磁珠纯化不完全，从而影响最终dna编码化合物库的纯度。另外由于dna编码化合物库的成本大部分来自于dna片段，过量的dna片段会增加下一维度dna片段的使用量，从而导致构建成本的大幅增加。中国专利201610229301.0公开了一种固相合成dna编码化合物库的方法，该专利对固相合成dna编码化合物生产过程中的粗产物用蒸馏水和0.1mteaa(醋酸三乙胺)缓冲溶液洗涤，进行纯化。但是，该纯化方法仅用于固相合成的纯化，并且不能除去未反应的dna片段。目前液相合成dna编码化合物库常用的纯化方法(如teaa体系)并不能很好地除去未反应的dna片段，因此，开发一种新的能够有效除去过量dna片段的纯化方法，能大幅节约构建化合物库的成本，并且提高dna编码化合物库的纯度，可以极大地提高dna编码化合物库的应用价值。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种dna编码化合物库的液相色谱纯化方法。本发明提供了一种用于dna编码化合物库纯化的液相色谱纯化方法，取dna编码化合物或其中间体，利用液相色谱柱进行洗脱，即可；其中，洗脱采用的流动相中，a相含有水、二异丙基乙胺、六氟异丙醇，b相含有甲醇。进一步地，所述流动相中，b相的体积百分数为1％～90％。进一步地，所述a相由水、二异丙基乙胺和六氟异丙醇组成。进一步地，所述a相中，异丙基乙胺的体积百分数为0.01～1％，六氟异丙醇的体积百分数为0.5％～10％，其余为水；优选地，所述a相中，异丙基乙胺的体积百分数为0.05～0.5％，六氟异丙醇的体积百分数为1％～5％，其余为水；更优选地，所述a相中，异丙基乙胺的体积百分数为0.15％，六氟异丙醇的体积百分数为2.5％，其余为水。进一步地，所述b相为甲醇。进一步地，所述方法中，洗脱条件如下：时间(min)梯度(b％，v/v)012112451390169016.11201或时间(min)梯度(b％)02424.117165716.59018.590192252。进一步地，所述dna编码化合物或其中间体的dna部分长度为25～80bp。进一步地，利用液相色谱柱进行洗脱除去的部分为长度10～60bp的单段dna片段，或n个单段dna片段相连生成的dna片段杂质；其中n为2、3或4。进一步地，所述液相色谱柱为c18色谱柱，优选为watersxbridgebehshieldrp18或ymctriantc18。进一步地，所述液相色谱柱的柱温为35～45℃。本发明中，acn为乙腈，diea为二异丙基乙胺，hfip为六氟异丙醇，meoh甲醇，teaa为醋酸三乙胺。本发明中dna编码化合物中间体表示制备dna编码化合物库终产物之前得到的、连接了dna片段的中间产物。本发明中dna编码化合物或其中间体中的dna包含由人工修饰的和/或未修饰的核苷酸单体聚合得到的单链或双链的核苷酸链。本发明的液相色谱纯化方法适用于c18色谱柱，可以根据分离样品量选择不同大小的色谱柱。实验结果表明，本发明提供了一种dna编码化合物库的液相纯化方法，该方法以水、二异丙基乙胺、六氟异丙醇、甲醇为洗脱剂，可以将长度为10～60bp的单段dna片段或多个单段dna片段相连生成的dna片段杂质与dna部分长度为25～80bp的dna编码化合物或其中间体分离。本发明的方法不仅能够有效的去除del生产过程中的单段dna片段，还能够有效除去多个单段dna片段相连生成的dna片段杂质，能够显著提升dna编码化合物库的最终产物纯度，并显著减少dna片段的用量，降低生产成本，具有非常好的应用前景。显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。附图说明图1dna编码化合物库合成过程中的单次纯化步骤示意图。图2dna编码化合物库合成过程中的多次纯化步骤示意图。图3实施例1中使用teaa体系分离的hplc图谱。图4实施例2中使用本发明方法分离的hplc图谱。图5实施例2中使用本发明方法纯化前(a)、后(b)hplc对比图。图6实施例2中使用本发明方法纯化前(a)、后(b)lc-ms对比图，图中的“dna短片段”表示单段dna片段。图7实施例2中未使用本发明方法纯化组分(a)、使用本发明方法纯化后组分(b)连接下一维度dna片段的凝胶电泳对比图。图8实施例3中使用本发明方法分离的hplc图谱，图中的“dna短片段”表示单段dna片段或多个单段dna片段相连生成的dna片段杂质。图9实施例3中使用本发明方法纯化前(a)、后(b)hplc对比图，图中的“dna短片段”表示单段dna片段或多个单段dna片段相连生成的dna片段杂质。具体实施方式本发明所用原料与设备均为已知产品，通过购买市售产品所得。本发明中采用dna编码化合物中间体的dna部分长度为25～80bp，dna片段a、b的长度为10～60bp。本发明实施例中采用的液相色谱柱型号为watersxbridgebehshieldrp18或ymctriantc18。实施例1、使用teaa体系单次分离纯化dna编码化合物库按照附图1所示的dna编码化合物库合成过程中的纯化1步骤，使用制备液相色谱(gilsongx-281，柱温为35～45℃)按表1所示梯度进行梯度洗脱，使用紫外检测器检测，收集在260nm波长有吸收的组分，并使用lc-ms及hplc对收集的组分冻干后进行表征。结果如图3所示。表1：梯度洗脱条件(a相：100mmteaa水溶液；b相：acn)时间(min)梯度(b％)012112451390169016.11201结果表明，teaa体系纯化不能将单段dna片段或多个单段dna片段相连生成的dna片段杂质与目标产物分离，从而无法去除多余的单段dna片段或多个单段dna片段相连生成的dna片段杂质。这些多余的dna片段将作为杂质进入下一维度的反应或残留至最终产物中，影响最终产品的纯度。对12个不同的dna编码化合物库按照上述teaa体系纯化，得到最终dna编码化合物库产品的纯度结果如表2所示。结果表明，采用teaa体系进行纯化所得dna编码化合物库终产品的纯度仅为60.0％～74.8％。表2：teaa体系纯化的dna编码化合物库终产品的纯度实施例2、使用本发明方法多次分离纯化(去除单段dna片段)dna编码化合物库(1)按照附图1所示的dna编码化合物库合成过程中的纯化1步骤，使用制备液相色谱(gilsongx-281，柱温为35～45℃)按表3所示梯度进行梯度洗脱，使用紫外检测器检测，收集在260nm波长有吸收的组分，并使用lc-ms及hplc对收集的组分冻干后进行表征。结果如图4所示。表3：梯度洗脱条件(a相：0.15％diea、2.5％hfip的水溶液；b相：meoh)时间(min)梯度(b％)012112451390169016.11201结果表明，本发明的液相纯化方法可以成功将单段dna与目标产物分开。对纯化前后的组分进行hplc及uplc-ms分析(图5和图6)，结果表明，纯化后组分中单段dna片段含量明显减少。(2)进一步地，按照附图2所示的dna编码化合物库合成过程，将上述纯化后的产物进行下一维度反应并进行纯化2步骤，得到最终dna编码化合物库终产品的纯度为82.9％，显著高于teaa体系纯化后得到的dna编码化合物库终产品。(3)将未经过本发明方法纯化的组分分别与0.6、1.0、1.5、2.0倍的下一维dna片段进行反应时，能明显观察到dna片段与下一维试剂连接的副产物；而经过本发明方法纯化后的组分分别与0.6(涌道1)、1.0(涌道2)、1.5(涌道3)、2.0(涌道4)倍的下一维dna片段进行反应时，该副产物明显减少(图7)。经本发明方法纯化后，使用0.6倍的下一维dna片段就可以达到未经纯化时使用1.0倍下一维dna片段时的转化率，从而减少约40％的下一维度dna片段的用量。以上实验结果表明，本发明方法能够有效的去除dna编码化合物库合成过程中的单段dna片段，提升dna编码化合物库的最终产品纯度，并显著减少dna片段的用量，降低生产成本。实施例3、使用本发明方法单次分离纯化(去除单段dna片段以及两个单段dna片段相连生成的dna片段杂质)dna编码化合物库按照附图1所示的dna编码化合物库合成过程中的纯化1步骤，使用制备液相色谱(gilsongx-281，柱温为35～45℃)按表4所示梯度进行梯度洗脱，使用紫外检测器检测，收集在260nm波长有吸收的组分，并使用lc-ms及hplc表征。结果如图8所示。表4：梯度洗脱条件(a相：0.15％diea、2.5％hfip的水溶液；b相：meoh)时间(min)梯度(b％)02424.117165716.59018.590192252结果表明，本发明的液相纯化方法可以成功将单段dna片段、两个单段dna片段相连后的dna片段杂质与目标产物分开。对纯化前后的组分进行hplc分析(图9)，结果表明，纯化后组分中单段dna片段和两个单段dna片段相连后的片段杂质含量明显减少。上述经本发明方法纯化后得到dna编码化合物库终产品的纯度为82.2％，显著高于teaa体系纯化后得到的dna编码化合物库终产品。以上实验结果表明，本发明方法不仅能够有效的去除dna编码化合物库合成过程中的单段dna片段，还能够有效除去多个单段dna片段相连后的dna片段杂质，能够提升dna编码化合物库的最终产物纯度。综上，本发明提供了一种dna编码化合物库的液相纯化方法，该方法以以水、二异丙基乙胺、六氟异丙醇、甲醇为洗脱剂，可以有效去除dna编码化合物库合成过程中的单段dna片段，还能够有效除去多个单段dna片段相连后的dna片段杂质，能够显著提升dna编码化合物库的最终产物纯度，并显著减少dna片段的用量，降低生产成本，具有非常好的应用前景。当前第1页12