1.一种脐带华通氏胶间充质干细胞成骨定向分化的方法,其特征在于,包括以下步骤:
组织消化:向脐带华通氏胶组织碎块中加入组织消化液进行消化,消化后离心,获得脐带间充质干细胞悬液;所述组织消化液中包括胶原酶i、dna酶和tryple;
初代培养:向脐带间充质干细胞悬液中加入含有双抗的完全培养基,培养;
传代培养:初代培养后,去除培养液,清洗细胞,加入包括胰蛋白酶和edta的消化液进行消化,加入完全培养液终止消化,进行传代培养;
诱导培养:取传代细胞,消化,终止消化,离心,去掉上清液,保留沉淀,向沉淀中加入完全培养基重悬,接种细胞悬液,培养至预定时间,更换为成骨细胞分化诱导培养基;所述成骨细胞分化诱导培养基包括α-mem基底液、血清替代物、地塞米松、β-磷酸甘油、抗生素、细胞因子il-β、抗坏血酸和异黄酮。
2.根据权利要1所述的方法,其特征在于,所述消化步骤具体为:将脐带华通氏胶组织剪至1mm3以下的碎块,加入组织消化液消化28~32min,消化后在温度4±1℃、转速900~1100rpm下离心4~6min,去除上清液,保留沉淀,重悬,获得脐带间充质干细胞悬液。
3.根据权利要1或2所述的方法,其特征在于,所述组织消化液以tryple为基底液,胶原酶i的浓度为0.1~0.3g/ml,dna酶的浓度为0.02~0.03mg/ml。
4.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,所述脐带华通氏胶组织在剪碎前需进行预处理,所述预处理步骤具体为:将获取的脐带剪成2~3cm,用酒精浸泡1~3min,用组织保护液进行清洗,剥离脐带的静脉和动脉,分离出脐带华通氏胶组织。
5.根据权利要求4所述的方法,其特征在于,所述组织保护液由生理盐水、硫酸庆大霉素、两性霉素b和红细胞裂解液配制而成,其中硫酸庆大霉素的浓度为23~27μg/ml,两性霉素b的浓度为3~7μg/ml,红细胞裂解液的体积百分数为3%~7%。
6.根据权利要求4所述的方法,其特征在于,将所述脐带华通氏胶组织进行储存时,先在脐带华通氏胶组织中加入冻存液,然后通过程序降温仪降温至-80~-90℃,放置液氮中长期存储;所述冻存液包括dmem、甘油、细胞因子和/或趋化因子,其中,甘油的体积百分数为33%~37%,细胞因子的体积百分数为8%~12%。
7.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述初代培养步骤中,培养p0代细胞时,温度为37±0.5℃,饱和湿度,co2浓度为5±1%,培养时间为14~16天,培养期间每隔4~5天更换一次培养基。
8.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述传代培养步骤中,所述消化液中胰蛋白酶的质量百分数为0.04%~0.06%,edta的质量百分数为0.003%~0.005%;传代培养过程中,当细胞融合度达到60%~70%时传代一次,传至p3代。
9.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述诱导培养步骤中,细胞悬液的浓度为1~3×104个/ml,每隔2~4天更换一次成骨细胞分化诱导培养基。
10.根据权利要求9所述的方法,其特征在于,所述骨细胞分化诱导培养基中,血清替代物的质量百分数为8%~12%,地塞米松的浓度为8~12nm,β-磷酸甘油的浓度8~12m/ml,抗生素的质量百分数为0.8%~1.2%,细胞因子il-β的浓度为20~30ng/ml,抗坏血酸的浓度为105mm/ml,异黄酮的浓度为8~12μg/ml。