一种用于检测人EGFR基因突变的数字PCR试剂盒的制作方法

本发明涉及数字pcr
技术领域：
，具体涉及一种用于检测人egfr基因突变的数字pcr试剂盒。
背景技术：
：在nsclc的精准医疗实践中，监测病人体内与靶向用药相关的基因突变类型可用于评估疗效。表皮生长因子受体(epidermalgrowthfactorreceptor，egfr)是靶向治疗的重要作用靶点，其酪氨酸激酶功能区由外显子18-24编码，在调节细胞增殖及分化中起着至关重要的作用。egfr基因突变是一种体细胞突变。已知人egfr基因突变主要位于外显子18-21；nsclc患者其egfr突变80％以上发生的突变为外显子l9的缺失突变(ex19del)及外显子21的l858r突变。其中外显子19缺失突变占约46％，而l858r突变占约42％。egfr-tki药物对于egfrl858r和egfr外显子19缺失突变的患者作用显著。肿瘤组织或细胞学标志是检测人egfr基因突变的常用检材，但组织取材会对患者造成创伤，有时会因为患者身体原因无法取材。近几年血浆游离dna(cfdna)被认为是可以替代肿瘤组织用来检测人egfr基因突变的样本，cfdna用于肿瘤突变检测的优势在于：操作无创；在疾病的任一进程中均可获取；可以实现实时监测和动态检测；克服肿瘤组织的特异性。血浆中cfdna含量很低，且cfdna片段很短，目前用于血浆egfr检测的方法主要有qpcr、ngs和数字pcr。ngs实验操作繁杂，成本高，检测周期长；qpcr操作简单、快速，但灵敏度相对低；数字pcr不仅快速、便捷，而且灵敏度高，在血浆egfr检测中具有极大优势。目前市场上的数字pcr通量较低，荧光通道较少，如果能进行egfr基因多位点同时检测，不仅能降低了试剂和耗材成本，而且无需分配低含量的cfdna至不同的检测体系，提高了检测灵敏度。虽然也有专利描述可以在双检测通道的基础上利用探针的浓度差异进行多位点检测，临床样本的复杂性会导致信号并非以“信号堆”的形式出现，而是以“信号带”的形式出现，从而造成各“信号带”部分重叠而导致结果难以判读。egfr最主要的突变型是ex19del、l858r，占人egfr基因突变的近90％。egfrex19del缺失突变型数量众多，qpcr常用的方法是针对每个突变型设计一条arms检测引物，arms法常见的问题就是非特异扩增野生型模板，由于数字pcr可将扩增信号(包括非特异扩增信号)富集于一个微液滴或微反应室中，arms法在数字pcr平台的非特异扩增问题更加严重。目前用数字pcr检测egfrex19del缺失突变常见的方法有2种：1.ex19del缺失突变位置相对固定，在缺失位置设计检测探针或block阻断探针，在缺失位置外侧设计通用探针，然后再设计外围通用引物，通过缺失位置检测探针或block阻断探针的结合与否区分野生型和突变型。这种方法只能间接判断缺失区域是否存在与野生型不一致序列，当缺失区域存在snp或者其他类型的碱基变化时，这种方法会出现假阳性。2.针对每个缺失突变型都设计专用的缺失突变检测探针，这种方法不仅提高了成本，而且会造成检测体系中探针总浓度过高而导致荧光本底值过高，影响检测。本发明旨在提供一种液滴数字pcr双重检测egfrex19del、l858r突变的方法和试剂盒，可用高通量检测10种ex19del缺失突变位点(arms法)和l858r位点，特异性强，灵敏度高，而且可以计算各位点突变率。技术实现要素：为了解决上述问题，本发明提供一种用于检测人egfr基因突变的数字pcr试剂盒，其特征在于，所述数字pcr试剂盒包括在同一反应管数字pcr反应体系中同时检测多种ex19del突变和l858r突变，其中ex19del位点使用多条arms引物识别突变型，l858r位点使用taqman荧光探针识别野生型和突变型；进行pcr扩增后，通过荧光信号位置和强度检测ex19del突变型、l858r突变型和l858r野生型，并对其直接进行绝对定量。在一种实施方式中，l858r的突变率直接使用数字pcr定量结果进行计算，即l858r的突变率为l858r突变型/(l858r突变型+l858r野生型)；而ex19del突变率根据l858r定量结果计算，即ex19del突变率为ex19del突变型/(l858r突变型+l858r野生型)。在一种实施方式中，检测多种ex19del突变使用的引物探针组合如下：引物或探针序列碱基变化上游引物seqidno：1aaattcccgtcgctatcaaaac2235_2249del15上游引物seqidno：2ttcccgtcgctatcaagacatc2236_2250del15上游引物seqidno：3ccgtcgctatcaaggcatctc2237_2251del15上游引物seqidno：4cgtcgctatcaaggttccg2237_2255>t上游引物seqidno：5ccgtcgctatcaaggaaccg2239_2256del18上游引物seqidno：6gtcgctatcaaggaatctccg2238_2252del15上游引物seqidno：7cgtcgctatcaaggaatcgaa2240_2257del18上游引物seqidno：8cgtcgctatcaaggaaccatc2239_2251>c上游引物seqidno：9gtcgctatcaaggaaccaacat2239_2248>c上游引物seqidno：10cgtcgctatcaaggaagcaac2239_2247del9下游引物seqidno：11gagccatggacccccac通用探针seqidno：12fam-cgatgtgagtttctg-mgb。在一种实施方式中，检测多种ex19del突变使用的引物探针组合还包括一条跨缺失区的长封闭探针，这条长封闭探针与野生型完全互补，并覆盖了arms引物区域，探针3’端用磷酸基团标记，避免探针向下延伸。在一种实施方式中，所述封闭探针为seqidno：13：cgtcgctatcaaggaattaagagaagcaacatctccgaa。在一种实施方式中，l858r突变检测探针分别用两种不同荧光基团标记，ex19del突变检测探针使用其中一种荧光基团标记；并调整l858r突变检测探针中两种不同荧光标记探针的比例，使l858r突变型信号能与ex19del突变型信号区分。在一种实施方式中，l858r突变检测的引物和探针如下：在一种实施方式中，突变型探针seqidno：17和突变型探针seqidno：18两者数字比例是2:1。在一种实施方式中，l858r定量结果用于质控模板dna的浓度和质量。10.根据权利要求1-9任一所述的检测人egfr基因突变的数字pcr试剂盒，所述试剂盒还应用于以下15种ex19del突变的检测：序号氨基酸变化碱基变化1e746_s752>a2237_2254del182e746_s752>d2238_2255del183l747_p753>q2239_2258>ca4k745_e749del2233_2247del155e746_e749del2235_2246del126l747_t751>s2240_2251del127l747_a750>p2238_2248>gc8s752_i759del2253_2276del249e746_p753>vs2237_2257>tct10e746_t751>v2237_2252>t11l747_s752>qh2239_2256>caa12e746_t751>i2235_2252>aat13l747_t751>q2238_2252>gca14e746_t751>ip2235_2251>aattc15e746_a750>ip2235_2248>aattc。本发明试剂盒具有以下优点：1)通量高、成本低：实现了ex19del25位点和l858r位点合为一管检测，提高了检测通量，降低了试剂耗材成本。2)灵敏度高：本试剂盒在复杂的检测背景下，检测灵敏仍可达0.1％，相比于常规arms方法的1％灵敏度更有优势；3)特异性强：本试剂盒针对egfr基因的多种突变设计了特定的引物和探针，并专门设计了封闭探针，所述引物和探针组合在pcr扩增反应时特异性强，200ng野生型基因组背景下无非特异信号；4)操作简单快捷，与ngs相比，操作步骤少，周期短，成本低，反应通量灵活。附图说明为更好体现本发明pcr鉴定体系的特异性与准确性，将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。图1是本发明的ex19del的arms检测体系中未加入封闭探针，检测野生型模板数字pcr扩增结果图；图2是本发明的ex19del的arms检测体系中加入封闭探针，检测野生型模板数字pcr扩增结果图；图3是本发明的ex19del的arms检测体系中加入封闭探针，检测突变型模板数字pcr扩增结果图；图4是本发明在一管数字pcr体系中同时检测ex19del和l858r数字pcr扩增结果图，其中两者的突变检测探针分别使用一种荧光标记；图5是本发明在一管数字pcr体系中同时检测ex19del和l858r数字pcr扩增结果图，其中l858r突变检测探针使用二种荧光标记的探针，ex19del突变检测探针使用其中一种荧光标记；图6是使用图5的反应体检测检测ex19del突变型结果图；图7是使用图5的反应体检测检测l858r突变型结果图；和图8是使用图5的反应体检测检测l858r野生型结果图。具体实施方式为了使本领域
技术领域：
人员更好地理解本申请中的技术方案，下面将结合下面结合实施例对本发明作进一步说明，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都应当属于本申请保护的范围。下面结合实施例对本发明作进一步描述。实施例一、本发明试剂盒的构建用于检测引物探针性能的微液滴数字pcr反应条件示例如下：首先通过核酸提取试剂盒对临床样本核酸进行提取，然后配制pcr扩增体系，pcr扩增反应混合物包括：2×mastermix预混液(bio-rad)、引物各200-1000nm、模板dna10-200ng，补水到20ul，将试剂混匀。用微液滴生成仪(bio-rad)根据说明书进行微液滴制备。然后将含有微液滴的8联排管放到pcr仪上进行扩增，扩增条件设定如下：pcr扩增后，用qx200阅读仪(bio-rad)参照仪器使用说明书进行液滴检测和数据分析。通过荧光信号位置和强度检测ex19del突变型、l858r突变型和l858r野生型，并对其直接进行绝对定量。计算ex19del、l858r突变率。一、ex19del的arms引物检测体系设计针对ex19del的10种缺失突变型设计了10条上游arms引物、1条下游通用引物和1条通用探针，该通用探针用fam荧光基团标记。引物或探针序列氨基酸变化碱基变化上游引物seqidno：1aaattcccgtcgctatcaaaace746_a750del2235_2249del15上游引物seqidno：2ttcccgtcgctatcaagacatce746_a750del2236_2250del15上游引物seqidno：3ccgtcgctatcaaggcatctce746_t751>a2237_2251del15上游引物seqidno：4cgtcgctatcaaggttccge746_s752>v2237_2255>t上游引物seqidno：5ccgtcgctatcaaggaaccgl747_t751del2239_2256del18上游引物seqidno：6gtcgctatcaaggaatctccgl747_p753>s2238_2252del15上游引物seqidno：7cgtcgctatcaaggaatcgaal747_e749del2240_2257del18上游引物seqidno：8cgtcgctatcaaggaaccatcl747_s752del2239_2251>c上游引物seqidno：9gtcgctatcaaggaaccaacatl747_t751>p2239_2248>c上游引物seqidno：10cgtcgctatcaaggaagcaacl747_a750>p2239_2247del9下游引物seqidno：11gagccatggacccccac通用探针seqidno：12fam-cgatgtgagtttctg-mgb上述体系中未加入封闭探针，检测野生型模板时出现严重非特异扩增，如图1所示。图1中纵坐标代表fam荧光值，横坐标代表vic荧光值，蓝色点代表突变型信号点，黑色点代表无扩增的阴性信号点为解决ex19del10条arms引物叠加产出的严重非特异问题，设计了一条跨缺失区的长封闭探针，这条长封闭探针与野生型完全互补，并覆盖了arms引物区域，探针3’端用磷酸基团标记，避免探针向下延伸。由于缺失突变型模板与野生型模板存在较显著差异，封闭探针只与野生型模板结合，且封闭探针tm值达到80℃，在pcr退火过程中优先与野生型模板结合，阻止了arms引物与野生型模板的结合，从而解决了非特异扩增问题。封闭探针序列如下：封闭探针seqidno：13cgtcgctatcaaggaattaagagaagcaacatctccgaa向ex19del基础体系中加入封闭探针后，检测200ng野生型基因组完全没有非特异信号点，如图2，而突变型仍可正常检出，如图3。图2、图3中纵坐标代表fam荧光值，横坐标代表vic荧光值，蓝色点代表突变型信号点，黑色点代表无扩增的阴性信号点。arms引物只扩增突变型模板，不扩增野生型模板。因此，加入野生型模板时，理论上不应该有扩增信号，因此只出现如图2的黑色无扩增阴性信号点；当存在非特异扩增时，会出现蓝色的fam阳性信号点，如图1。二、l858r的taqman探针检测体系的设计引物探针设计如下表：上述体系检测临床样本结果如图4，由图可见，l858rfam阳性信号与ex19delfam阳性信号存在部分重叠(ex19del的突变型信号、l858r的突变型信号和阴性信号连线与纵坐标夹角都为0°)。理想情况下，调整ex19del、l858rfam探针浓度差异能使ex19del、l858r突变型信号强度产生差异而达到区分效果，但由于临床样本的复杂性，临床样本l858r检测信号通常呈带状分布(如图4，蓝色点)。同样的，ex19del检测信号也可能会呈带状分布，这可能导致ex19del的突变型信号、l858r的突变型信号部分重叠而无法区分，因此无法直接将上述ex19del和l858r体系合为一管。图4中，纵坐标代表fam荧光值，横坐标代表vic荧光值，蓝色点代表突变型信号点，绿色点代表野生型信号点，橙色点代表突变型/野生型双阳性。为了能让l858r突变型信号与ex19del突变型信号区分开，将l858r突变检测探针分别用fam、vic两种荧光基团标记，并调整两者比例使突变型信号能与ex19del突变型信号显著区分，检测结果如图5。图5中，通过将l858r突变检测探针分别用fam、vic两种荧光基团标记，并调整两者比例(2:1)使l858r突变型信号(蓝色点)和阴性信号连线与纵坐标呈一定夹角，如图5，约45°；而ex19del突变型信号和阴性信号连线与纵坐标夹角为0°，达到区分效果。因此，l858r优化体系如下：三、ex19del的arms引物检测体系和l858r的taqman探针检测体系联合使用ex19del、l858r体系分别优化完成后，将两者组成双重体系，如下表：上述双重体系检测ex19del突变型结果如图6，图6中纵坐标代表fam荧光值，横坐标代表vic荧光值，蓝色点代表ex19del突变型信号点，绿色点代表l858r野生型信号点，橙色点代表ex19del突变型/l858r野生型双阳性信号点，黑色点代表无扩增的阴性信号点。上述双重体系检测l858r突变型结果如图7，图7中纵坐标代表fam荧光值，横坐标代表vic荧光值，蓝色点代表l858r突变型信号点，绿色点代表l858r野生型信号点，橙色点代表l858r突变型/l858r野生型双阳性信号点，黑色点代表无扩增的阴性信号点。上述双重体系检测l858r野生型结果如图8，图8中纵坐标代表fam荧光值，横坐标代表vic荧光值，绿色点代表l858r野生型信号点，黑色点代表无扩增的阴性信号点。四、本发明检测体系对于egfr其它位点的检测上述双重体系还可以通过arms引物交叉识别的方式检测下表中的15个缺失突变型，因此，上述双重体系可检测25种ex19del缺失突变型和1种l858r突变型，总共26种突变。序号氨基酸变化碱基变化1e746_s752>a2237_2254del182e746_s752>d2238_2255del183l747_p753>q2239_2258>ca4k745_e749del2233_2247del155e746_e749del2235_2246del126l747_t751>s2240_2251del127l747_a750>p2238_2248>gc8s752_i759del2253_2276del249e746_p753>vs2237_2257>tct10e746_t751>v2237_2252>t11l747_s752>qh2239_2256>caa12e746_t751>i2235_2252>aat13l747_t751>q2238_2252>gca14e746_t751>ip2235_2251>aattc15e746_a750>ip2235_2248>aattc五、本发明双重体系中的突变率计算和质控上述双重体系可定量检测ex19del突变型、l858r突变型和l858r野生型，l858r的突变率可用l858r突变型/(l858r突变型+l858r野生型)计算；由于ex19del、l858r分别位于egfr基因的19、21外显子，这2个外显子对egfr基因发挥功能是必不可少的，且egfr基因不存在19、21单外显子扩增的情况，egfr19外显子的拷贝数必定等于21外显子的拷贝数，所以ex19del的突变率可用ex19del突变型/(l858r突变型+l858r野生型)计算。l858r定量结果(l858r突变型+l858r野生型)用于质控模板dna的浓度和质量，这样使得本发明体系更加完善。实施例二、本发明试剂盒的应用1.使用阳性参考品和阴性参考品测试试剂盒的检测准确性和特异性。阳性参考品涵盖了每种突变类型，其中强阳性参考品11份、弱阳性参考品11份，共22份。其中的7份企业参考品均用数字pcr定量突变比例。阴性参考品包括5份人egfr基因突变阴性国家参考品、5份试剂盒检测范围外egfr其他突变阳性国家参考品和1份非人类基因组dna(企业参考品)，共11份。dna模板量为10ng，阳性参考品和阴性参考品具体如下表所示：使用3批成品试剂盒分别检测22份阳性参考品，检测结果为阳性，且型别准确。使用3批成品试剂盒分别检测11份阴性参考品，检测结果均为阴性。2.本申请试剂盒的最低检测限检测检测限参考品涵盖每种突变类型，包括8份国家参考品(由2.5％突变率阳性参考品稀释25倍制备)、3份企业参考品(由突变类型的质粒与人egfr野生型细胞系dna混合制备)，共12份。其中的3份企业参考品均用数字pcr定量突变比例。dna模板量为50ng，突变比例为0.1％的样本作为本实施例的最低检测限参考品，最低检测限参考品具体如下表所示：重复检测20次，检测得到的实验结果如下表所示：3.本申请试剂盒的重复性检测重复性参考品全部为企业参考品，包括强阳性重复性参考品、弱阳性重复性参考品和阴性重复性参考品。强阳性重复性参考品涵盖了常见的2种突变类型(由突变类型的质粒/细胞系dna与人egfr野生型细胞系dna混合制备)，共2份；弱阳性重复性参考品涵盖了常见的2种突变类型(由突变类型的质粒与人egfr野生型细胞系dna混合制备)，共2份；阴性重复性参考品1份(人egfr野生型细胞系dna)。其中，强阳性和弱阳性重复性参考品的突变比例分别为50％和5％，dna模板量为10ng，所有重复性参考品均经过数字pcr验证。重复性参考品具体如下表所示：重复检测10次，检测得到的实验结果如下表所示从以上的描述中，可以看出，本发明上述的实施例实现了如下技术效果：1)通量高、成本低：实现了ex19del25位点和l858r位点合为一管检测，提高了检测通量，降低了试剂耗材成本。2)灵敏度高：本试剂盒在复杂的检测背景下，检测灵敏仍可达0.1％，相比于arms方法的1％灵敏度更有优势；3)特异性强：本试剂盒针对egfr基因的多种突变设计了特定的引物和探针，并专门设计了封闭探针，所述引物和探针组合在pcr扩增反应时特异性强，200ng野生型基因组背景下无非特异信号；4)操作简单快捷，与ngs相比，操作步骤少，周期短，成本低，反应通量灵活。应该理解到披露的本发明不仅仅限于描述的特定的方法、方案和物质，因为这些均可变化。还应理解这里所用的术语仅仅是为了描述特定的实施方式方案的目的，而不是意欲限制本发明的范围，本发明的范围仅受限于所附的权利要求。本领域的技术人员还将认识到，或者能够确认使用不超过常规实验，在本文中所述的本发明的具体的实施方案的许多等价物。这些等价物也包含在所附的权利要求中。序列表<110>新羿制造科技（北京）有限公司<120>一种用于检测人egfr基因突变的数字pcr试剂盒<160>18<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>22<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1aaattcccgtcgctatcaaaac22<210>2<211>22<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2ttcccgtcgctatcaagacatc22<210>3<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3ccgtcgctatcaaggcatctc21<210>4<211>19<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>4cgtcgctatcaaggttccg19<210>5<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>5ccgtcgctatcaaggaaccg20<210>6<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>6gtcgctatcaaggaatctccg21<210>7<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>7cgtcgctatcaaggaatcgaa21<210>8<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>8cgtcgctatcaaggaaccatc21<210>9<211>22<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>9gtcgctatcaaggaaccaacat22<210>10<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>10cgtcgctatcaaggaagcaac21<210>11<211>17<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>11gagccatggacccccac17<210>12<211>15<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>12cgatgtgagtttctg15<210>13<211>39<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>13cgtcgctatcaaggaattaagagaagcaacatctccgaa39<210>14<211>23<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>14gcagcatgtcaagatcacagatt23<210>15<211>25<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>15cctccttctgcatggtattctttct25<210>16<211>16<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>16agtttggccagcccaa16<210>17<211>16<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>17agtttggcccgcccaa16<210>18<211>16<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>18agtttggcccgcccaa16当前第1页12