一种多功能复合生物材料、制备方法及其应用与流程

本发明属于生物医用材料技术领域，具体涉及一种多功能复合生物材料的制备方法及应用。

背景技术：

bc具有多孔三维网络结构，微纤维的尺寸约50-80nm，在纳米材料范围，有很大的比表面积，而且纳米纤维上含有大量的羟基，拥有许多有效的反应活性位点。因此，可以利用bc超精细的三维纳米网络结构为基体，来控制或合成具有特定形貌功能的新型纳米复合材料，也可以将一些容易分散且状态稳定的无机物或者聚合物分子引入到bc网络结构中，从而制备不同功能特性的bc基复合材料，满足不同领域的需求。bc优异的结构特性和模板性能为复合材料的制备提供了足够的空间，同时可以控制纳米材料的尺寸、形状、结构和性质，并且密集的三维网络可以使纳米材料均匀分散在其中，不会出现大量的堆积现象，从而得到具有预期形貌与尺寸的纳米复合材料。

目前，国内外研究报道的bc复合材料的制备方法主要包括：生物复合、溶液浸泡和溶液共混法。

生物复合法是以细菌纤维素为基质的复合材料，在bc生物合成前，在培养基中掺杂其它增强分子或单元，在bc生长过程中这些增强材料生长在bc微纤维中，成为bc原纤维网状结构的一部分，从而形成细菌纤维素基复合物。serafica等在bc发酵培养基中添加不同的微纳米颗粒制备了bc基复合材料，将氧化铁粒子复合到bc网络中，使bc带有磁性；bc中引入了碳酸钙和滑石粉，制备的复合材料具有良好的柔软性和反应灵敏性，同时机械性能强度增加了1-2倍；在bc生物发酵液中加入纸纤维微颗粒，与bc纤维共同生长成膜，相互贯穿形成网络，机械强度和韧性都得到了提高。saibuatong等将芦荟胶添加到bc发酵培养基中，静态培养制备一种新型纤维增强生物复合膜，研究发现在培养基中添加30wt％芦荟凝胶，复合膜的机械强度、结晶度、吸水性和水蒸气渗透率明显增强，另外孔径分布变窄，平均孔径与未改性的bc相比减小了4/5。yan等在培养基里加入多壁碳纳米管(mwnts)制得细菌纤维素-碳纳米管复合材料，碳纳米管被嵌入bc纤维的网络中，构建成细菌纤维素纤维-碳纳米管三维网络结构，测试结果表明该材料结晶指数、晶粒大小、纤维素iα含量均降低。朱清梅等将分子量不同的透明质酸(ha)添加到bc培养基中，发酵制得bc/ha复合膜，经过表征发现ha是以交联的形式依附在bc的微纤丝上，这样不仅提高了复合物的产量，而且bc的热稳定性和拉伸强度也有所增强。chen等在bc培养基中加入果胶，从而影响了bc薄膜结构、产量和生长速度，bc纤维丝变细，果胶填入bc网格中致使结构变的紧密。esra等通过生物复合法将不同纳米颗粒复合至bc三维网络结构中，如纤维素微纤丝，剥落的石墨烯纳米片和粘土，测试结果发现这些纳米颗粒可以嵌在bc空隙和微纤维中，并且分散良好，bc复合膜的热稳定性和残渣量明显增大。ana等在bc培养基中添加聚已酸内酯(pcl)粉末，然后通过热压法成功制得细菌纤维素/聚己酸内酯纳米复合膜，pcl粉末均匀分散在bc网格中，并且没有改变bc的网络结构，热稳定性能和机械性能明显增强，同时该材料表现出良好的生物相容性和生物降解性，在生物医学和食品包装领域有很大的应用潜力。

生物复合法是制备bc复合材料最常用的方法，而且绿色环保，但是这种技术也有一定局限性，如：一些具有生物抗菌活性的粒子如银纳米粒子、纳米氧化锌、二氧化钛等，不能直接加入到bc培养基中，因为它们对bc发酵微生物有毒性；另外，如果添加粒子在bc培养基中，容易发生絮凝沉降，使用动态搅拌发酵培养很难形成bc薄膜。

溶液浸泡法是将bc浸泡在含有纳米粒子的溶液中，通过物理吸附和氢键等增强粒子与bc结合。由于bc内部结构中存在大量的空隙，溶液和小颗粒很容易穿梭其中，同时bc含有大量的羟基，容易与纳米颗粒形成氢键，从而加固了它们之间的结合。溶液浸泡法中使用的纳米粒子可以是聚合物、无机非金属材料、金属材料等，应用范围广，方法简单易操作。胶原是细胞外最重要的不溶于水的纤维蛋白，是构成细胞外基质的骨架，能在细胞外基质中形成半晶体的纤维，给细胞提供抗张力和弹性。cai等通过将bc湿膜浸泡在胶原溶液中制备细菌纤维素/胶原复合材料，胶原同时分散在bc表面和网络内部，与bc之间通过氢键连接在一起，复合材料的热稳定性明显提高，杨氏模量和拉伸强度得到大大改善，通过细胞粘附实验对细菌纤维素/胶原复合材料的生物相容性进行评估，48h后形成细胞粘附和增殖，显示出良好的生物相容性，有望应用于伤口敷料和组织工程支架。saska等首先通过甘氨酸对bc进行酯化改性，然后使用1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺作为交联剂将i型胶与改性bc交联制备得到了bc-col复合材料，通过成骨性细胞粘附增殖实验的表征发现，17天后细胞内总蛋白质含量和细胞内碱性磷酸酶活性高于纯bc，bc-col复合材料有可能作为生物医用材料应用在骨组织工程中。kim等将干燥的bc薄膜浸泡到聚左旋乳酸(plla)的氯仿溶液中，室温下使溶剂自然挥发，制备具有生物相容性的bc/plla纳米复合材料。由于bc中微纤维的直径大概在50-80nm，小于可见光波长，因此bc/plla纳米复合材料保持了plla的透明特性，同时由于plla的加入提高了材料的力学性能，拉伸强度和杨氏模量与纯plla相比分别提高了约2倍和1.5倍。细菌纤维素也可与一些无机材料进行复合，如银纳米粒子、纳米二氧化硅、蒙脱土、羟基磷灰石等，制备出的复合材料在抗菌、力学性能等方面均有所改善。katepetch等先后将bc膜浸泡在硝酸锌溶液和氢氧化铵溶液中，同时通过超声处理，成功将纳米氧化锌(zno)引入到bc基体中，zno尺寸在54-63nm，与bc纤维丝直径接近，通过抗菌测试发现该材料对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌都具有极强的杀菌性，是一种用作医用抗菌敷料的潜在材料。mazhar等将bc薄膜浸泡在蒙脱土(mmt)悬浮液中制备bc/mmt复合材料，通过研究发现mmt粒子能均匀分散在细菌纤维素表面和三维网络结构中，结晶度由纯bc的63.22％下降到49.68％，复合材料的机械性能和热稳定性明显提高，持水能力有所下降，但水释放率增加。

溶液浸泡法简单易操作，对于增强材料的溶液和悬浮液均可适用，制得的复合材料基本保持了bc的优异性能。但是，此法对增强材料的尺寸要求比较高，而因bc内部网络结构中孔径大约在0.5-1.5μm左右，一般粒径在亚微、纳米级的粒子才能渗透进入bc超微纤维网，对于一些疏水材料，很难通过溶液浸泡法制备bc复合物；此外，bc原纤维结构分布并不是整齐均一的，渗透进去的材料很难在bc中完全均匀分散，而且复合物中添加材料的含量也不好确定，因此需要寻找一种新的bc复合材料制备方法来解决上述问题。

共混复合法是将bc溶解在溶剂中或者打浆成均浆悬浮液，然后与增强材料均匀混合，通过制膜干燥得到bc复合材料。共混复合法是一种非常好的制备bc复合材料的方法，适用各种范围的添加材料，很容易控制添加材料的含量和分布，对材料性质要求较低，但这种方法会破坏bc的原有的结构，对其性能有一定的影响。najwa将细菌纤维素和丙烯酸通过机械方法混合均匀，并用电子束辐射处理得到bc/aa复合水凝胶，通过测试显示bc/aa水凝胶呈多空网状结构，水溶胀率达到4000％-6000％，水蒸度为2175-2280g/m2/day。动物体内实验显示，水凝胶无细胞毒性，可以促进伤口愈合，增强上皮细胞生长，加速成纤维细胞的增殖，该材料有望作为烧伤敷料应用在医学领域。phisalaphong等首先将bc干膜溶解在氢氧化钠/尿素的混合溶液中，然后与海藻酸钠溶液混合形成均匀共混溶液，通过氯化钙溶液作为交联剂使bc与海藻酸钠交联成共混膜，最后用超临界二氧化碳干燥得到细菌纤维素/海藻酸盐复合膜，研究发现，细菌纤维素/海藻酸盐共混膜内部含有大量纳米微孔，具有良好的吸水能力和水蒸汽透过率，比重为4:1的共混膜的平均网孔尺寸为106nm，比表面积为19.5m²/g。suchata等使用均质机将bc湿膜粉碎成均浆，然后与海藻酸钠(na-al)溶液混合经ca²⁺固化后得到n-bca复合膜，该复合材料具有多孔稳定结构，孔径在90-160μm，在水中的溶胀率达到50倍；通过对小鼠l929成纤维细胞测试发现无细胞毒性，支持人牙龈成纤维细胞在表面上的依附、传播和扩散，n-bca复合材料具有良好的生物相容性和多孔结构，有望用作组织工程的支架。yan等生物合成bc膜后，通过双圆筒均质机打碎后与多壁碳纳米管进行混合制得bc-mwnt复合材料，测试结果表明，复合材料的最大热降解温度随mwnts增加而提高，拉伸强度和杨氏模量也大大增强。

国内外学者针对bc的改性、修饰和复合都有大量研究，也制备了性能各异的bc衍生物和复合物，但在这方面的研究仍处于起步阶段，虽然有些技术已经得到临床试验并且转化为工业生产和实际应用，但大多数研究还停留在实验室和理化性质研究的初级水平，为了将bc优越的性能充分发挥出来，满足不同行业领域的应用需求，实现其真正的价值，还需要大量的研究工作要做。

壳聚糖是一类自身具有抗菌性和生物相容性的生物高分子，在生物医学领域可用作药物载体和支架材料，被公认为优良的天然生物材料。但将壳聚糖和bc通过溶融共混的方法，制备成复合生物材料，并进一步制备成具有抑菌、止血、促进愈合多种功能的医用敷料，尚未见报道。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种多功能复合生物材料、制备方法及应用。

为实现上述目的，本案发明人经过长期研究和大量实践，得以提供本发明技术方案，具体实施过程如下：

1.一种多功能复合生物材料，所述多功能复合生物材料主要由细菌纤维素即bc和水溶性壳聚糖融合而成，其形态为膜状，其结构为排列紧密均匀的三维多孔网状结构。

优选的，所述bc为经过活化的bc纤维粉；所述活化的方法包括以下步骤：

s1、将bc膜依次经过脱色、处理成细小碎片、经胶体磨磨成浆、过滤出渣后冷冻，再进行冷冻超微粉碎，然后冷冻干燥，除去50％的水分，再次打浆，即得bc浆粕；

s2、将bc浆粕加入到乙二胺水溶液中，进行浸泡或搅拌1.5～2h，然后过滤，得到沉淀，先用水洗涤，过滤；再用乙醇浸泡，过滤，取出bc滤饼，破碎后，进行真空干燥，待水分减至5～10％之间时，取出固体，粉碎3～5秒，再干燥，得到活化bc纤维粉。

其中s1中，bc膜需充分脱色，以免产生有色杂质；再次打浆，优选采用胶体磨将bc膜磨成浆，且胶体磨工作环境低于15℃。

优选的，所述s2中，乙二胺水溶液中的乙二胺质量百分含量为15％。其中，乙二胺在水溶液的加入量应足量，目的在于使细菌纤维素稳定，防止继续分解。

优选的，所述s2中，过滤均采用抽滤方式，通过抽滤回收的乙二胺水溶液，保存于棕色瓶中，可重复使用3～4次。之后使用时，补充乙二胺在水溶液中的百分含量达到15％即可。

优选的，所述s2中，用水洗涤至滤液呈中性时，洗涤结束。洗涤时，每次需加水浸没沉淀即所洗bc浆粕。抽滤时，采用ph试纸检查出水口水滴的ph值，来判断洗涤终点。水为蒸馏水。

优选的，所述s2中，乙醇的纯度为95～99％。

优选的，所述s2中，真空干燥的方式为置于真空干燥箱中，在45～55℃温度之间烘干。其中，温度过高会影响bc纤维粉的活性。

优选的，所述s2中，粉碎采用胶体磨低温粉碎机，将bc粉碎至100目左右的粒度，且粉碎时间不能过长。因为粉碎时间过长，会导致纤维粉带静电附着于容器内壁，不便倾倒。

2.一种多功能复合生物材料的制备方法，包括以下步骤：

a1、将活化bc纤维粉溶于n,n-二甲基乙酰胺复合溶剂即dmac复合溶剂中，密封摇匀，然后静置24～30h，再在60～70℃条件下加热，即得活化bc溶液；所述活化bc纤维粉与dmac复合溶剂按g：l计为15:1；

a2、将水溶性壳聚糖粉碎成粉末，加入到活化bc溶液中，加热，搅拌，使水溶性壳聚糖粉末与活化bc溶液混合均匀，然后倒入模具，并加入凝固液，制成膜状，膜厚度定制为0.5mm，即得多功能复合生物材料；所述水溶性壳聚糖粉末与活化bc溶液按g:ml计为0.5～2.5:100。

优选的，所述a1中，dmac复合溶剂为licl与dmac按g:ml计为9:100，在60～70℃条件下，加热混溶制得。

优选的，所述a1中，静置过程中，若环境温度过低，可采用外部加热进行辅助。

其中，所述a1中，在60～70℃条件下加热的目的，在于增强溶液流动性，使bc充分溶解，若仍有少量bc颗粒未溶解，可补充少许dmac，溶解后的bc溶液为淡黄色或米黄色均匀粘稠液体。

优选的，所述a2中，水溶性壳聚糖粉末与活化bc溶液混溶的比例，按g:ml计为2:100。

优选的，所述a2中，加入的凝固液为甘油。

3.一种多功能复合生物材料在生物医学治疗中作为医用敷料的应用。

本发明的有益效果在于：

1)本发明以bc和壳聚糖为原料制得的多功能复合生物材料的形态为膜状，结构呈三维多孔的网状结构，排列紧密均匀，疏松透气，具有抗菌、抑菌、止血和促进伤口愈合的优异性能，在生物医用材料中作为医用敷料具有极大的实用价值。

2)本发明的多功能复合生物材料的制备方法为，首先将bc进行活化溶解，然后再加入水溶性壳聚糖粉末进行溶融共混，从而制成多功能复合生物材料，整个过程，具有条件温和、操作简单且安全环保的优点。

附图说明

图1为本发明的多功能复合生物材料的扫描电镜图；

图2为本发明的多功能复合生物材料的傅立叶变换红外光谱图；

图3为本实施例1制得的多功能复合生物材料样品剪成的形状；

图4为本实施例1制得的多功能复合生物材料的载荷-位移曲线图；

图5为本实施例1制得的多功能复合生物材料对小鼠创面治疗第6天的创面组织显微镜观察图；

图6为本实施例1制得的多功能复合生物材料的对小鼠创面治疗第9天的创面组织显微镜观察图；

图7为本实施例1制得的多功能复合生物材料的对小鼠创面治疗第12天的创面组织显微镜观察图。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

实施例1

一种多功能复合生物材料的制备方法，包括以下步骤：

s1、将bc膜依次经过脱色、处理成细小碎片、经胶体磨磨成浆、过滤出渣后冷冻，再进行冷冻超微粉碎，然后冷冻干燥，除去50％的水分，再次打浆，即得bc浆粕；

s2、将bc浆粕加入到质量百分数为15％的乙二胺水溶液中进行浸泡1.5h，然后过滤，得到沉淀，先用水洗涤沉淀，过滤，待滤液呈中性时，结束，再用乙醇浸泡后抽滤，取出bc滤饼，破碎后，再50℃条件下，在真空干燥箱中进行真空干燥，待水分减至5～10％之间时，取出固体，粉碎3～5秒，再干燥，得到活化bc纤维粉；

s3、将1.5g活化bc纤维粉溶于由9g的licl和100ml的dmac制得的dmac复合溶剂中，密封摇匀，然后静置24h，再在65℃条件下加热，即得活化bc溶液；

s4、将水溶性壳聚糖粉碎，取2g水溶性壳聚糖粉末加入到s3的活化bc溶液中，加热，搅拌，使水溶性壳聚糖粉末与活化bc溶液混合均匀，然后倒入模具中，并加入甘油中制成膜状，其平均厚度为0.5mm，即得多功能复合生物材料。

实施例2

本实施例中，除了水溶性壳聚糖粉末的添加量为0.5g以外，其余均与实施例1相同。

实施例3

本实施例中，除了水溶性壳聚糖粉末的添加量为2.5g以外，其余均与实施例1相同。

实施例4

本实施例中，除了水溶性壳聚糖粉末的添加量为1.5g以外，其余均与实施例1相同。

对照实施例1

本对照实施例1与实施例1相比，除了未添加水溶性壳聚糖粉末之外，其余均与实施例1相同。

将实施例1制得的多功能复合生物材料样品和对照实施例1制得的bc材料样品进行扫描电镜观察。具体操作为：将样品进行干燥，然后剪成0.5cm×0.5cm大小，用镊子夹住样品边缘，贴至离子溅射仪基地架样品放置处，注意样品要完全贴合，否则褶皱影响电镜下的观察。样品要保持绝对干燥，否则会产生放电现象。操作全程不能用手触碰样品，用镊子夹住边角，电镜下观察时应避开边角。结果如图1所示。

图1中，左图为实施例1制得的多功能复合生物材料，右图为对照实施例1制得的bc材料。从图中分析可知，对照实施例1制得的bc材料与天然纤维素结构非常相似，都是由葡萄糖分子以β-1，4糖苷键聚合而成的一种具有多孔性结构及一定纳米级孔径分布的高分子材料。与其他形式纤维不同的是细菌纤维素是一个错综复杂的链接网络结构，在1.5万倍电镜下，可以看出未添加水溶性壳聚糖粉末的bc材料有三维多孔网状结构，排列均匀，因而bc具有良好的机械性能。添加水溶性壳聚糖粉末后，制备出的多功能复合生物材料的结构呈三维多孔的网状结构，排列紧密均匀，机械性能得到加强，孔径在100nm以上，疏松透气。

将实施例1制得的多功能复合生物材料样品进行干燥，粉碎成粉末，然后与溴化钾粉末一起压片，再用傅里叶变换红外光谱仪检测，波长扫描范围为4000～400cm^-1，分辨率为4cm^-1，得到多功能复合生物材料样品的红外光谱图，结果如图2所示。

从图2中分析可知，样品在3343cm^-1附近有相同的o-h伸缩振动特征吸收峰，说明分子间发生了氢键作用，这个分子间的氢键作用与bc的吸湿性能密切相关。在2896cm^-1附近有c-h伸缩振动特征吸收峰。出现在1583cm^-1和1663cm^-1处的分别为n-h和乙酞基中c＝o的伸缩振动峰，这是壳聚糖的特征吸收峰，说明通过溶融共混法可将壳聚糖掺入bc结构中，从而得到多功能复合生物材料。由于脱乙酞度较高，壳聚糖分子中只存在少量的乙酞基，因而酞胺中的的伸缩振动峰表现为弱吸收。

将实施例1制得的一定厚度的多功能复合生物材料样品剪成如图3的形状，图3中，l0＝74.0mm，l1＝44.0mm，l2＝27.5mm，d0＝14.0mm，d1＝6.0mm，常温常压下用3367型精密万能材料测试机测试样品的拉伸性能并作应力-应变曲线，试验加载速度为20mm/min。

计算公式1：

σt-拉力应力，mpa；

f-屈服载荷、破坏载荷或最大载荷，n；

b-试样宽度，mm；

d-试样厚度，mm。

计算公式2：

εt-试样断裂伸长率，％；

δlb-试样拉伸断裂时标距l2内的伸长量，mm；

l2-测量标距，mm。

拉伸应变是指在拉伸载荷的作用下，试样标距范围内产生的长度变化率，由试验机自动计算，其结果如图4所示。

从图4中分析可知，通过共混法制得的多功能复合生物材料的最大载荷为13.47n，其在最大位移时的载荷为6.73mm。

将本实施例1制得的多功能复合生物材料制成医用敷料对小鼠的创面愈合情况进行研究。具体操作为：1)将雄性小鼠分为两组，即空白组和实验组，每组3只；2)对照组(kb)创伤后用纯bc生物敷料处理伤口，并常规饲养，即每天给予足量粮食和水，实验组(bc)创伤后用多功能复合生物材料制成的医用敷料处理伤口，其他和对照组完全一样；3)每天观察小鼠的愈合情况，分别在第6天、第9天、第12天的时候在每组中随机选取一只小鼠，将小鼠处死取创面组织，并给其他小鼠更换敷料。将取下的创面组织依次进行固定、脱水、石蜡包埋、常规做病理切片，苏木精-伊红染色，光镜下观察皮肤损害及愈合情况，结果如图5，图6和图7所示。

图5为第6天治疗情况，左图为对照组，右图为实验组，从图中分析可知，对照组肉芽组织刚开始生长，实验组已经长出肉芽组织并已经向创面中央生长。

图6为第9天治疗情况，左图为对照组，右图为实验组，从图中分析可知，对照组肉芽组织已经覆盖大部分创面，并有少量结痂，实验组肉芽组织已经覆盖整个创面，毛细血管增殖旺盛，局部表皮细胞增生。

图7为第12天治疗情况，左图为对照组，右图为实验组，从图中分析可知，对照组肉芽组织已经全部将创面覆盖，肉芽组织层增厚，毛细血管增殖旺盛，实验组毛细血管增殖旺盛，表皮细胞增生，伤口基本愈合，毛囊也开始生长。

综上所述，通过将bc与水溶性壳聚糖溶融共混之后制得的多功能复合生物材料制成的医用敷料具有防止细菌感染，柔韧性良好，有效加快伤口愈合，透气性良好的多功能作用。

以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。