一种AS3MT基因单核苷酸多态性位点检测试剂盒，使用方法及应用与流程

本发明属于医药卫生
技术领域：
，尤其涉及一种as3mt基因单核苷酸多态性位点检测试剂盒，使用方法及应用。
背景技术：
：高白细胞血症是血液科急危重症，是指患者外周血白细胞数大于10×109/l。患者易出现颅内出血、脑梗死、成人呼吸窘迫综合症、肿瘤细胞溶解症等危及生命的并发症，易导致早期死亡。急性早幼粒细胞白血病(acutepromyelocyticleukemia，apl)是一种造血干细胞恶性克隆性疾病。单剂砷剂在初发和复发的apl患者治疗中具有低复发率并且高缓解率的特点，现已成为apl治疗的一线首选药物。但砷剂治疗apl是一把双刃剑，在取得显著疗效的同时，临床应用过程中部分患者会出现高白细胞血症，严重威胁患者的早期生存率及生存质量。研究证明，砷剂产生的治疗及毒副作用取决于其产生的活性代谢产物，但是患者个体间对于砷的甲基化代谢能力存在较大的差异，这种差异会直接影响个体在治疗过程中产生的治疗效果和并发症的发生。apl患者对砷剂治疗的个体化差异及并发症的发生给apl的临床合理用药带来了极大的挑战。随着临床药物基因组学的发展，通过患者相关基因的单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphism,snp)的检测，就可以实现预测药物的疗效和毒性的目的，进而优化药物治疗方案。as3mt基因位于10号染色体的10q24.32区域，该基因中已鉴定出多种遗传多态性，包括snps和数目可变串联重复序列。根据流行病学研究发现，as3mt基因的多态性与砷在体内的代谢以及疾病的发生具有密切的联系。尽管关于as3mt基因多态性与砷甲基化代谢的研究在基因组学上取得了瞩目的成就，但是as3mt基因多态性位点与apl患者应用砷剂治疗过程中发生高白细胞血症的关系却知之甚少。技术实现要素：为解决现有技术无法预测高白细胞血症易感性的问题，本发明提供了一种as3mt基因单核苷酸多态性位点检测试剂盒，使用方法及应用。本发明的技术方案：一种as3mt基因单核苷酸多态性位点检测试剂盒，包括用于检测as3mt基因上rs3740390多态性位点的特异性引物，所述特异性引物包括扩增rs3740390多态性位点的引物和单碱基延伸rs3740390多态性位点的引物。本发明所述的as3mt基因上rs3740390位点为人类基因组10号染色体中自5’末端起第102878723位核苷酸；所述的rs3740390位点的核苷酸为c/t。进一步的，所述扩增rs3740390多态性位点的引物序列为：上游引物：5’-tcttgcctcctgtacaatgg-3’，即seqidno.1；下游引物：5’-cagaaaaatgggaggcaatg-3’，即seqidno.2。进一步的，所述单碱基延伸rs3740390多态性位点的引物序列为：5’-ttttttgtaaatagagtgaagtgct-3’，即seqidno.3。进一步的，还包括如下试剂：depc水、quicktaqhsdyemix、pcr产物纯化酶、单碱基延伸反应酶及相应缓冲液和单碱基延伸产物纯化酶。本发明提供的as3mt基因单核苷酸多态性位点检测试剂盒的使用方法，步骤如下：步骤一、收集外周静脉血并从中提取基因组dna；步骤二、利用扩增rs3740390多态性位点的引物，以基因组dna为模板进行as3mt基因上rs3740390多态性位点的pcr扩增；步骤三、对步骤二所得pcr扩增产物进行纯化；步骤四、利用单碱基延伸rs3740390多态性位点的引物，以步骤三所得纯化后的pcr扩增产物为模板进行rs3740390多态性位点的单碱基延伸；步骤五、对步骤四所得单碱基延伸产物进行纯化；步骤六、对步骤五所得纯化后的单碱基延伸产物进行测序。进一步的，步骤二所述pcr扩增的反应体系为：depc水16μl、quicktaqhsdyemix25μl、基因组dna模板7μl、上游引物1μl和下游引物1μl。进一步的，步骤三所述pcr扩增产物的纯化方法为取虾碱性磷酸酶与核酸外切酶i按体积比1:1混合配制消化液，在pcr扩增产物中加入消化液，37℃条件下温浴60min，80℃条件下灭活15min。进一步的，步骤四所述单碱基延伸的反应体系为：步骤三所得纯化后的pcr扩增产物模板2μl、步骤四所述单碱基延伸rs3740390多态性位点的引物2μl、bigdye0.8μl、sequencingbuffer1.6μl和depc水3.6μl。进一步的，步骤五所述单碱基延伸产物的纯化方法为在单碱基延伸产物中加入虾碱性磷酸酶，37℃条件下温浴60min，75℃条件下灭活15min。本发明提供的as3mt基因单核苷酸多态性位点检测试剂盒在预测高白细胞血症易感性中的应用，特别是在预测砷剂治疗apl过程中高白细胞血症的易感性中的应用。本发明所述的砷剂包括亚砷酸、复方黄黛片及其他用于治疗apl的砷剂。as3mt基因上rs3740390位点为cc基因型的待测apl患者经砷剂治疗发生高白细胞血症的风险性高于rs3740390位点为ct基因型或tt基因型的待测apl患者。本发明的有益效果：本发明提供了一种as3mt基因单核苷酸多态性位点检测试剂盒及其使用方法，能够快速准确的检测出as3mt基因上rs3740390多态性位点的基因型。将本发明应用于预测砷剂治疗apl过程中高白细胞血症的易感性，通过检测患者as3mt基因上rs3740390多态性位点的基因型能够准确预测其经砷剂治疗后是否具有更高的高白细胞血症的易感性，从而实现砷剂的个体化科学用药，有效降低砷剂治疗apl过程中高白细胞血症的发生率和病死率，具有十分重要的临床意义。附图说明图1为单碱基延伸产物dna测序分析图，图中虚线框所示为as3mt基因上rs3740390多态性位点，图a所示rs3740390多态性位点为cc型，图b所示rs3740390多态性位点为ct型，图c所示rs3740390多态性位点为tt型；图2为as3mtrs3740390位点与高白细胞血症之间的关系对比图。具体实施方式下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步的说明，但并不局限于此，凡是对本发明技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的保护范围中。实施例1一种as3mt基因单核苷酸多态性位点检测试剂盒，包括如下试剂：(1)检测as3mt基因上rs3740390位点的特异性引物；(2)depc水；(3)quicktaqhsdyemix；(4)pcr产物纯化酶；(5)单碱基延伸反应酶及相应缓冲液；(6)单碱基延伸产物纯化酶。其中，用于检测as3mt基因上rs3740390多态性位点的特异性引物包括扩增rs3740390多态性位点的引物和单碱基延伸rs3740390多态性位点的引物。本实施例中扩增rs3740390多态性位点的引物序列为：上游引物：5’-tcttgcctcctgtacaatgg-3’，即seqidno.1；下游引物：5’-cagaaaaatgggaggcaatg-3’，即seqidno.2。单碱基延伸rs3740390多态性位点的引物序列为：5’-ttttttgtaaatagagtgaagtgct-3’，即seqidno.3。本实施例中引物的设计是针对as3mt基因进行的，具体流程为：在ncbi上查找灵长类，mrna序列中的as3mt基因的序列(ay817668)，使用primer5.0软件设计引物，从其中选择得分最高的引物，使用oligo6.0软件对设计的引物进行评价，在ncbi网站进行blast检验引物的特异性，将合格的引物序列提交到thermofisherscientific(invitrogen)公司进行制备。本发明所述的as3mt基因上rs3740390位点为人类基因组10号染色体中自5’末端起第102878723位核苷酸；所述的rs3740390位点的核苷酸为c/t。实施例2本实施例为实施例1提供的as3mt基因单核苷酸多态性位点检测试剂盒的使用方法，步骤如下：步骤一、收集外周静脉血并从中提取基因组dna；步骤二、利用扩增rs3740390多态性位点的引物，以基因组dna为模板进行as3mt基因上rs3740390多态性位点的pcr扩增；步骤三、对步骤二所得pcr扩增产物进行纯化；步骤四、利用单碱基延伸rs3740390多态性位点的引物，以步骤三所得纯化后的pcr扩增产物为模板进行rs3740390多态性位点的单碱基延伸；步骤五、对步骤四所得单碱基延伸产物进行纯化；步骤六、对步骤五所得纯化后的单碱基延伸产物进行测序。实施例3本实施例提供了收集外周静脉血并从中提取基因组dna的具体方法，步骤如下：1.采集apl患者的血液标本患者为符合中国急性早幼粒细胞白血病诊疗指南(2018年版)的初发apl患者。收集患者外周静脉血2ml于含edta的采血管中。2.提取患者基因组dna应用全基因组dna提取试剂盒(北京天根生化有限公司产品)，按照说明书从患者200μl外周血中提取患者基因组dna。具体操作流程如下：(1)取患者外周静脉血200μl，加入20μl蛋白激酶k，混匀。(2)加200μl缓冲液gb，充分颠倒混匀，56℃孵育10min，其间颠倒混匀数次，溶液应变清亮。(3)加200μl无水乙醇，充分颠倒混匀。(4)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱cb3中，12000rpm离心30sec，倒掉收集管中的废液。(5)向吸附柱cb3中加入500μl缓冲液gd，12000rpm离心30sec，倒掉收集管中的废液。(6)向吸附柱cb3中加入600μl漂洗液pw，12000rpm离心30sec，倒掉收集管中的废液。(7)重复步骤(6)。(8)倒掉收集管中的废液。(9)12,000rpm离心2min，倒掉废液。将吸附柱cb3置于室温放置数分钟。(10)将吸附柱cb3转入1.5ml离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加50洗脱缓冲液tb，室温孵育5min，12000rpm离心2min，将溶液收集到离心管中,即得。实施例4本实施例提供了利用扩增rs3740390多态性位点的引物，以实施例3提取得到的基因组dna为模板进行as3mt基因上rs3740390多态性位点的pcr扩增及产物纯化方法，步骤如下：(1)患者dna浓度评估取实施例3所得患者dna样本1μl，于nanodrop分光光度计(nd-1000,thermofisherscientific)上进行dna浓度及纯度检测：dna纯度：dna应在od260处有显著吸收峰，od260/od280比值应为1.7-1.9，dna浓度：大于30ng/μl。(2)目的基因位点的pcr扩增反应扩增rs3740390多态性位点的引物：5’-tcttgcctcctgtacaatgg-3’(seqidno.1),5’-cagaaaaatgggaggcaatg-3’(seqidno.2)；如表1所示配制50μlpcr反应体系：表1试剂名称用量(μl)depc水16quicktaqhsdyemix25dna模板7primer(seqidno.1)1primer(seqidno.2)1表1中depc水购自invitrogen公司，quicktaqhsdyemix购自toyobo公司。设置pcr扩增反应程序：第一步：活化dna聚合酶：95℃×3min；第二步：于95℃变性30s，在55℃退火30s，在72℃延伸35s。共循环35次；第三步：在72℃延伸2min，于4℃保持。(3)pcr产物的纯化如表2所示配制消化液：表2试剂用量(μl)虾碱性磷酸酶1核酸外切酶i1表2中虾碱性磷酸酶(shrimpalkalinephosphatase，sap)和核酸外切酶i(exonucleasei)均购自abi公司。纯化反应：步骤(2)所得pcr扩增产物中加入2μl消化液后置于pcr仪中37℃条件下温浴60min,80℃条件下灭活15min,得到纯化的pcr扩增产物，4℃下进行保持。实施例5本实施例提供了利用单碱基延伸rs3740390多态性位点的引物，以实施例4所得纯化后的pcr扩增产物为模板进行rs3740390多态性位点的单碱基延伸方法及延伸产物纯化方法，步骤如下；(1)单碱基延伸反应单碱基延伸rs3740390多态性位点的引物:5’-ttttttgtaaatagagtgaagtgct-3’(seqidno.3)；单碱基延伸反应条件：如表3所示配制单碱基延伸反应体系(10μl)：表3试剂名称用量(μl)纯化后的pcr产物2primer(seqidno.3)2sequencingbuffer1.6bigdye0.8depc水(invitrogen)3.6表3中sequencingbuffer和bigdye为abiprismtmbigdyetmterminatorv3.1cyclesequencingkit试剂包中配套的试剂。设置单碱基延伸反应程序：第一步：96℃预变性2min；第二步：96℃×10s,55℃×5s,60℃×90s。共25个循环次；第三步：于4℃保持。(2)延伸产物的纯化：取虾碱性磷酸酶1μl加至10μl延伸产物中，在37℃条件下温浴60min,再于75℃条件下灭活15min，得到纯化后的单碱基延伸产物。实施例6本实施例对实施例5所得纯化后的单碱基延伸产物进行测序及结果分析，并预测高白细胞血症的易感性，具体方法如下：(1)应用abiprism3730xl测序仪进行sanger测序；(2)基因分型：采用chromaspro2.4.1软件分析测序结果，并判定rs3740390多态性位点基因型。如图1所示，当测序结果如图a所示时，rs3740390多态性位点的基因型为cc基因型；当测序结果如图b所示时，rs3740390多态性位点的基因型为ct基因型；当测序结果如图c所示时，rs3740390多态性位点的基因型为tt基因型。实施例7利用本发明提供的as3mt基因单核苷酸多态性位点检测试剂盒检测74例采用亚砷酸单剂持续慢点疗法的初发apl患者as3mtrs3740390多态性位点的基因型，受试患者全部成功完成了诱导缓解，其中有36人在治疗过程中发生了高白细胞血症，38例患者未发生高白细胞血症。上述74例患者的as3mtrs3740390多态性位点分析显示，该多态性位点基因型分布均符合hardy-weinburg平衡，结果见表4。表4由于纯合突变型的患者例数较少，所以将患者分为突变型(杂合型+纯合突变型)和野生型两组。经统计学分析显示，apl患者经砷剂治疗过程中高白细胞血症的发生与as3mtrs3740390位点的多态性具有相关性(p<0.01)，结果见图2。因此，as3mtrs3740390位点多态性可以预测apl患者砷剂治疗过程中高白细胞血症的易感性。其中，as3mt基因上rs3740390位点为cc基因型的样本发生高白细胞血症的风险性高于rs3740390位点为ct基因型或tt基因型的样本。即当患者as3mtrs3740390多态性位点基因型为cc时，预测其有更高的高白细胞血症的易感性。将本发明提供的as3mt基因单核苷酸多态性位点检测试剂盒用于预测正在接受砷剂治疗的apl患者高白细胞血症易感性，通过检测患者as3mt基因上rs3740390多态性位点的基因型能够准确预测其经砷剂治疗后是否具有更高的高白细胞血症的易感性，从而实现砷剂的个体化科学用药，有效降低砷剂治疗apl过程中高白细胞血症的发生率和病死率，具有十分重要的临床意义。sequencelisting<110>哈尔滨医科大学<120>一种as3mt基因单核苷酸多态性位点检测试剂盒，使用方法及应用<130>1<160>3<170>patentinversion3.3<210>1<211>20<212>dna<213>人工序列<400>1tcttgcctcctgtacaatgg20<210>2<211>20<212>dna<213>人工序列<400>2cagaaaaatgggaggcaatg20<210>3<211>25<212>dna<213>人工序列<400>3ttttttgtaaatagagtgaagtgct25当前第1页1 2 3