本发明属于家畜分子生物技术领域，尤其涉及一种与猪产仔数相关的crictcp1标记应用。
背景技术：
增加窝产仔数一直是全球养猪者和生产商的目标，更大的产仔数加上更短的产仔间隔极有可能使每年每头母猪的产仔量(psy)增加，这是促进母猪饲养经济成功的主要力量(zak等人2017年；kemp等人2018年)。卵巢是雌性动物重要的生殖器官，在每一发情周期都经历一系列的生物学过程。母猪的多产性由涉及卵巢编码和非编码基因的复杂转录网络的紧密调节(张等2015；huang等人2016；tang等人2018)。同时产仔数是评估猪繁殖性状最直接和最具有价值的性状，提高猪的产仔数对猪产业具有非常重要的意义。产仔数是衡量母猪繁殖性能的重要指标之一，也是猪的重要经济性状。
产仔数性状作为复杂的数量性状，产仔数是复杂多基因控制性状，遗传力很低。总产仔数(totalnumberborn，tnb)的遗传力为(0.062±0.023)，产活仔数(numberbornalive，nba)的遗传力在纯种群体中为0.049±0.023，在杂交群体中为0.091±0.054，同时，母猪的年龄、胎次、与配公猪的精液品质以及妊娠过程中母猪的营养状况都是影响产仔数的因素。随着生物技术的发展及生猪养殖水平的不断提高，大量研究者鉴别出产仔数相关的标记，使用标记辅助选择(markerassistedselection，mas)或全基因组选择(genomeselection，gs)可加快猪的繁殖性状的改良。
共价闭合的环状rnas(circrnas)正作为一类新的基因表达调节剂出现(li等人2018年)。现在，积累的工作已经揭示了环状rna结构在许多物种性腺发育和繁殖性能中的关键作用(quan和li，2018)。下一代测序表明，内源性环状rna通常以时空特异性的方式在各种猪组织中表达，包括卵巢(liang等人2017年)。最近的研究表明，人类卵巢源性环状rna与卵巢衰老有关(cai等人，2018)；虽然专利号201610841933.2公开了一种与猪产仔数相关的microrna标记应用，但该方法需要选择猪种垂体进行标记，且研究者仍好奇：不同产仔量的母猪是否有不同的环状rna结构。
加之，繁殖性能由多基因调控，调控机理十分复杂，根据《母猪产仔数影响因素研究进展》(李川琦等人发表)中记载“目前由国内外专家通过大量的工作，鉴定出的母猪繁殖性能主效基因多达5个，分别为雌激素受体(esr)、促卵泡激素β亚基(fshβ)、催乳素基因(prlr)、视黄醇(rbp4)和肥胖基因(ob)。如发现的梅山猪esr基因可影响约1.4头/窝的总产仔数和超过1头/窝的产活仔数，确定了esr基因调控母猪产仔的主基因地位；目前，人们发现的与母猪产仔性能相关的微效基因有20多个，如骨桥基因(opn)、褪黑素受体基因(mr)和hsd基因家族等，这些基因也可影响母猪的产仔性能。近些年，牛步月通过qtl分析，预测了mmp2、prei3和spag1等10个候选基因；刘林清和nin等又先后鉴定出了hsd17b1、mlh1和klk7等与母猪繁殖性能相关基因”，这说明了对于产仔数相关的标记基因仍值得关注与深入探索。
技术实现要素：
本发明的目的在于利用高通量测序技术鉴别影响产仔性能的基因，为鉴别影响产仔数的主效基因位点与机制提供帮助，为产仔数分子育种提供分子标记信息，以期为猪的候选环状rnas及优良品种选育和利用提供参考。
1.本发明提供标记基因circ-tcp1对mir-183调控在母猪产仔能力判断方面的应用；所述circ-tcp1基因与mir-183的表达呈反向相关；所述circ-tcp1与母猪产仔能力呈负相关，mir-183与母猪产仔能力呈正相关。
2.上述1提供的应用，该应用通过分析circ-tcp1表达水平判断母猪产仔能力大小。
3.上述1提供的应用，该应用通过分析mir-183表达水平判断母猪产仔能力大小。
4.上述1提供的应用，该应用通过分析circ-tcp1和mir-183表达水平在母猪产仔能力判断方面的应用
5.上述1-4任一项提供的应用，该应用方法具体包括如下步骤：
(1)组织rna提取：提取不同个体母猪卵巢或血液中rna，用三唑仑试剂(invitrogen)纯化rna，得到总rna；
(2)引物设计：根据待分析目标基因分别设计候选基因circ-tcp1的qpcr引物circ-tcp1、mir-183的qpcr引物β-actin；
(3)反转录合成第一链cdna：使用反转录试剂盒对反转录步骤(1)得到的总rna，合成第一链cdna；
(4)采用q-rt-pcr方法测定候选基因circ-tcp1、mir-183在母猪卵巢或血液中的相对表达量；
(5)根据circ-tcp1在卵巢和血液中的表达量，mir-183在卵巢和血液中的表达量，判断不同母猪个体之间产仔能力相对高低。
其中，引物circ-tcp1的上游序列为：gggaccttaaacgcattgcta，下游序列为：ggtccagtttttcagggtctgt；产物长度147bp；
引物β-actin的上游序列为ggacttcgagcaggagatgg；下游序列：aggaaggagggctggaagag；产物长度134bp。
6.上述5提供的应用，其中，步骤(3)中反转录的具体操作为：将总rna样品用epicenterribo-zerorrna去除试剂盒去除核糖体rna，然后用二价阳离子在94℃孵育8分钟，将核糖体缺失的rna碎片化为150-200℃，将切割后的rna片段用end-itdnaendrepairkit处理cdna以修复末端，然后用klenow修饰以在3'末端添加a，最后连接到索引的衔接子上；纯化连接的cdna产物并用尿嘧啶dna糖基化酶处理以除去第二链cdna；通过13-16个pcr扩增循环富集纯化的第一链cdna。
7.上述5提供的应用，其中，步骤(4)所述q-rt-pcr方法中反应过程为：95℃30秒，然后95℃5秒，60℃30秒，40个循环，70℃10分钟伸长。
本申请提供的“比较”概念是个体间的比较，根据不同个体间标记基因circ-tcp1、mir-183表达量，可以确定不同个体间产仔能力的大小；“高”“低”通过个体之间数据比较获得，是一个相对的概念。
本申请中circtcp1全长序列：
gcatgcccaagagaatagttaatgcaaaaattgcttgccttgacttcagcctgcaaaaaacaaaaatgaagcttggtgtacaagtggttattacagaccctgaaaaactggaccagattagacagagggaatcagatatcaccaaggagcgaatccagaagattctggcaactggtgccaatgttattctaaccactggtgggattgacgacatgtgtctgaagtattttgtggagaccggtgccatggcagttagaagagttttaaaaagggaccttaaacgcattgctaaagcttctggag；
mir-183的序列：
通过在线软件mirbase，获得mir-183的碱基序列，通过序列比对，得到以下比对结果如下，发现mir-183种子序列在各个物种之间高度保守：
＞ssc-mir-183uauggcacugguagaauucacug
＞mmu-mir-183-5puauggcacugguagaauucacu
＞has-mir-183-5puauggcacugguagaauucacu
＞rno-mir-183-5puauggcacugguagaauucacu
＞mml-mir-183-5puauggcacugguagaauucacug
＞chi-mir-183uauggcacugguagaauucacu
＞tch-mir-183-5puauggcacugguagaauucacu
本发明具有如下优点：
1.本申请获得了猪种卵巢或血液中circ-tcp1和mir-183三者之间的靶向关系关系，由此得出母猪产仔能力与circ-tcp1和mir-183基因表达差异之间的关系，为优良品种选育和利用提供参考。
2.本申请实现了测试卵巢或血液中circ-tcp1、mir-183中任一或两者的表达水平，便可准确快速比较出不同母猪个体间产仔能力高低。
3.本申请还分析了环状rna和mirnas在不同母猪个体间产仔能力的表达差异以及相互作用关系。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实例或现有技术中的技术方案，下面将对实施实例或现有技术描述中所需要的附图做简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实例，对于本领域普通技术人员来说，在不付出创造性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图：
图1为实施例1预测的环状rna分布；
图2为实施例1中sls和lls猪的环状rna和mirna表达差异；
图3为实施例1中通过qpcr对差异表达环状rna的验证；
图4为实施例1中通过qpcr对差异表达的mirna的验证；
图5为实施例1中差异表达的mirna与环状rna相互作用的验证；
图6为实施例1中mir-183功能分析；
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明，但本发明并不局限于这些实施方式，任何在本实施例基本精神上的改进或代替，仍属于本发明权利要求所要求保护的范围。
实施例1
本实施例从多产母猪中选择了6个卵巢，并具有完整的多产性记录，采用高通量测序技术结合生物信息学工具，发现了与产仔数相关的环状rna；
1.材料和方法
1.1本收集
本实施例的卵巢选自猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus，prrsv)和猪伪狂犬病毒(pseudorabiesvirus，prv)是抗原阴性的高产仔数(lls，largerlittersize)和低产仔数(sls，smallerlittersize)大白长白二元杂交母猪，且在第4次分娩后第4天的母猪，这对prrsv和prv是阴性的；对于rna序列，从每组小窝和大窝产仔数中抽取3个卵巢(小窝产仔数为8.48±0.53只/窝，大窝产仔数为16.19±0.43只/窝)；在rt-qpcr测定中，对更多的卵巢进行取样(8.78±1.75幼仔/窝vs14.83±1.61幼仔/窝，n＝12)；所有母猪均在新又鲜畜牧有限公司(中国广西南宁)的标准屠宰场屠宰，左侧卵巢迅速取出并冷冻在液氮中；
1.2rna序列分析
将冷冻卵巢组织在trizoltm试剂(invitrogen，carlsbad，ca，usa)中匀浆，并使用nd-1000纳米滴(thermofisher，wilmington，de，usa)对每个样本进行定量。用agilent2200(agilent，paloalto，ca，usa)分析rna完整性编号(rin)，并用rin>7.0的rna进行rna序列分析；
在cdna文库构建前，将总rna样品(3μg)用epicenterribo-zerorrna去除试剂盒(美国加州圣地亚哥illumina)去除核糖体rna(rrna)，然后用二价阳离子在94℃孵育8分钟，将核糖体缺失的rna碎片化为150-200℃。根据truseqrnalt/ht样品制备试剂盒(美国伊鲁米娜)的描述，将切割后的rna片段反转录为第一和第二链cdna。简言之，用end-itdnaendrepairkit处理cdna以修复末端，然后用klenow修饰以在3'末端添加a，最后连接到索引的衔接子上。纯化连接的cdna产物并用尿嘧啶dna糖基化酶处理以除去第二链cdna。通过13-16个pcr扩增循环富集纯化的第一链cdna。通过bioanalyzer2200(agilent，santaclara，ca)评估最终的cdna文库，并通过hiseq2000(illumina，sandiego，ca，usa)进行测序；
通过iontotalrna-seqkitv2.0(lifetechnologies)构建mirna文库，并通过page凝胶电泳和用于mirna测序的方法选择大小；
1.3生物信息学分析
通过快速质量控制(http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/)和评估指标(包括质量分数、核苷酸分布、gc含量、kmer频率等)测试原始测序数据。使用ngsqctoolkit(v2.3.3)从读取数据中裁剪出低质量的基和n基，并获得高质量的干净读取数据以供后续分析。使用hisat2软件将干净的读取数据映射到参考基因组(sscrofa11.1assembly，http://genome.ucsc.edu)；
ciri被用来识别环状rna；扫描对准结果(sam格式)以搜索成对的交叉剪切(pcc)和成对的末端映射(pem)信号以及gt-ag拼接信号。所有具有连接位点的序列均采用动态编程算法重新调整为参考基因组，以确保推定的环状rna的可靠性；跨越后拼接连接的读取总数被用作环状rna丰度的绝对量度；
用deseq2方法探讨不同组间差异表达的mrna，标准为log2(倍数变化)>1，fdr<0.05；用edgerseq研究各组间环rna和小rna的差异表达，其临界值log2(倍数变化)>1，fdr<0.05；对基因本体(go)功能(http://www.geneontology.org/)和京都基因与基因组百科全书(kegg，http://www.genome.jp/kegg)的靶基因途径进行了注释；
1.4cerna网络建设
miranda(http://miranda.org.uk/)和rnahide2(http://bibiserv.techfak.unibielefeld.de/rnahide)预测了潜在的microrna-circrna相互作用；用spss-pearson相关分析法计算了环状rna和mirna表达水平之间的相关性；
1.5rtqpcr验证
用三唑仑试剂(invitrogen)纯化总rna；从每个样本中提取2μg总rna的等分试样，并通过随机引物(takara，otsu，japan)进行反转录；对于mirna分析，使用特异性逆转录引物和程序；使用一步法sybyprimescriptrt-一式三份进行实时pcr反应(95℃30秒，然后95℃5秒，60℃30秒，40个循环，70℃10分钟伸长)；在bio-radiq5tm系统(bio-rad，berkeley，ca，usa)上的pcr试剂盒(takara)；将circrna和mirna的表达分别归一化为β-肌动蛋白和u6小rna的表达；qpcr的引物序列如表1所示；
表1本实施例所用引物序列
1.6双荧光素酶测定
利用通用生物系统(安徽滁州)合成了一个约400bp的包含假定的mirna结合位点的环状rna片段，并将其插入到psichecktm-2载体(美国威斯康星州麦迪逊普罗米加)中，构建了psichecktm-2质粒；然后用lipofectinm2000(美国马萨诸塞州沃尔瑟姆市thermofisherscientific公司)将psi-circrna结构与其相应的mirna(中国广州的ribobio)共转染到293t细胞中，用双荧光素酶报告系统(promega)24小时检测荧光素酶活性；
1.7统计分析
数据用spss19.0软件处理，结果以平均值±sem表示；通过非配对student'st检验评估显着差异，并将p<0.05定义为统计学显着性；
2.结果
2.1猪卵巢环rna研究概况
每组3个卵巢(小窝与大窝)进行rna测序，共预测出38722个环状rna，广泛分布于所有染色体(图1a和b)；然而，所有样本中只表达1291个环rna(图1c)；
2.2不同产仔数猪的差异环状rna表达谱
通过rna序列鉴定出110个环状rna(在lls猪体中下调56个，上调54个)和20个mirna(在sls猪体中下调11个，上调9个)；
鉴于rna序列样本间的高变异性，样本池扩大到每组12个，在用rt-pcr确认上述差异表达的环状rna和mirna时，共使用24个卵巢；从扩大的样本量来看，rt-pcr检测发现，产仔量较小的猪卵巢中，circ-erbn、circ-sntb2、circ-tcp1和circ-kmt2a的表达显著较高，而circ-ccdc85a和circ-ccar1在产仔量较大的猪卵巢中的表达显著较高；
对于差异表达的小rna，sls组的mir-183和mir-7857-3p水平显著降低，而lls组的mir-497-5p水平显著降低，这与高通量测序一致；
2.3环状rna与mirna轴的鉴定
在上述检测到的差异表达的环状rna和mirna中，rna杂交分析显示，mir-183与circ-tcp1、mir-497和circ-ccdc85a相互作用，并且mir-183的表达与circ-tcp1反向相关，两者之间也有相似的趋势；同时，双荧光素酶报告分析表明，mir-183可直接与circ-tcp1结合，而mir-497与circ-ccdc85a的直接相互作用未被检测到；
2.4mir-183功能分析
采用targescan和mirdb预测了mir-183的潜在靶标，并对这两种策略所表达的共同基因进行了kegg和go分析；kegg表明，mir-183可能调节dna模板化和rna-polii介导的转录(图6a)；go富集分析表明，mir-183可能与pi3k-akt信号活性密切相关(图6b)；
3.分析与结论
本实施例的目的是确定与猪生育能力相关的潜在环状rna，甚至rna-seq仅筛选出在每个卵巢中表达的总共1291个外显子衍生的环状rna，仍有几个环状rna在具有小和大窝产仔数的卵巢中差异表达；为了克服个体差异的不足，rt-qpcr在大规模样本上进一步验证了目的环状rna的表达，重要的是：在产仔量较小的猪卵巢中检测到更多的circ-tcp1；
环状rna的一个途径是竞争性地结合功能性mirna，即竞争性内源性rna(cernas)；本实施例中源自猪tcp1(t-复合蛋白1亚基α)基因的外显子7和8的circ-tcp1在具有较大窝产仔数的卵巢中显着较低表达；tcp1基因编码分子伴侣，该分子伴侣是含有tcp1复合物(cct)的伴侣蛋白的成员，也称为tcp1环复合物(tric)，其折叠各种蛋白质，包括肌动蛋白和微管蛋白；所以，本实施例1中circ-tcp1通过在线rnahybrid软件吸收mir-183，此外，mir-183与circ-tcp1呈现显着的反向谱，并且通过荧光素酶活性测定进一步证实了circ-tcp1和mir-183之间的相互作用；总的来说，我们的数据表明circ-tcp1-mir-183轴参与了与产仔数相关的生物过程。
mir-183属于高度保守的mir-183-96-182簇，已经完全显示与雌性生育力有关；mir-183-96-182簇的成员被描述为靶向foxo1的3-utr，foxo1是啮齿动物卵巢颗粒细胞中促卵泡激素响应基因的重要转染因子；有文献揭示了foxo1和mir-183-96-182簇与牛卵巢卵泡发育有关以及mir-183在卵巢癌细胞中高表达，mir-183的下调显着抑制细胞增殖并通过靶向母亲对抗decapentaplegichomolog4(smad4)促进细胞凋亡；在本实施例1中，kegg和go测定表明mir-183与基因转录有关，尤其与pi3k-akt信号传导有关。全基因组分析显示，与杜洛克猪卵巢不同卵泡期相关的pi3k-akt活性相关基因发生了变化，猪卵巢颗粒细胞生长因细胞外受损而pi3k-akt活性受到显着抑制。改变的pi3k-akt信号传导有助于阻止卵巢细胞中17β-雌二醇的分泌。
在实施例1中，用rna序列对猪卵巢外显子衍生的环状rna进行全基因组鉴定，其中许多环状rna在产仔数不同的卵巢中有不同的表达；此外，大部分外显子环状rna都含有mirna结合位点，且环tcp1-mir-183轴可能与猪产仔数有关。
其中，
circtcp1全长序列：
gcatgcccaagagaatagttaatgcaaaaattgcttgccttgacttcagcctgcaaaaaacaaaaatgaagcttggtgtacaagtggttattacagaccctgaaaaactggaccagattagacagagggaatcagatatcaccaaggagcgaatccagaagattctggcaactggtgccaatgttattctaaccactggtgggattgacgacatgtgtctgaagtattttgtggagaccggtgccatggcagttagaagagttttaaaaagggaccttaaacgcattgctaaagcttctggag；
mir-183的序列：
通过在线软件mirbase，获得mir-183的碱基序列，通过序列比对，得到以下比对结果如下，发现mir-183种子序列在各个物种之间高度保守：
＞ssc-mir-183uauggcacugguagaauucacug
＞mmu-mir-183-5puauggcacugguagaauucacu
＞has-mir-183-5puauggcacugguagaauucacu
＞rno-mir-183-5puauggcacugguagaauucacu
＞mml-mir-183-5puauggcacugguagaauucacug
＞chi-mir-183uauggcacugguagaauucacu
＞tch-mir-183-5puauggcacugguagaauucacu
实施例2
本实施例提供标记基因circ-tcp1对mir-183调控在母猪产仔能力判断方面的应用；所述circ-tcp1基因与mir-183的表达呈反向相关；所述circ-tcp1与母猪产仔能力呈负相关，mir-183与母猪产仔能力呈正相关；
本实施例提供的应用，该应用通过分析circ-tcp1表达水平判断母猪产仔能力大小；
该应用方法具体包括如下步骤：
(1)组织rna提取：提取不同个体母猪血液中rna，用三唑仑试剂(invitrogen)纯化rna，得到总rna；
(2)引物设计：根据待分析目标基因分别设计候选基因circ-tcp1的qpcr引物circ-tcp1；
(3)反转录合成第一链cdna：使用反转录试剂盒对反转录步骤(1)得到的总rna，合成第一链cdna；
(4)采用q-rt-pcr方法测定候选基因circ-tcp1在母猪血液中的相对表达量；
(5)根据circ-tcp1在血液中的表达量，判断不同母猪个体之间产仔能力相对高低；
其中，引物circ-tcp1的上游序列为：gggaccttaaacgcattgcta，下游序列为：ggtccagtttttcagggtctgt；产物长度147bp；
步骤(3)中反转录的具体操作为：将总rna样品用epicenterribo-zerorrna去除试剂盒去除核糖体rna，然后用二价阳离子在94℃孵育8分钟，将核糖体缺失的rna碎片化为150-200℃，将切割后的rna片段用end-itdnaendrepairkit处理cdna以修复末端，然后用klenow修饰以在3'末端添加a，最后连接到索引的衔接子上；纯化连接的cdna产物并用尿嘧啶dna糖基化酶处理以除去第二链cdna；通过13-16个pcr扩增循环富集纯化的第一链cdna；
步骤(4)所述q-rt-pcr方法中反应过程为：95℃30秒，然后95℃5秒，60℃30秒，40个循环，70℃10分钟伸长；
本实施中对200头大白母猪进行circ-tcp1标记，区别出血液中circ-tcp1表达量高低的母猪，以相同品种、体质的公猪为种公猪进行交配，在相同条件下进行培育，采用sas8.0统计软件的glm程序，分别对猪的产仔数性状进行了关联分析，结果如表2所示：
表2
注：p*＜0.05；
实施例3
本实施例提供标记基因circ-tcp1对mir-183调控在母猪产仔能力判断方面的应用；所述circ-tcp1基因与mir-183的表达呈反向相关；所述circ-tcp1与母猪产仔能力呈负相关，mir-183与母猪产仔能力呈正相关；
本实施例提供的应用，该应用通过分析mir-183表达水平判断母猪产仔能力大小；
该应用方法具体包括如下步骤：
(1)组织rna提取：提取不同个体母猪卵巢中rna，用三唑仑试剂(invitrogen)纯化rna，得到总rna；
(2)引物设计：根据待分析目标基因分别设计候选基因mir-183的qpcr引物β-actin；
(3)反转录合成第一链cdna：使用反转录试剂盒对反转录步骤(1)得到的总rna，合成第一链cdna；
(4)采用q-rt-pcr方法测定候选基因mir-183在母猪卵巢中的相对表达量；
(5)根据mir-183在卵巢中的表达量，判断不同母猪个体之间产仔能力相对高低；
其中，引物β-actin的上游序列为ggacttcgagcaggagatgg；下游序列：aggaaggagggctggaagag；产物长度134bp；
步骤(3)中反转录的具体操作为：将总rna样品用epicenterribo-zerorrna去除试剂盒去除核糖体rna，然后用二价阳离子在94℃孵育8分钟，将核糖体缺失的rna碎片化为150-200℃，将切割后的rna片段用end-itdnaendrepairkit处理cdna以修复末端，然后用klenow修饰以在3'末端添加a，最后连接到索引的衔接子上；纯化连接的cdna产物并用尿嘧啶dna糖基化酶处理以除去第二链cdna；通过13-16个pcr扩增循环富集纯化的第一链cdna；
步骤(4)所述q-rt-pcr方法中反应过程为：95℃30秒，然后95℃5秒，60℃30秒，40个循环，70℃10分钟伸长。
本实施中对200头长白母猪进行mir-183标记，区别出卵巢中mir-183表达量高低的母猪，以相同品种、体质的公猪为种公猪进行交配，在相同条件下进行培育，采用sas8.0统计软件的glm程序，分别对猪的产仔数性状进行了关联分析，结果如表3所示：
表3
注：p*＜0.05；
实施例4
本实施例提供标记基因circ-tcp1对mir-183调控在母猪产仔能力判断方面的应用；所述circ-tcp1基因与mir-183的表达呈反向相关；所述circ-tcp1与母猪产仔能力呈负相关，mir-183与母猪产仔能力呈正相关；
本实施例提供的应用，该应用通过分析circ-tcp1和mir-183表达水平在母猪产仔能力判断方面的应用；
该应用方法具体包括如下步骤：
(1)组织rna提取：提取不同个体母猪卵巢中rna，用三唑仑试剂(invitrogen)纯化rna，得到总rna；
(2)引物设计：根据待分析目标基因分别设计候选基因circ-tcp1的qpcr引物circ-tcp1、mir-183的qpcr引物β-actin；
(3)反转录合成第一链cdna：使用反转录试剂盒对反转录步骤(1)得到的总rna，合成第一链cdna；
(4)采用q-rt-pcr方法测定候选基因circ-tcp1、mir-183在母猪卵巢中的相对表达量；
(5)根据circ-tcp1在卵巢和血液中的表达量，mir-183在卵巢中的表达量，判断不同母猪个体之间产仔能力相对高低；
其中，引物circ-tcp1的上游序列为：gggaccttaaacgcattgcta，下游序列为：ggtccagtttttcagggtctgt；产物长度147bp；
引物β-actin的上游序列为ggacttcgagcaggagatgg；下游序列：aggaaggagggctggaagag；产物长度134bp；
步骤(3)中反转录的具体操作为：将总rna样品用epicenterribo-zerorrna去除试剂盒去除核糖体rna，然后用二价阳离子在94℃孵育8分钟，将核糖体缺失的rna碎片化为150-200℃，将切割后的rna片段用end-itdnaendrepairkit处理cdna以修复末端，然后用klenow修饰以在3'末端添加a，最后连接到索引的衔接子上；纯化连接的cdna产物并用尿嘧啶dna糖基化酶处理以除去第二链cdna；通过13-16个pcr扩增循环富集纯化的第一链cdna；
步骤(4)所述q-rt-pcr方法中反应过程为：95℃30秒，然后95℃5秒，60℃30秒，40个循环，70℃10分钟伸长；
本实施中对100头母猪进行mir-183标记，选择卵巢中mir-183表达量高、circ-tcp1表达量低的母猪为种母猪，以相同品种、体质的公猪为种公猪进行交配，在相同条件下进行培育，其产仔数为6-8头。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在没有背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同腰间的含义和范围内的所有变化囊括在本发明的保护范围之内。