一种特异性结合哌替啶的核酸适配体及其应用的制作方法

本发明涉及生物
技术领域：
，尤其涉及一种特异性结合哌替啶的核酸适配体及其应用。
背景技术：
：哌替啶别名：地美露，杜冷丁，度冷丁，唛啶，美吡利啶，利多尔，吡利啶，唛啶利多尔等，外文名：pethidine；alodan,；dolantin；demerol；lydol；mepadin；meperidine等，其分子式为c15h21no2，其分子结构如下所示：哌替啶是人工合成的阿片受体激动剂，属于苯基哌啶衍生物，是一种常应用于临床的合成镇痛药。哌替啶具有与吗啡类似的性质，其作用机理与吗啡相似，药理作用和临床应用与吗啡相同，但镇静、麻醉作用较小，仅相当于吗啡的1/10—1/8，作用时间可维持2—4小时左右，主要作用于中枢神经系统，对心血管、平滑肌亦有一定影响，毒副作用也相应较小，恶心、呕吐、便秘等症状均较轻微，对呼吸系统的抑制作用较弱，一般不会出现呼吸困难及过量使用等问题。哌替啶反复作用可成瘾，连续使用1-2周便可产生药物依赖性，不良反应与吗啡相似，被列为严格管制的麻醉药品。1987年国务院发布的《麻醉药品管理办法》将哌替啶列入其中进行严格管理。所以无论从其药理作用、成瘾性，对人体的危害，还是从法律文件规定上讲，哌替啶是一种毒品。目前哌替啶等毒品的检测方法有很多种，例如：免疫筛选法；气相色谱法，高效液相色谱等方法，色谱的方法虽然检测的灵敏度较高，检测结果准确，但是需要昂贵的仪器设备，对检测材料的要求很高，需要提纯处理等，无法实现快速便捷的检测。目前的免疫筛选法都是依赖于抗体做的检测试剂盒，虽然有一些可以做到快速简单的检测，但是抗体制备过程比较复杂，批次之间有差异，也有一定的缺陷。核酸适配体(aptamer)是指通过指数富集的配基系统进化技术(selex)筛选分离得到的dna或者rna分子，它可以与其他靶标如蛋白质、金属离子、小分子、多肽甚至整个细胞进行高亲和力和特异性的结合，因此在生化分析，环境监测，基础医学，新药合成等方面展示广阔的前景。核酸适配体与抗体相比分子量小，稳定性更好，易改造修饰，无免疫原性，制作周期短，可以通过人工合成等优势，免去了动物免疫、饲养、蛋白提取和纯化等一系列流程，因此核酸适配体是一种非常理想的分子探针。基于selex的方法，筛选出结合特定小分子的核酸适配体，并将该核酸适配体用于小分子的检测，目前也被广泛研究。针对于哌替啶的核酸适配体还没有人公布，因此，本领域对针对哌替啶有高结合亲和力的核酸适配体存在需求。技术实现要素：基于
背景技术：
存在的技术问题，本发明提出了一种特异性结合哌替啶的核酸适配体及其应用，本发明能与哌替啶特异性结合，且化学性质稳定，易于保存、易于标记。本发明提出的一种特异性结合哌替啶的核酸适配体，所述核酸适配体序列包含以下四种核苷酸序列中的至少一种：a、如seqidno.1所示的dna序列；b、与seqidno.1所示dna序列具有60％以上同源性的dna序列；c、在严格条件下与seqidno.1所示dna序列杂交的dna序列；d、由seqidno.1所示dna序列转录的rna序列；其中，上述四种核苷酸序列均能够特异性结合哌替啶。优选地，上述与seqidno.1所示dna序列具有同源性，且能够特异性结合哌替啶的dna序列，其同源性可以为60％以上、70％以上、80％以上、85％以上、90％以上、95％以上或99％以上。发明人采用磁珠法，采用小分子竞争结合的方法筛选特异性结合哌替啶的核酸适配体，具体过程参见图1，图1为磁珠法筛选流程图：采用起始文库(ssdnalibrary)通过其正向引物区的序列与连接有biotin的正向引物互补序列(biotincaptureoligonucleotide)配对，然后biotin可以与链霉亲和素磁珠(streptavidin-beads)结合，从而将起始文库固定在磁珠上。接着与靶标哌替啶(meperidine)孵育，哌替啶会与有亲和力的序列结合，从而将其从biotin修饰的正向引物互补序列上竞争下来，该步骤即为洗脱步骤，获得的能与哌替啶结合的文库溶液(elution)，再经pcr扩增、提纯、电泳制备单链等处理获得次级文库，以次级文库作为下一轮筛选的起始文库进行多轮筛选，具体共计筛选六轮获得特异性结合哌替啶的核酸适配体，简称其为meperidine-17，其序列为：5’-ggcactccacgcataggatggtttaaccagccgtgtgcgtggatgtgttcggcagctcc-3’。优选地，所述核酸适配体序列被修饰，所述修饰包括磷酸化、甲基化、氨基化、巯基化、用硫取代氧、用硒取代氧或同位素化。优选地，所述核酸适配体序列上连接荧光标记物、放射性物质、治疗性物质、生物素、地高辛、纳米发光材料、小肽、sirna或酶。以上经修饰或连接处理后的核酸适配体，都具有与原核酸适配体基本相同或类似的分子结构、理化性质和功能，都可应用于与哌替啶的结合；经修饰或连接处理后的核酸适配体可以保持或提高核酸适配体与哌替啶的亲和力，或可以提高核酸适配体的稳定性。本发明还提出了一种核酸适配体衍生物，所述核酸适配体衍生物是由上述核酸适配体序列的骨架衍生出的硫代磷酸酯骨架序列，或者是由上述核酸适配体改造成的肽核酸。上述核酸适配体衍生物与原核酸适配体具有基本相同或类似的分子结构、理化性质和功能。硫代磷酸酯骨架序列修饰是最简单和广泛使用的可应用于增加核酸酶抗性的化学修饰，未经修饰的核酸适配体可以显示活性，但他们会被核酸酶迅速降解，因此作用有限。在寡核苷酸的磷酸酯骨架上，硫代磷酸酯键用硫原子取代了非桥键氧原子，使得核苷酸间键抵抗核酸酶的降解从而更稳定。肽核酸(peptidenucleicacids，pna)是一类以多肽骨架取代糖磷酸主链的dna类似物，以中性的肽链酰胺2-氨基乙基甘氨酸键取代了dna中的戊糖磷酸二酯键骨架，其余的与dna相同。pna可以通过watson-crick碱基配对的形式识别并结合dna或rna序列，形成稳定的双螺旋结构，有很高的杂交稳定性、优良的特异序列识别能力、不被核酸酶和蛋白酶水解，并可以与配基相连共转染进入细胞。上述硫代磷酸酯骨架序列和肽核酸可用核酸适配体按照本领域常规方法制得。本发明还提出了上述核酸适配体或上述核酸适配体衍生物在制备检测哌替啶的试剂盒或检测哌替啶的分子探针中的应用。可以用上述核酸适配体或上述核酸适配体衍生物来检测受试者血液、尿液、毛发中的哌替啶的含量。发明人使用磁珠法，采用小分子竞争结合的方法，通过六轮的筛选获得了一个特异性结合哌替啶的核酸适配体meperidine-17，其具有高度特异性，能与哌替啶特异性结合，且化学性质稳定，易于保存、易于标记；基于核酸适配体meperidine-17对哌替啶的亲和力和特异性，可以用核酸适配体meperidine-17制备试剂盒或分子探针用于识别、检测哌替啶。附图说明图1为磁珠法筛选流程图。图2为核酸适配体与哌替啶利用evagreen染料检测亲和力的荧光检测结果图，其中，a8为对照组，meperidine-17为试验组，初始荧光为空白组。图3为核酸适配体与哌替啶亲和力的等温滴定微量热检测结果图，其中，a为核酸适配体meperidine-17，b为序列a8。具体实施方式下面，通过具体实施例对本发明的技术方案进行详细说明。以下实施例中所述实验方法如无特殊说明，均为常规方法；所用的实验材料如无特殊说明，均为常规生化试剂，可通过商业途径购买得到。实施例1特异性结合哌替啶的核酸适配体的筛选1.合成以下序列所示的随机单链dna文库和引物：随机单链dna文库：5’-attggcactccacgcatagg-40n-cctatgcgtgctaccgtgaa-3’，其中，“40n”表示40个任意的核苷酸碱基连接而成的序列，该文库由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，引物信息如表1所示，表1引物及其序列备注：①在引物名称中，s1为正向引物，a2为反向引物，s1-fam为荧光标记的正向引物，a2-ploya为连接有polya尾的反向引物，polya为由19个腺苷酸(a)组成的polya尾，s1cs为正向引物的互补配对序列；②在引物序列中，“spacer18”为18原子的六乙二醇间臂。“spacer18”有三种结构式，如式i-iii所示，上述a2-ploya引物中的“spacer18”结构式如式i所示；“biotin”为生物素。引物分别用dpbs缓冲液(nacl：8g/l，kcl：0.2g/l，na2hpo4：1.15g/l，kh2ph4：0.2g/l，cacl2：0.1g/l，mgcl2·6h2o：0.1g/l；ph7.4)配制成引物浓度为100μm的贮存液，依次记为s1贮存液、s1-fam贮存液、a2贮存液、a2-ploya贮存液、s1cs贮存液，于-20℃保存备用；2.磁珠法筛选2.1制备溶液a：以随机单链dna文库为起始文库，取随机单链dna文库干粉用12000rpm离心10min，加入260μldpbs缓冲液，将随机单链dna文库稀释至浓度为5μm，涡旋混匀，然后12000rpm离心5min；然后加入29μls1cs贮存液，使s1cs引物终浓度为约10μm，充分混匀后14000rpm离心2min得到溶液a；2.2文库与引物配对：将溶液a分装到pcr管中，使用pcr仪进行配对得到溶液b，取少许溶液b于260nm紫外测定其浓度为c1，其中，配对程序为：95℃保持10min，以0.1℃/s的速度降温到60℃，保持1min，再以0.1℃/s的速度降温至25℃；2.3清洗磁珠：吸取1ml链霉亲和素磁珠(invitrogen,dynabeadstmmyonetmcarboxylicacid，货号：65001)，用dpbs缓冲液清洗磁珠6次，每次体积为1ml(最后一遍清洗时将磁珠暂时保存于少量dpbs缓冲液中，防止磁珠干燥)，用强磁铁回收磁珠得到清洗后磁珠；2.4固定：将溶液b加入清洗后磁珠中混匀，于室温旋转仪上摇晃40min，磁铁垂钓磁珠得到磁珠a，回收上清得到上清c，取少许上清c于260nm紫外测定其浓度为c2，计算文库偶联到磁珠上的效率即文库固定效率，文库固定效率＝(c1-c2)/c1*100％；其中，第一轮文库固定效率大于50％时，继续进行2.5以后的操作，之后每一轮文库固定效率大于80％时，继续进行2.5以后的操作；2.5文库的洗涤：用漂洗缓冲液(含有2％v/v甲醇的dpbs缓冲液)对磁珠a漂洗4次，每次用量相同均为400μl，每次漂洗均换新的ep管，磁珠悬浮后，室温静置2min，然后强磁铁吸附磁珠；紧接着加入400μl漂洗缓冲液，磁珠悬浮后，摇床孵育20min，然后强磁铁吸附磁珠得到磁珠b；其中，从第二轮筛选开始每次漂洗缓冲液的用量均为200μl；2.6靶标洗脱：取浓度为5mm的溶解于甲醇中的哌替啶溶液4μl加入到196μl的dpbs缓冲液中混匀得到溶液d，将溶液d加到磁珠b中，摇床孵育45min，磁铁垂钓磁珠，回收上清到ep管中，此上清记为elution；3.次级文库制备3.1pcr扩增：以elution中的核酸分子为模板，用乳浊液pcr(epcr)进行扩增得到epcr产物，方法如下：将全部elution加入2mlpcrmix中混匀，加入4倍体积的epcr微液滴生成油，涡旋震荡2min得到乳浊液；将乳浊液分装到pcr管中扩增，100μl/管，扩增条件为：95℃预变性2min，95℃变性60s，60℃退火60s，72℃延伸60s，共30个循环，4℃保存；其中，epcr微液滴生成油购自安徽省昂普拓迈(aptamy)生物科技有限公司(货号：epo100)；pcrmix的配方见表2；表2pcrmix的配方3.2扩增产物用正丁醇浓缩：收集所有的epcr产物于15ml尖底离心管中，加入2倍体积的正丁醇，在旋涡混合器上震荡以充分混匀；9000rpm室温离心10min；移弃上相(正丁醇)，得到浓缩的epcr产物。3.3制备单链：将浓缩的epcr产物按体积比1：1加入tbe/尿素变性缓冲液(安徽省昂普拓迈生物科技有限公司，货号：tlb-5)中，煮沸变性15min使dna变性，随后冰浴1min，将所有的样品进行尿素变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，于400v电泳至溴酚蓝到达胶底部，使加长的fam标记的单链dna与带有polya的单链dna分开，7m尿素变性聚丙烯酰胺凝胶配方如表3；表3尿素变性聚丙烯酰胺凝胶配方成分用量尿素3.78g40％聚丙烯酰胺1.8ml5*tbe1.8mlddh2o2.25ml10％aps60μltemed15μl3.4切胶回收fam标记的单链dna：将凝胶取出放在塑料膜上，ex(nm)：495，em(nm)：517条件下检测fam标记的单链dna；用干净的刀片将目的条带直接切下，将胶条转移至1.5mlep管中并捣碎，加入1mlddh2o后沸水浴10min将胶中的fam标记的单链dna会转移到溶液中，12000rpm离心2min，回收上清，转移到15ml的离心管中，再次取1ml超纯水至碎胶中，重复煮沸离心一次，将上清全部转移至同一15ml离心管中；向15ml离心管中，加12ml正丁醇，上下颠倒混匀，9000rpm离心5min，溶液出现分层，吸除上层液，回收下层液；将下层液用3.5kd的透析袋于4℃透析过夜得到次级文库；4.多轮筛选：以次级文库作为下一轮筛选的起始文库重复2-3的操作，共重复6轮筛选；从第二轮筛选开始，2.1的溶液a中起始文库的浓度为350nm，s1cs的浓度为700nm，2.3中链霉亲和素磁珠的用量为70μl；第6轮筛选结束后，将所得次级文库经高通量测序分析后，挑选若干条序列由上海生工合成，检测其与哌替啶的亲和力，最终确定了1条与哌替啶具有很强的结合能力的序列，简称为meperidine-17，即为特异性结合哌替啶的核酸适配体，其序列为：5’-ggcactccacgcataggatggtttaaccagccgtgtgcgtggatgtgttcggcagctcc-3’。上述筛选方法中，可逐轮增加筛选压力，以增进筛选核酸适配体的富集程度，缩短筛选进程；所述增加筛选压力包括减少投入的起始文库的量、哌替啶和磁珠b孵育时间，增加步骤2.5中的清洗时间和清洗次数。实施例2用酶标仪检测meperidine-17与哌替啶的亲和力溶液配制：试验液：取上海生工合成的核酸适配体meperidine-17用dpbs缓冲液稀释，然后加入evagreen染料混匀，其中，核酸适配体meperidine-17的浓度为1μm，evagreen染料的体积分数为1％。对照液：取序列a8用dpbs缓冲液稀释，然后加入evagreen染料混匀，其中，序列a8的浓度为1μm，evagreen染料的体积分数为1％。哌替啶溶液：取浓度为50mm哌替啶甲醇溶液，用dpbs缓冲液稀释至哌替啶浓度为10μm。空白溶液：取甲醇用dpbs缓冲液稀释5000倍，其中含有evagreen染料，evagreen染料的体积分数为1％的。操作：将试验液分装到孔板中，每孔100μl，共分装6个孔，其中，3个孔加入5μl哌替啶溶液作为试验组①，3个孔加入10μl哌替啶溶液作为试验组②；将对照液分装到孔板中，每孔100μl，共分装6个孔，其中，3个孔加入5μl哌替啶溶液作为对照组①，3个孔加入10μl哌替啶溶液作为对照组②；另取1个孔加入100μl空白溶液作为空白组。用酶标仪检测试验组①、试验组②、对照组①、对照组②、空白组的荧光信号强度，检测参数为ex475/20nm，em500-550nm，统计检测结果的平均值，检测结果参见图2，图2为核酸适配体与哌替啶利用evagreen染料检测亲和力的荧光检测结果图，其中，a8为对照组，meperidine-17为试验组，初始荧光为空白组，荧光(5μl组)为试验组①、对照组①，荧光(10μl组)为试验组②、对照组②。evagreen染料可以与dna的双链区域结合，如果哌替啶结合核酸适配体后，会造成核酸适配体的构象发生一些变化，使双链区增多或者双链因被打开而减少，反应出的就是evagreen染料的荧光信号的变强或者变弱。由图2可看出meperidine-17与哌替啶孵育后，显著降低了evagreen的荧光信号，说明二者可以相互作用，亲和力好。实施例3等温滴定微量热仪(itc)检测meperidine-17和哌替啶的亲和力溶液配制：试验溶液：取上海生工合成的核酸适配体meperidine-17用dpbs缓冲液稀释至浓度为10μm得到中间溶液，取中间溶液200μl与192μldpbs缓冲液、8μl甲醇匀得到试验溶液，其中，核酸适配体meperidine-17的浓度为5μm。对照溶液：取序列a8用dpbs缓冲液稀释至浓度为10μm得到中间溶液，取中间溶液200μl与192μldpbs缓冲液、8μl甲醇匀得到对照溶液，其中，随机序列a8的浓度为5μm。哌替啶溶液：取浓度为5mm的哌替啶甲醇溶液2μl加入到98μl的dbps缓冲液中混匀即得，其中，哌替啶的浓度为100μm即得。用哌替啶溶液分别滴定试验溶液、对照溶液，并检测滴定过程中热量的变化情况，使用的仪器为美国ge公司的itc200，实验结果参见图3，图3为核酸适配体与哌替啶亲和力的等温滴定微量热检测结果图，其中，a为核酸适配体meperidine-17，b为序列a8。由图3可以看出核酸适配体meperidine-17与哌替啶的滴定过程有热量的释放，核酸适配体meperidine-17能与哌替啶结合，其kd值为2.73μm，而序列a8与哌替啶没有结合。以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本
技术领域：
的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。序列表<110>安徽省昂普拓迈生物科技有限责任公司<120>一种特异性结合哌替啶的核酸适配体及其应用<130>2019<160>1<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>59<212>dna<213>人工合成()<400>1ggcactccacgcataggatggtttaaccagccgtgtgcgtggatgtgttcggcagctcc59当前第1页12