II类V型CRISPR蛋白CeCas12a及其在基因编辑的应用的制作方法

本发明属于生物医学领域，具体涉及一种来自于coprococcuseutactus细菌中的ii类v型crispr蛋白cas12a，命名为cecas12a，在基因编辑中的应用。

背景技术：

自2013年以来，基因编辑技术取得了突破性进展，此项技术已经在基础科学研究、医药、临床、生物技术等许多领域引起了新的变革。除了具有代表性的cas9系统之外，cas12，又名cpf1，作为又一种被发现的具有基因编辑效应的crispr系统新成员，极大的扩大了基因编辑系统靶点的可编辑范围，相比于cas9系统，cas12a所具有的加工前提rna的功能，为其介导多基因编辑提供了相比与cas9系统更为便捷高效的编辑能力。除此之外，相比于cas9的向导rna，cas12a的向导rna组成更为简单，设计更为方便。

2015年，张峰团队首次发现了cas9系统之外的另外一种具有基因编辑能力的新成员，cas12a，又名cpf1，将其划分到crispr系统2类v型中。相比于cas9系统，cas12a的编辑效率与cas9的效率相当，在有些靶点低于cas9。cas12a的脱靶率极低，相比于cas9脱靶率高的特性，cas12a是一种安全的基因编辑工具。cas12a在切割之后形成粘性末端，而cas9形成平末端，已有研究表明，cas12a切割之后的粘性末端相比于cas9的平末端而言，更容易发生同源重组修复，这也为基因的定点插入和修复提供了更好的工具。在向导rna的加工方面，cas12a具有明显的优势，仅仅只需要cas12a本身就能够完成对前提rna的加工，而cas9系统则需要rnaseiii的加工，这极大地促进cas12a在多基因编辑上的应用。在pam的识别上，cas12a识别5’-tttn-3’或5’-kytv-3’，cas9则识别5’-ngg-3’。

因此，cas12a作为一种新型基因编辑工具，与cas9系统一道，为科学研究和疾病的治疗提供了有力的工具。基于对目前已有的cas12a的研究，为应对将来各种情况下的基因编辑事件，发现更多的具有一定特性的cas12a是一件具有重要意义的事情。

技术实现要素：

本发明针对现有技术的不足，目的在于提供一种来自于coprococcuseutactus细菌中的ii类v型crispr蛋白cecas12a及其在基因编辑中的应用。

为实现上述发明目的，本发明所采用的技术方案为：

一种来自于coprococcuseutactus细菌中的ii类v型crispr蛋白cecas12a，其氨基酸序列如seqidno.1所示。

上述方案中，所述cecas12a识别的pam序列为tttv、tcta、ttca、或ctta，更为优选的pam序列为tttv，所述v表示a、c、或g。

用于编辑蛋白cecas12a氨基酸序列的基因，其核苷酸序列如seqidno.2所示。

上述cecas12a在基因编辑中的应用。

上述cecas12a在原核生物基因编辑中的应用。

上述cecas12a在真核生物基因编辑中的应用。

上述cecas12a在体外基因编辑中的应用。

本发明所述蛋白cecas12a的氨基酸序列如下：

(1)原核细胞中：

nnntnnsfepfiggnsvsktlrnelrvgseytgkhikecaiiaedavkaenqyivkemmddfyrdfinrkldalqginweqlfdimkkakldksnkvskeldkiqestrkeivkifssdpiykdmlkadmiskilpeyivdkygdaasrieavkvfygfsgyfidfwasrknvfsdkniasaiphrivnvnarihldnitafnriaeiagdevagiaedacaylqnmsledvftgacygeficqkdidrynnicgvinqhmnqycqnkkisrskfkmerlhkqilcrsesgfeipigfqtdgevidainsfstileekdildrlrtlsqevtgydmeriyvsskafesvskyidhkwdviassmynyfsgavrgkddkkdakiqteikkikscslldlkklvdmyykmdgmcleheateyvagiteilvdfnyktfdmddsvkmiqnehmineikeyldtymsiyhwakdfmidelvdrdmefyseldeiyydlsdivplynkvrnyvtqkpysqdkiklnfgsptlangwskskefdnnvvvllrdekiylailnvgnkpskdimagedrrrsdtdykkmnyyllpgasktlphvfissnawkkshgipdeimygynqnkhlksspnfdlefcrklidyykecidsypnyqifnfkfaatetyndisefykdverqgykiewsyiseddinqmdrdgqiylfqiynkdfapnskgmqnlhtlylknifseenlsdvviklngeaelffrkssiqhkrghkkgsvlvnktykttektengqgeieviesvpdqcylelvkywseggvgqlseeaskykdkvshyaatmdivkdrrytedkffihmpitinfkadnrnnvnekvlkfiaenddlhvigidrgernllyvsvidsrgriveqksfnivenyessknvirrhdykgklvnkehyrnearkswkeigkikeikegylsqviheisklvlkynaiivmedlnygfkrgrfkverqvyqkfetmlinklaylvdksravdepggllkgyqltyvpdnlgelgsqcgiifyvpaaytskidpvtgfvdvfdfkaysnaearldfinkldcirydasrnkfeiafdygnfrthhttlaktswtifihgdrikkergsygwkdeiidiearirklfedtdieyadghnligdinelespiqkkfvgelfdiirftvqlrnsksekydgtekeydkiispvmdeegvffttdsyiradgtelpkdadangaycialkglydvlavkkywkegekfdrkllaitnynwfdfiqnrrf

(2)真核细胞中：

pkkkrkvnnntnnsfepfiggnsvsktlrnelrvgseytgkhikecaiiaedavkaenqyivkemmddfyrdfinrkldalqginweqlfdimkkakldksnkvskeldkiqestrkeivkifssdpiykdmlkadmiskilpeyivdkygdaasrieavkvfygfsgyfidfwasrknvfsdkniasaiphrivnvnarihldnitafnriaeiagdevagiaedacaylqnmsledvftgacygeficqkdidrynnicgvinqhmnqycqnkkisrskfkmerlhkqilcrsesgfeipigfqtdgevidainsfstileekdildrlrtlsqevtgydmeriyvsskafesvskyidhkwdviassmynyfsgavrgkddkkdakiqteikkikscslldlkklvdmyykmdgmcleheateyvagiteilvdfnyktfdmddsvkmiqnehmineikeyldtymsiyhwakdfmidelvdrdmefyseldeiyydlsdivplynkvrnyvtqkpysqdkiklnfgsptlangwskskefdnnvvvllrdekiylailnvgnkpskdimagedrrrsdtdykkmnyyllpgasktlphvfissnawkkshgipdeimygynqnkhlksspnfdlefcrklidyykecidsypnyqifnfkfaatetyndisefykdverqgykiewsyiseddinqmdrdgqiylfqiynkdfapnskgmqnlhtlylknifseenlsdvviklngeaelffrkssiqhkrghkkgsvlvnktykttektengqgeieviesvpdqcylelvkywseggvgqlseeaskykdkvshyaatmdivkdrrytedkffihmpitinfkadnrnnvnekvlkfiaenddlhvigidrgernllyvsvidsrgriveqksfnivenyessknvirrhdykgklvnkehyrnearkswkeigkikeikegylsqviheisklvlkynaiivmedlnygfkrgrfkverqvyqkfetmlinklaylvdksravdepggllkgyqltyvpdnlgelgsqcgiifyvpaaytskidpvtgfvdvfdfkaysnaearldfinkldcirydasrnkfeiafdygnfrthhttlaktswtifihgdrikkergsygwkdeiidiearirklfedtdieyadghnligdinelespiqkkfvgelfdiirftvqlrnsksekydgtekeydkiispvmdeegvffttdsyiradgtelpkdadangaycialkglydvlavkkywkegekfdrkllaitnynwfdfiqnrrfkrpaatkkagqakkkkgsypydvpdyaypydvpdyaypydvpdya

其中在cecas12a蛋白氨基酸序列的n端加入pkkkrkv序列(该序列为n端nls入核序列)，在cecas12a蛋白氨基酸序列的c端加入krpaatkkagqakkkk序列(该序列为c端nls入核序列)，随后用gs序列连接ypydvpdyaypydvpdyaypydvpdya序列(该序列为3ha序列)。

编码本发明所述蛋白cecas12a的核苷酸序列如下：

aacaacaacaccaacaacagcttcgagcccttcatcggcggcaacagcgtgagcaagaccctgcgcaacgagctgcgcgtgggcagcgagtacaccggcaagcacatcaaggagtgcgccatcatcgccgaggacgccgtgaaggccgagaaccagtacatcgtgaaggagatgatggacgacttctaccgcgacttcatcaaccgcaagctggacgccctgcagggcatcaactgggagcagctgttcgacatcatgaagaaggccaagctggacaagagcaacaaggtgagcaaggagctggacaagatccaggagagcacccgcaaggagatcgtgaagatcttcagcagcgaccccatctacaaggacatgctgaaggccgacatgatcagcaagatcctgcccgagtacatcgtggacaagtacggcgacgccgccagccgcatcgaggccgtgaaggtgttctacggcttcagcggctacttcatcgacttctgggccagccgcaagaacgtgttcagcgacaagaacatcgccagcgccatcccccaccgcatcgtgaacgtgaacgcccgcatccacctggacaacatcaccgccttcaaccgcatcgccgagatcgccggcgacgaggtggccggcatcgccgaggacgcctgcgcctacctgcagaacatgagcctggaggacgtgttcaccggcgcctgctacggcgagttcatctgccagaaggacatcgaccgctacaacaacatctgcggcgtgatcaaccagcacatgaaccagtactgccagaacaagaagatcagccgcagcaagttcaagatggagcgcctgcacaagcagatcctgtgccgcagcgagagcggcttcgagatccccatcggcttccagaccgacggcgaggtgatcgacgccatcaacagcttcagcaccatcctggaggagaaggacatcctggaccgcctgcgcaccctgagccaggaggtgaccggctacgacatggagcgcatctacgtgagcagcaaggccttcgagagcgtgagcaagtacatcgaccacaagtgggacgtgatcgccagcagcatgtacaactacttcagcggcgccgtgcgcggcaaggacgacaagaaggacgccaagatccagaccgagatcaagaagatcaagagctgcagcctgctggacctgaagaagctggtggacatgtactacaagatggacggcatgtgcctggagcacgaggccaccgagtacgtggccggcatcaccgagatcctggtggacttcaactacaagaccttcgacatggacgacagcgtgaagatgatccagaacgagcacatgatcaacgagatcaaggagtacctggacacctacatgagcatctaccactgggccaaggacttcatgatcgacgagctggtggaccgcgacatggagttctacagcgagctggacgagatctactacgacctgagcgacatcgtgcccctgtacaacaaggtgcgcaactacgtgacccagaagccctacagccaggacaagatcaagctgaacttcggcagccccaccctggccaacggctggagcaagagcaaggagttcgacaacaacgtggtggtgctgctgcgcgacgagaagatctacctggccatcctgaacgtgggcaacaagcccagcaaggacatcatggccggcgaggaccgccgccgcagcgacaccgactacaagaagatgaactactacctgctgcccggcgccagcaagaccctgccccacgtgttcatcagcagcaacgcctggaagaagagccacggcatccccgacgagatcatgtacggctacaaccagaacaagcacctgaagagcagccccaacttcgacctggagttctgccgcaagctgatcgactactacaaggagtgcatcgacagctaccccaactaccagatcttcaacttcaagttcgccgccaccgagacctacaacgacatcagcgagttctacaaggacgtggagcgccagggctacaagatcgagtggagctacatcagcgaggacgacatcaaccagatggaccgcgacggccagatctacctgttccagatctacaacaaggacttcgcccccaacagcaagggcatgcagaacctgcacaccctgtacctgaagaacatcttcagcgaggagaacctgagcgacgtggtgatcaagctgaacggcgaggccgagctgttcttccgcaagagcagcatccagcacaagcgcggccacaagaagggcagcgtgctggtgaacaagacctacaagaccaccgagaagaccgagaacggccagggcgagatcgaggtgatcgagagcgtgcccgaccagtgctacctggagctggtgaagtactggagcgagggcggcgtgggccagctgagcgaggaggccagcaagtacaaggacaaggtgagccactacgccgccaccatggacatcgtgaaggaccgccgctacaccgaggacaagttcttcatccacatgcccatcaccatcaacttcaaggccgacaaccgcaacaacgtgaacgagaaggtgctgaagttcatcgccgagaacgacgacctgcacgtgatcggcatcgaccgcggcgagcgcaacctgctgtacgtgagcgtgatcgacagccgcggccgcatcgtggagcagaagagcttcaacatcgtggagaactacgagagcagcaagaacgtgatccgccgccacgactacaagggcaagctggtgaacaaggagcactaccgcaacgaggcccgcaagagctggaaggagatcggcaagatcaaggagatcaaggagggctacctgagccaggtgatccacgagatcagcaagctggtgctgaagtacaacgccatcatcgtgatggaggacctgaactacggcttcaagcgcggccgcttcaaggtggagcgccaggtgtaccagaagttcgagaccatgctgatcaacaagctggcctacctggtggacaagagccgcgccgtggacgagcccggcggcctgctgaagggctaccagctgacctacgtgcccgacaacctgggcgagctgggcagccagtgcggcatcatcttctacgtgcccgccgcctacaccagcaagatcgaccccgtgaccggcttcgtggacgtgttcgacttcaaggcctacagcaacgccgaggcccgcctggacttcatcaacaagctggactgcatccgctacgacgccagccgcaacaagttcgagatcgccttcgactacggcaacttccgcacccaccacaccaccctggccaagaccagctggaccatcttcatccacggcgaccgcatcaagaaggagcgcggcagctacggctggaaggacgagatcatcgacatcgaggcccgcatccgcaagctgttcgaggacaccgacatcgagtacgccgacggccacaacctgatcggcgacatcaacgagctggagagccccatccagaagaagttcgtgggcgagctgttcgacatcatccgcttcaccgtgcagctgcgcaacagcaagagcgagaagtacgacggcaccgagaaggagtacgacaagatcatcagccccgtgatggacgaggagggcgtgttcttcaccaccgacagctacatccgcgccgacggcaccgagctgcccaaggacgccgacgccaacggcgcctactgcatcgccctgaagggcctgtacgacgtgctggccgtgaagaagtactggaaggagggcgagaagttcgaccgcaagctgctggccatcaccaactacaactggttcgacttcatccagaaccgccgcttc

本发明中coprococcuseutactus菌株基因组中部分crisprarray如图2所示，基因组中黑体显示crisprarray序列为“atctacaacagtagaaattatctataggttcttgg”，因此，使用的crrnadirectrepeat序列为5’-aatttctactgttgtagat-3’。

本发明的有益效果：本发明首次在coprococcuseutactus菌株中鉴定出具有基因编辑效应的ii类v型crispr蛋白，命名为cecas12a；所述cecas12a能够在crrna的介导下定点对原核生物和真核生物基因组进行基因编辑，cecas12a的发现进一步扩大了基因编辑工具的种类，同时也为后续各种不同情况的基因编辑提供了重要的备选工具，对基础科研和临床治疗具有十分重要的作用。

附图说明

图1为coprococcuseutactus菌株crisprarray及crrnadirectrepeat图示。

图2为coprococcuseutactus菌株基因组中存在的部分crisprarray示意图。

图3为体外切割egfp片段靶点示意图。

图4为原核表达cecas12a之后，体外切割实验，s表示substrate；p表示product。

图5为体外实验验证cecas12a的pam，s表示substrate；p表示product。

图6为体内验证cecas12a基因编辑，s表示substrate；p表示product。

图7为体内验证cecas12a利用加工前提crrna来同时编辑多个基因。

图8为深度测序验证cecas12a的脱靶率。

具体实施方式

为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。

实施例1

cecas12a体外不同时间梯度切割实验，包括以下实验步骤：

(1)cecas12a蛋白的表达与纯化：将cecas12a基因序列合成到pet28a表达载体上，且在c末端加上6his标签，随后将合成好的质粒转化到e.colirosseta2(de3)表达菌株中，挑取单克隆，小量表达检测确定蛋白表达后进行蛋白的大量表达与纯化；重组蛋白依次经过ni柱亲和层析，heparin柱层析，superdex200分子筛纯化后，保存在buffer(10mmtris-hcl，200mmnacl，1mmmgcl)中，并冻存于-80℃备用；

(2)使用crrnadirectrepeat序列为：5’-aatttctactgttgtagat-3’，在体外转录获得crrna；将步骤(1)所得cecas12a蛋白与crrna混合得到cecas12a-crrna复合物；

(3)取100nmcecas12a-crrna复合物与300ng线性化的底物(图4所示)混匀，37℃孵育分别孵育0,1,2,5,10min后，加入适量蛋白酶k，58℃消化60min，跑2％琼脂糖胶，结果如图4所示，cecas12a具有良好的体外切割能力。

实施例2

cecas12a识别pam的确定

(1)设计nnnn四个位置随机组合的上下游引物(n表示a、g、c、t)，以egfp片段作为模板，采用overlappcr方法进行pcr，得到256种带有不同pam序列，但spacer序列一样的1.1kb的线性化底物；

(2)取100nmcecas12a-crrna复合物与300ng线性化的底物混匀，37℃孵育分别孵育10min后，加入适量蛋白酶k，58℃消化60min，跑2％琼脂糖胶，部分结果如图5所示，cecas12a能够识别不同的pam：ttta、tcta、ttca、ctta，但最优pam为tttv(v表示a,c,g)。

实施例3

cecas12a在哺乳动物细胞内不同基因的编辑：

(1)构建cecas12a真核表达质粒：将cecas12a基因序列合成到pet28a表达载体上构建cecas12a真核表达质粒；

(2)在哺乳动物细胞中，以293t细胞为例选择trac、trbc、b2m、ctla4、pd1五个基因，分别以这五个基因为目标，构建5个由u6启动子启动转录的u6-crrnaspacer真核表达质粒；

(3)分别针对这五个基因的切割靶点附近设计surveyorprimer，并验证pcr引物的特异性；

(4)消化293t细胞，适当浓度铺24孔板，每孔500ul；

(5)24孔板共转cecas12a真核表达质粒(700ng)和u6-crrnaspacer真核表达质粒(300ng)，48h后裂解细胞，取1ul裂解液作为模板、以步骤(3)设计的surveyorprimer引物进行pcr，纯化pcr产物；

(6)取300ngpcr产物与1ul10xt7eibuffer混匀，按以下pcr程序进行复性95℃10min，95℃至85℃-2℃/s，85℃到25℃-0.25℃/s，25℃持续1min，复性之后产物加入1ult7ei，37℃酶切20min，跑2％琼脂糖胶，结果如图6所示在trac、trbc、b2m、ctla4、pd1能够进行基因编辑，编辑效率分别为12％，18％，31％，26％，19％(本案例中的四个基因只是作为代表进行列举)。

实施例4

cecas12a在哺乳动物细胞内进行多基因编辑：

(1)选取并设计由一个u6启动子启动转录形成pre-crrnaarray，pre-crrna为同时包括trac、trbc、b2m、ctla4四个基因的crrna序列；

(2)切割靶点附近设计surveyorprimer，并验证pcr引物的特异性；

(3)消化293t细胞，适当浓度铺24孔板，每孔500ul；

(4)24孔板共转cecas12a真核表达质粒(700ng)和步骤(1)获得的包含trac、trbc、b2m、ctla4四个基因的u6-crrnaspacer真核表达质粒(300ng)，48h后裂解细胞，取1ul裂解液作为模板、以步骤(3)设计的surveyorprimer引物进行pcr，纯化pcr产物；

(5)取300ngpcr产物与1ul10xt7eibuffer混匀，按以下pcr程序进行复性95℃10min，95℃至85℃-2℃/s，85℃到25℃-0.25℃/s，25℃持续1min。

(6)复性之后产物加入1ult7ei，37℃酶切20min，跑2％琼脂糖胶，结果如图7所示，采用灰度分析可得对trac、trbc、b2m、ctla4四个基因靶点的切割效率分别为15％，25％，45％，45％。

实施例5

(1)选取dnmt1、hbb、il12a、polq、b2m5个基因5个靶点进行脱靶分析，用软件(http://www.rgenome.net/cas-offinder/)预测了41个脱靶位点，并设计相应引物。

(2)24孔板共转as/lb/cecas12a真核表达质粒(700ng)和u6-crrnaspacer真核表达质粒(300ng)，48h后裂解细胞，取1ul裂解液作为模板并采用1)中设计的引物进行扩增，然后纯化，进行二代测序，统计结构如图8所示，ascas12a，lbcas12a，cecas12a都具有很低的脱靶率，但cecas12a相比于ascas12a，lbcas12a具有更低的脱靶率。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的实例，而并非对实施方式的限制。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而因此所引申的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之内。

序列表

<110>武汉大学

<120>ii类v型crispr蛋白cecas12a及其用于基因编辑的应用

<160>2

<210>1

<211>1286

<212>prt

<213>coprococcuseutactus细菌

<400>1

asnasnasnthrasnasnserpheglupropheileglyglyasnser

151015

valserlysthrleuargasngluleuargvalglyserglutyrthr

202530

glylyshisilelysglucysalaileilealagluaspalavallys

354045

alagluasnglntyrilevallysglumetmetaspaspphetyrarg

505560

asppheileasnarglysleuaspalaleuglnglyileasntrpglu

65707580

glnleupheaspilemetlyslysalalysleuasplysserasnlys

859095

valserlysgluleuasplysileglngluserthrarglysgluile

100105110

vallysilepheserseraspproiletyrlysaspmetleulysala

115120125

aspmetileserlysileleuproglutyrilevalasplystyrgly

130135140

aspalaalaserargileglualavallysvalphetyrglypheser

145150155160

glytyrpheileaspphetrpalaserarglysasnvalpheserasp

165170175

lysasnilealaseralaileprohisargilevalasnvalasnala

180185190

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195200205

alaglyaspgluvalalaglyilealagluaspalacysalatyrleu

210215220

glnasnmetserleugluaspvalphethrglyalacystyrglyglu

225230235240

pheilecysglnlysaspileaspargtyrasnasnilecysglyval

245250255

ileasnglnhismetasnglntyrcysglnasnlyslysileserarg

260265270

serlysphelysmetgluargleuhislysglnileleucysargser

275280285

gluserglyphegluileproileglypheglnthraspglygluval

290295300

ileaspalaileasnserpheserthrileleugluglulysaspile

305310315320

leuaspargleuargthrleuserglngluvalthrglytyraspmet

325330335

gluargiletyrvalserserlysalaphegluservalserlystyr

340345350

ileasphislystrpaspvalilealasersermettyrasntyrphe

355360365

serglyalavalargglylysaspasplyslysaspalalysilegln

370375380

thrgluilelyslysilelyssercysserleuleuaspleulyslys

385390395400

leuvalaspmettyrtyrlysmetaspglymetcysleugluhisglu

405410415

alathrglutyrvalalaglyilethrgluileleuvalasppheasn

420425430

tyrlysthrpheaspmetaspaspservallysmetileglnasnglu

435440445

hismetileasngluilelysglutyrleuaspthrtyrmetserile

450455460

tyrhistrpalalysaspphemetileaspgluleuvalaspargasp

465470475480

metgluphetyrsergluleuaspgluiletyrtyraspleuserasp

485490495

ilevalproleutyrasnlysvalargasntyrvalthrglnlyspro

500505510

tyrserglnasplysilelysleuasnpheglyserprothrleuala

515520525

asnglytrpserlysserlysglupheaspasnasnvalvalvalleu

530535540

leuargaspglulysiletyrleualaileleuasnvalglyasnlys

545550555560

proserlysaspilemetalaglygluaspargargargseraspthr

565570575

asptyrlyslysmetasntyrtyrleuleuproglyalaserlysthr

580585590

leuprohisvalpheileserserasnalatrplyslysserhisgly

595600605

ileproaspgluilemettyrglytyrasnglnasnlyshisleulys

610615620

serserproasnpheaspleugluphecysarglysleuileasptyr

625630635640

tyrlysglucysileaspsertyrproasntyrglnilepheasnphe

645650655

lysphealaalathrgluthrtyrasnaspilesergluphetyrlys

660665670

aspvalgluargglnglytyrlysileglutrpsertyrileserglu

675680685

aspaspileasnglnmetaspargaspglyglniletyrleuphegln

690695700

iletyrasnlysaspphealaproasnserlysglymetglnasnleu

705710715720

histhrleutyrleulysasnilepheserglugluasnleuserasp

725730735

valvalilelysleuasnglyglualagluleuphephearglysser

740745750

serileglnhislysargglyhislyslysglyservalleuvalasn

755760765

lysthrtyrlysthrthrglulysthrgluasnglyglnglygluile

770775780

gluvalilegluservalproaspglncystyrleugluleuvallys

785790795800

tyrtrpsergluglyglyvalglyglnleusergluglualaserlys

805810815

tyrlysasplysvalserhistyralaalathrmetaspilevallys

820825830

aspargargtyrthrgluasplysphepheilehismetproilethr

835840845

ileasnphelysalaaspasnargasnasnvalasnglulysvalleu

850855860

lyspheilealagluasnaspaspleuhisvalileglyileasparg

865870875880

glygluargasnleuleutyrvalservalileaspserargglyarg

885890895

ilevalgluglnlysserpheasnilevalgluasntyrgluserser

900905910

lysasnvalileargarghisasptyrlysglylysleuvalasnlys

915920925

gluhistyrargasnglualaarglyssertrplysgluileglylys

930935940

ilelysgluilelysgluglytyrleuserglnvalilehisgluile

945950955960

serlysleuvalleulystyrasnalaileilevalmetgluaspleu

965970975

asntyrglyphelysargglyargphelysvalgluargglnvaltyr

980985990

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