一种牙髓干细胞的制备方法与流程

本发明属于细胞生物学干细胞培养
技术领域：
，具体涉及一种牙髓干细胞的制备方法。
背景技术：
：干细胞(stemcells，sc)是一类具有自我复制能力的多潜能细胞，是原始且未特化的细胞。在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞，具有再生各种组织器官和人体的潜在功能。干细胞的来源有很多，包括骨髓、脐带、脐带血、牙齿与脂肪。2000年首次发现了牙髓干细胞，gronthos等发现在离体的乳牙和智齿中都存在牙髓干细胞。这是一类具有高增殖能力、高度自我更新能力、多项分化能力的细胞。已有研究利用该细胞成功地构建牙髓、牙本质以及牙齿组织。牙髓干细胞(dentalpulpstemcell，dpsc)与其他组织来源的干细胞在生物学特性上有很多相似之处。gronthos等对牙髓干细胞的克隆形成率进行了研究，与骨髓基质干细胞(bonemarrowstromalcell，bmsc)比较后发现：牙齿来源的dpsc的克隆形成率明显高于骨髓来源的bmsc，这就表明dpsc具有较bmsc更高的增生能力和自我更新能力。miura等发现：从1颗脱落前牙取材的每12-20个细胞就可以形成黏附克隆集落，这是间质干细胞增殖的典型表现。牙髓干细胞属于多能成体干细胞，具有分化为神经细胞、成骨细胞、脂肪细胞和成软骨细胞的潜能。研究表明，牙髓干细胞能够用于牙本质、牙髓、牙体组织的修复和再生，还可用于颅骨、颌骨及面骨的损伤修复，牙髓干细胞在其他疾病方面的应用研究也很多。其具有来源丰富、取材安全方便、不涉及伦理学问题、免疫原性低等优点，在再生医学领域取得了很大进展，具有广阔的应用前景。目前对于牙髓组织的提取和培养过程，传统方法为组织块直接培养法和胶原酶消化培养法两种，但存在培养周期过长、细胞量较少、易导致分化以及消化不完全或消化过度等缺点。由于人体口腔中细菌和真菌的种类繁多、数量巨大，牙髓干细胞在制备过程中极易污染，通常会通过加大抗生素的用量或提高抗生素等级来降低污染几率，从而导致抗生素滥用。因此，在牙髓干细胞制备过程中防止抗生素滥用、提高分离牙髓干细胞的效率、缩短生长周期，是本领域亟待解决的问题。技术实现要素：为了克服现有技术的不足，本发明目的是提供一种牙髓干细胞的制备方法，该方法提高了牙髓干细胞的获得率，缩短细胞培养周期，保障细胞质量。为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案：本发明提供一种牙髓干细胞的制备方法，包括以下步骤：1)消毒；2)取牙髓，放入含有双抗的生理盐水(1000ui\ml链霉素+1000ui\ml青霉素+生理盐水)冲洗，剪成1mm3小块；3)组织消化：消化液使用0.1-0.5％胶原酶ⅰ+0.1-0.5％dispaseii+生理盐水，密封消化管口，恒温37±5℃，145-167rpm振荡消化15-30min；4)离心，弃上清，用生理盐水洗涤后，离心弃上清；5)培养：使用间充质干细胞培养基(5％血小板裂解物+95％基础培养基)37±5℃、5％二氧化碳培养。进一步地，步骤1)中，所述消毒是无菌操作，用75％的酒精将牙齿浸泡30s～2min，牙齿要完全浸没。更进一步地，步骤1)中，所述消毒还包括将酒精浸泡过的牙齿使用含有抗生素的生理盐水清洗3-5遍。更进一步地，所述抗生素为1000ui\ml链霉素+1000ui\ml青霉素。进一步地，步骤1)中，所述消毒还包括将洁净车间使用紫外线灯照射30min的步骤；还包括将牙齿储存瓶、灭菌手术器械盒、50ml离心管、75％医用酒精、生理盐水、培养皿用75％医用酒精消毒后放入生物安全柜内。进一步地，步骤2)中，所述取牙髓为将牙齿用无菌无尘布包裹，用台虎钳夹裂，用眼科镊取出牙髓。进一步地，步骤3)中，所述消化液成分终浓度为0.1％胶原酶ⅰ+0.1％dispaseii+生理盐水。进一步地，步骤4)中，所述离心为1000～1500r/min离心5～8min。进一步地，步骤5)中，所述培养为使用间充质干细胞培养基(5％血小板裂解物+95％基础培养基)重悬，重悬后的组织块均匀接种于培养皿，将培养皿放入37±5℃、5％二氧化碳培养箱培养。进一步地，步骤5)中，所述血小板裂解物成分如下所示：进一步地，步骤5)中，还包括补液的步骤，第二天补液(5％血小板裂解物+95％基础培养基)，以后每三天半换液一次，待细胞融合度达30％-60％进行传代。与现有技术相比，本发明能够有效获得牙髓干细胞的单细胞悬液，或者软化牙髓组织，更有利于牙髓干细胞爬出，很好的提高了牙髓干细胞的获得率，缩短细胞培养周期，保障细胞质量。附图说明图1为实施例1中原代牙髓干细胞培养图；图中，a为原代牙髓干细胞培养第3天；b为原代牙髓干细胞培养第8天；c为原代牙髓干细胞培养第10天；d为原代牙髓干细胞培养第15天；图2为效果试验例中原代培养第三天的牙髓干细胞；图中，a为对照方法制备所得牙髓干细胞；b为本方法制备所得牙髓干细胞。具体实施方式本发明所使用的间充质干细胞培养基包含5％血小板裂解物+95％基础培养基。其中，血小板裂解物成分如下表1。表1血小板裂解物成分项目浓度球蛋白globulin1.8g/dl白蛋白albumin3.3g/dl胆固醇cholesterol128mg/dl胆红素bilirubin0.2mg/dl葡萄糖glucose208mg/dl甘油三酯triglyceride80mg/dl肌酸磷酸激酶cpk159u/l肌酸酐creatinine0.92mg/dlγ-gt26u/l天门冬氨酸转移酶ast43u/l碳酸氢盐bicarbonate14.2meq/l钠sodium140meq/l磷phosphorus3.9mg/dl钙calcium61.5mg/dl镁magnesium2.1mg/dl钾potassium4.4meq/l氯化物chloride109meq/l铁iron64ug/dl基础培养基选用深圳市达科为生物工程有限公司生产的msc专用基础培养基(产品6115021)是专用于培养人间充质干细胞(mesenchymalstemcell)的基础培养基。本产品化学成分限定，不含异种动物成分，不含血清，需要添加血清或者血清替代物混合成完全培养基后使用。其组成成分包含：l-丙氨酸(l-alanine)、l-精氨酸hcl(l-argininehcl)、l-天冬酰胺h2o(l-asparagineh2o)、l-天冬氨酸(l-asparaticacid)、l-半胱氨酸hclh2o(l-cysteinehclh2o)、l-胱氨酸(l-cystine)、l-谷氨酸(l-glutamicacid)、l-谷氨酰胺(l-glutamine)、甘氨酸(glycine)、l-组氨酸hclh2o(l-histidinehclh2o)、l-异亮氨酸(l-isoleucine)、l-亮氨酸(l-leucine)、l-赖氨酸hcl(l-lysinehcl)、l-甲硫氨酸(l-methionine)、l-苯丙氨酸(l-phenylalanine)、l-脯氨酸(l-proline)、l-丝氨酸(l-serine)、l-苏氨酸(l-threonine)、l-色氨酸(l-tryptophan)、l-酪氨酸(l-tyrosine)、l-缬氨酸(l-valine)、(+)-l-抗坏血酸钠((+)-sodiuml-ascorbate)、叶酸(folicacid)、氯化钠(sodiumchloride)、磷酸二氢钠(sodiumdihydrogenphosphate)、碳酸氢钠(sodiumhydrogencarbonate)、d-葡萄糖(d-glucose)、硫辛酸(lipoicacid)、丙酮酸钠(sodiumpyruvate)。现结合附图与具体实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明并不仅限于以下的实施例。实施例1一种牙髓干细胞的制备方法，包括以下设备和步骤：1、仪器设备：生物安全柜、二氧化碳培养箱、电动移液器、离心机、恒温摇床。2、试剂耗材：灭菌手术器械、75％医用酒精、生理盐水、dispase酶、胶原酶、35mm培养皿、移液管(5ml、10ml)、培养基、50ml注射器、废液缸。3、操作步骤：1)打开洁净车间的紫外线灯照射30min以上，打开洁净区风机。2)将牙齿储存瓶接收至间充质干细胞制备室，检查储存瓶有无漏液现象，密封是否严实、有无裂横、标签是否完整、准确，牙齿资料是否完整并符合制备要求。然后用酒精纱布擦拭后将储存瓶放至正常运行的生物安全柜内。3)将灭菌手术器械盒、50ml离心管、75％医用酒精、生理盐水、培养皿等物品用75％医用酒精消毒后放入生物安全柜内。4)采集瓶无菌操作打开，将保存液倒入废液缸中，用75％的酒精将牙齿浸泡2min(牙齿要完全浸没)。5)将牙齿放入培养皿中，用含有抗生素的生理盐水清洗表面酒精3-5遍。将牙齿用无菌无尘布包裹，用台虎钳夹裂，用眼科镊取出牙髓，放入含有双抗的生理盐水(1000ui\ml链霉素+1000ui\ml青霉素+生理盐水)冲洗一遍后，转移入新的35mm培养皿中，用眼科剪剪成1mm3小块。6)将剪碎的组织块转移至2ml离心管，加入1ml消化液(0.1％胶原酶ⅰ+0.1％dispaseii+生理盐水)，密封管口，放入恒温摇床37℃，145rpm振荡消化15min。7)消化结束后，1500r/min离心5min，弃上清，加1ml生理盐水吹打洗涤后，1500r/min离心5min，弃上清，加0.5ml间充质干细胞培养基(5％血小板裂解物+95％基础培养基)重悬。重悬后的组织块均匀接种于35mm培养皿。8)将培养皿放入37℃、5％二氧化碳培养箱培养。9)第二天补液(5％血小板裂解物+95％基础培养基)0.5ml，以后每三天半换液一次，待细胞融合度达30％-60％进行传代。实验结果：见图1(a-d)所示，可见原代牙髓干细胞第3、8、10、15天情况，获得牙髓干细胞的起始数量多，细胞铺皿均匀，扩增状态良好，大大缩短了牙髓干细胞的培养时间和较好的维持了牙髓干细胞的干性。对比例1对照组制备方法操作步骤：1)打开洁净车间的紫外线灯照射30min以上，打开洁净区风机。2)将牙齿储存瓶接收至间充质干细胞制备室，检查储存瓶有无漏液现象，密封是否严实、有无裂横、标签是否完整、准确，牙齿资料是否完整并符合制备要求。然后用酒精纱布擦拭后将储存瓶放至正常运行的生物安全柜内。3)将灭菌手术器械盒、50ml离心管、75％医用酒精、生理盐水、培养皿等物品用75％医用酒精消毒后放入生物安全柜内。4)采集瓶无菌操作打开，将保存液倒入废液缸中，用75％的酒精将牙齿浸泡2min(牙齿要完全浸没)。5)将牙齿放入培养皿中，用含有抗生素的生理盐水清洗表面酒精3-5遍。将牙齿用无菌无尘布包裹，用台虎钳夹裂，用眼科镊取出牙髓，放入含有双抗的生理盐水(1000ui\ml链霉素+1000ui\ml青霉素+生理盐水)冲洗一遍后，转移入新的35mm培养皿中，用眼科剪剪成1mm3小块。6)将剪碎的组织块转移至2ml离心管，加入1ml消化液(0.1％胶原酶ⅰ+生理盐水)，密封管口，放入恒温摇床37℃，145rpm振荡消化15min。7)消化结束后，1500r/min离心5min，弃上清，加1ml生理盐水吹打洗涤后，1500r/min离心5min，弃上清，加0.5ml间充质干细胞培养基(5％血小板裂解物+95％基础培养基)重悬。重悬后的组织块均匀接种于35mm培养皿。8)将培养皿放入37℃、5％二氧化碳培养箱培养。9)第二天补液(5％血小板裂解物+95％基础培养基)0.5ml，以后每三天半换液一次，待细胞融合度达30％-60％进行传代。实验结果：对比例1与本方法实施例1分别制备所得牙髓干细胞第三天培养情况显示图，如图2a-2b所示，本发明方法牙髓组织消化的更彻底，干细胞得率更好，对细胞的增殖扩增、细胞形态和表型没有影响。本发明并不局限于上述实施方式，如果对本发明的各种改动或变型不脱离本发明的精神和范围，倘若这些改动和变型属于本发明的权利要求和等同技术范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变动。当前第1页1 2 3