本发明涉及固相多肽合成领域，具体涉及一种联肼尼克酰胺聚乙二醇双环五肽的制备工艺。
背景技术：
：rgd肽是一类含有精氨酸、甘氨酸、天冬氨酸(arg-gly-asp)的短肽,作为整合素和其配体相互作用的识别位点,能与肿瘤细胞或者新生血管特异表达的某些整合素如αvβ3结合。因此,这类受体可以作为肿瘤靶向治疗的靶点,利用外源rgd肽竞争结合整合素受体可以靶向标记定位肿瘤，达到更有效、精确和安全治疗的目的。目前已开发出一种新型的由精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-d-苯丙氨酸-赖氨酸五个氨基酸组成的环形五肽结构的二聚体，在二聚体间引入了甘氨酸、聚乙二醇(peg)结构增加药物的水溶性，改善了该化合物整体代谢动力学，同时也扩大了二聚体间距，能够更有效地结合整合素αvβ3。具体的该化合物的结构为双[四聚乙二醇酰-环(l-精氨酰-甘氨酰-l-天冬氨酰-d-苯丙氨酰-l-赖氨酰)]-l-谷氨酰-[(e)-2-((2-(5-四聚乙二醇酰吡啶-2-基)亚肼基)甲基)苯磺酸钠]，简称：联肼尼克酰胺聚乙二醇双环五肽。该项目执行过程中所建立的方法和理论，以及所搭建的放射性药物制备及评价平台，放射性同位素示踪技术及分子影像技术平台已在“重大新药创制”重大专项其他两个课题(2009zx09301-010，2009zx09103-746)，国家“973”项目(2011cb707703)，以及国家自然科学基金重点项目(30930030)中发挥了重要作用，目前已申请发明专利3项，其中1项已被授权，具体如下：1)一种rgd多肽放射性药物及其制备方法，专利号：zl200810239036x2)用于integrinαvβ3阳性肿瘤的rgd多肽放射性药物及其制备方法，专利申请号：200910077039.23)放射性核素标记的rgd多肽药物及其制备方法，专利申请号：200910077728.3在上述专利中首先合成步骤较长，专利中描述的具体步骤为：先将glu(boc)与hosu在dic存在将glu(boc)的两个羧基活化，制成glu(boc)(osu)2再与peg4-c(krgdf)发生二聚反应，获得glu(boc)[peg4-c(krgdf)]2；同样的方法将fmoc-peg4-oh的羧基用hosu、dic活化，制成fmoc-peg4-osu，再与脱去boc的glu[peg4-c(krgdf)]2偶联，获得fmoc-pge-glu[peg4-c(krgdf)]2；fmoc-pge4-glu[peg4-c(krgdf)]2脱去fmoc基团与hynic-nhs偶联得到终产品hynic-pge4-glu[peg4-c(krgdf)]2(联肼尼克酰胺聚乙二醇双环五肽)。其次所用peg4-c(krgdf)中精氨酸胍基上裸露的氨基没有保护，胍基碱性较强，可以与后面的活化酯反应引起一系列的副反应。技术实现要素：本发明的目的在于针对以上技术问题，提供一种合成路线简单、生产成本低、高收率、高纯度的联肼尼克酰胺聚乙二醇双环五肽的制备工艺本发明的技术方案如下：一种联肼尼克酰胺聚乙二醇双环五肽的制备工艺，反应方程式为：具体步骤为：1制备中间体5：将树脂与fmoc-glu-(x)主链上的羧基偶联，得到中间体5。r树脂可以是ctc树脂、wang树脂；x-为谷氨酸羧基的保护基团，可以是otbu、oall；2制备中间体4：使用固相合成法依次将r-glu-(x)树脂与fmoc-peg4、hynic偶联，得到中间体4。固相合成中使用的缩合剂为hobt/dic，hbtu/diea；3制备中间体3：将中间体4中的多肽链在强酸条件下从树脂上切割下来，同时脱去otbu基得到中间体3；将多肽在四(三苯基膦)钯存在下脱去oall基团，使用弱酸条件将肽链从树脂上切割下来，得到中间体3；4制备中间体2：将中间体3与hosu在dic存在下，活化肽链谷氨酸上的两个羧基，制成活化酯即中间体2；5制备目标化合物：将中间体2与peg4-c[kr(pbf)gdf]在diea存在下发生二聚，反应结束后，所得产品在cf3cooh条件下，切除pbf保护基，可以获得联肼尼克酰胺聚乙二醇双环五肽。本发明的有益效果是：本发明针对该化合物的结构，将该化合物直接拆分成两个片段，通过固相合成即可获得纯度较高的hynic-peg4-glu-oh片段，活化该片段中谷氨酸上的两个羧基，制成活化酯，即可与保护的peg4-c[kr(pbf)gdf]发生二聚，酸性切除pbf保护基团，即可获得目标化合物，比原工艺更加简洁，避免了分别偶联glu、peg4、hynic带来的繁琐的操作及后处理，使得昂贵的peg4-c[kr(pbf)gdf]得以充分利用。选择pbf保护的peg4-c[kr(pbf)gdf]为偶联的另一个片段，也使得接下来的偶联反应避免了精氨酸上的副反应，反应更加纯净。该工艺操作简单，易于今后的工业化生产。具体实施方式实施例1制备联肼尼克酰胺聚乙二醇双环五肽按照如下步骤操作：(1)中间体5的制备名称分子量比例投料量(g)ctc树脂(sub1.00mm/g)1.0010.00fmoc-glu(otbu)-oh425.483.0012.76diea129.2412.0015.51称取2-chlorotritylchlorideresin树脂10.00g10.00mmol(w克)(nmmol)，将树脂加入到反应器中，加入dmf充分洗涤、溶胀树脂。以2-chlorotritylchlorideresin树脂摩尔量n为基数，按一定投料比称量以下物料：fmoc-glu(otbu)-oh12.76g(3.0倍量)，用适量dmf溶解，加入到反应器中，加入diea15.51g(12.0倍量)，偶联反应2.0±0.5小时，dmf洗涤3次。用dcm/meoh/diea(3:1:1)封闭10分钟，重复1次。甲醇收缩，将该肽树脂真空干燥12小时以上，称量肽树脂的重量13.87g。检测该ctc-glu(otbu)的替代度为0.52mmol/g，n0mmol＝13.87*0.52＝7.21mmol。(2)中间体4的制备名称分子量比例投料量(g)ctc-glu(otbu)(sub0.52mmol/g)/1.0013.87fmoc-peg4-oh487.553.0010.55hobt135.133.002.92dic126.203.002.73hynic343.293.007.43hobt135.133.002.92dic126.203.002.73称取ctc-glu(otbu)13.87g7.21mmol(w0克)(n0mmol)，将树脂加入到反应器中，加入dmf洗涤树脂后，将20％dblk[20％哌啶/dmf(v/v)](用量3-4ml/克树脂)加入反应器中，反应10+10分钟，用dmf洗涤树脂。以ctc-glu(otbu)树脂摩尔量n0为基数，按一定投料比称量以下物料：fmoc-peg4-oh10.55g(3.0倍量)；hobt2.92g(3.0倍量)；用适量dmf溶解。冰浴下加入dic2.73g(3.0倍量)，活化反应3±1分钟后加入到反应器中。偶联反应2.0±0.1小时，用dmf洗涤4次。检测反应：取少量反应液，滴3-5滴茚三酮溶液，加热至沸腾；以dmf洗涤树脂颗粒，观察是否显色，以确定反应是否完全。重复上述操作将hynic偶联到树脂上。甲醇收缩，将该肽树脂真空干燥12小时以上，称量肽树脂的重量14.22g。(3)中间体3的制备裂解液配置：按10ml/g的比例，配置裂解液：(三氟乙酸:水＝95:5)乙醚/石油醚：根据100ml/g树脂的比例，其中乙醚：石油醚＝1:1v/v树脂称量：称取14.2gw(g)干燥的肽树脂，投入至裂解反应瓶中。在冰浴(0-5℃)条件下，缓慢加入配置的冰冻裂解液142ml，充分搅拌0.5小时，撤去冰浴。室温(20-30℃)下充分搅拌树脂,反应1.5～2.0小时，反应完毕后收集滤液。搅拌下将滤液缓慢加入10倍体积的冰冻乙醚/石油醚1420ml中，搅拌均匀，离心，收集沉淀。将所得中间体3,真空干燥8.0小时以上，置于冰箱，冷藏保存。产品4.84g,产品收率在96.2％，产品纯度为97.8％。(4)中间体2的制备25ml反应瓶中，加入中间体3698mg(1mmol)，dmf12ml，hosu230mg(2mmol)搅拌溶解，室温下加入dic504mg(4mmol)，计时反应18小时，hplc检测原料反应完全，得到中间体2的dmf溶液。(5)联肼尼克酰胺聚乙二醇双环五肽的制备peg4-c[kr(pbf)gdf]2206mg(2mmol)用10mldmf溶解，在冰浴(0-5℃)条件下，滴加至中间体2的dmf溶液中，加入diea258mg(2mmol)，充分搅拌0.5小时，撤去冰浴。室温(20-30℃)下充分搅拌，反应12～14小时，hplc检测原料反应完全。过滤，搅拌下将滤液缓慢加入10倍体积的冰冻乙醚/石油醚中，搅拌均匀，离心，收集沉淀。将所得固体，真空干燥8.0小时以上，得产品3168mg。裂解液配置：按100ml/g的比例，配置裂解液：(三氟乙酸:水＝95:5)称取3168mgw(g)干燥的上述固体，投入至裂解反应瓶中。在冰浴(0-5℃)条件下，缓慢加入配置的冰冻裂解液317ml，充分搅拌0.5小时，撤去冰浴。室温(20-30℃)下充分搅拌，反应1.5～2.0小时，hplc检测原料反应完全。过滤，搅拌下将滤液缓慢加入10倍体积的冰冻乙醚/石油醚3170ml中，搅拌均匀，离心，收集沉淀。将所得联肼尼克酰胺聚乙二醇双环五肽真空干燥8.0小时以上，置于冰箱，冷藏保存。产品2064mg，产品总收率在87.3％，产品纯度为95.2％实施例2制备联肼尼克酰胺聚乙二醇双环五肽按照如下步骤操作：(1)中间体5的制备名称分子量比例投料量(g)wang树脂(sub1.00mm/g)/1.0010.00fmoc-glu(otbu)-oh425.485.0021.27hobt135.135.006.76dic126.205.006.31称取wang树脂10.00g10.00mmol(w克)(nmmol)，将树脂加入到反应器中，加入dmf/dcm(1:1)充分洗涤、溶胀树脂。以wang树脂摩尔量n为基数，按一定投料比称量以下物料：fmoc-glu(otbu)-oh21.27g(5.0倍量)，用适量dmf/dcm(1:1)溶解，加入到反应器中，加入hobt6.76g(5.0倍量)、dic6.31g(5.0倍量)，偶联反应2.0±0.5小时，dmf/dcm(1:1)洗涤3次。用吡啶/乙酸酐(1:1)封闭10分钟，重复1次。甲醇收缩，将该肽树脂真空干燥12小时以上，称量肽树脂的重量14.58g。检测该wang-glu(otbu)的替代度为0.62mmol/g，n0mmol＝14.58*0.62＝9.04mmol。(2)中间体4的制备名称分子量比例投料量(g)wang-glu(otbu)(sub0.62mmol/g)/1.0014.58fmoc-peg4-oh487.553.0013.22hobt135.133.003.66dic126.203.003.42hynic343.293.009.31hobt135.133.003.66dic126.203.003.42称取wang-glu(otbu)14.58g9.04mmol(w0克)(n0mmol)，将树脂加入到反应器中，加入dmf洗涤树脂后，将20％dblk[20％哌啶/dmf(v/v)](用量3-4ml/克树脂)加入反应器中，反应10+10分钟，用dmf洗涤树脂。以wang-glu(otbu)树脂摩尔量n0为基数，按一定投料比称量以下物料：fmoc-peg4-oh13.22g(3.0倍量)；hobt3.66g(3.0倍量)；用适量dmf溶解。冰浴下加入dic3.42g(3.0倍量)，活化反应3±1分钟后加入到反应器中。偶联反应2.0±0.1小时，用dmf洗涤4次。检测反应：取少量反应液，滴3-5滴茚三酮溶液，加热至沸腾；以dmf洗涤树脂颗粒，观察是否显色，以确定反应是否完全。重复上述操作将hynic偶联到树脂上。甲醇收缩，将该肽树脂真空干燥12小时以上，称量肽树脂的重量16.03g。(3)中间体3的制备裂解液配置：按10ml/g的比例，配置裂解液：(三氟乙酸:水＝95:5)乙醚/石油醚：根据100ml/g树脂的比例，其中乙醚：石油醚＝1:1v/v树脂称量：称取16.03gw(g)干燥的肽树脂，投入至裂解反应瓶中。在冰浴(0-5℃)条件下，缓慢加入配置的冰冻裂解液160ml，充分搅拌0.5小时，撤去冰浴。室温(20-30℃)下充分搅拌树脂,反应1.5～2.0小时，反应完毕后收集滤液。搅拌下将滤液缓慢加入10倍体积的冰冻乙醚/石油醚1600ml中，搅拌均匀，离心，收集沉淀。将所得中间体3,真空干燥8.0小时以上，置于冰箱，冷藏保存。产品5.98g，产品收率在94.8％，产品纯度为96.2％。(4)中间体2的制备25ml反应瓶中，加入中间体3698mg(1mmol)，dmf12ml，hosu230mg(2mmol)搅拌溶解，室温下加入dic504mg(4mmol)，计时反应18小时，hplc检测原料反应完全，得到中间体2的dmf溶液。(5)联肼尼克酰胺聚乙二醇双环五肽的制备peg4-c[kr(pbf)gdf]2206mg(2mmol)用10mldmf溶解，在冰浴(0-5℃)条件下，滴加至中间体2的dmf溶液中，加入diea258mg(2mmol)，充分搅拌0.5小时，撤去冰浴。室温(20-30℃)下充分搅拌，反应12～14小时，hplc检测原料反应完全。过滤，搅拌下将滤液缓慢加入10倍体积的冰冻乙醚/石油醚中，搅拌均匀，离心，收集沉淀。将所得固体，真空干燥8.0小时以上，得产品3054mg。裂解液配置：按100ml/g的比例，配置裂解液：(三氟乙酸:水＝95:5)称取3054mgw(g)干燥的上述固体，投入至裂解反应瓶中。在冰浴(0-5℃)条件下，缓慢加入配置的冰冻裂解液305ml，充分搅拌0.5小时，撤去冰浴。室温(20-30℃)下充分搅拌，反应1.5～2.0小时，hplc检测原料反应完全。过滤，搅拌下将滤液缓慢加入10倍体积的冰冻乙醚/石油醚3050ml中，搅拌均匀，离心，收集沉淀。将所得联肼尼克酰胺聚乙二醇双环五肽真空干燥8.0小时以上，置于冰箱，冷藏保存。产品2019mg，产品总收率在85.4％，产品纯度为93.5％。实施例3制备中间体3按照如下步骤操作：(1)中间体5的制备名称分子量比例投料量(g)ctc树脂(sub1.00mm/g)1.0010.00fmoc-glu(oall)-oh409.433.0012.28diea129.2412.0015.51称取2-chlorotritylchlorideresin树脂10.00g10.00mmol(w克)(nmmol)，将树脂加入到反应器中，加入dmf充分洗涤、溶胀树脂。以2-chlorotritylchlorideresin树脂摩尔量n为基数，按一定投料比称量以下物料：fmoc-glu(oall)-oh12.28g(3.0倍量)，用适量dmf溶解，加入到反应器中，加入diea15.51g(12.0倍量)，偶联反应2.0±0.5小时，dmf洗涤3次。用dcm/meoh/diea(3:1:1)封闭10分钟，重复1次。甲醇收缩，将该肽树脂真空干燥12小时以上，称量肽树脂的重量13.88g。检测该ctc-glu(oall)的替代度为0.56mmol/g，n0mmol＝13.88*0.56＝7.77mmol。(2)中间体4的制备名称分子量比例投料量(g)ctc-glu(oall)(sub0.56mmol/g)/1.0013.88fmoc-peg4-oh487.553.0011.37hobt135.133.003.15dic126.203.002.94hynic343.293.008.00hobt135.133.003.15dic126.203.002.94称取ctc-glu(oall)13.88g7.77mmol(w0克)(n0mmol)，将树脂加入到反应器中，加入dmf洗涤树脂后，将20％dblk[20％哌啶/dmf(v/v)](用量3-4ml/克树脂)加入反应器中，反应10+10分钟，用dmf洗涤树脂。以ctc-glu(oall)树脂摩尔量n0为基数，按一定投料比称量以下物料：fmoc-peg4-oh11.37g(3.0倍量)；hobt3.15g(3.0倍量)；用适量dmf溶解。冰浴下加入dic2.94g(3.0倍量)，活化反应3±1分钟后加入到反应器中。偶联反应2.0±0.1小时，用dmf洗涤4次。检测反应：取少量反应液，滴3-5滴茚三酮溶液，加热至沸腾；以dmf洗涤树脂颗粒，观察是否显色，以确定反应是否完全。重复上述操作将hynic偶联到树脂上。(3)中间体3的制备名称分子量比例投料量(g)ctc-glu(oall)(sub0.56mmol/g)分子量1.0013.88四(三苯基膦)钯1155.560.100.90以ctc-glu(oall)树脂摩尔量n0为基数，将四(三苯基膦)钯0.90g(0.1倍量)用适量dmf溶解加入到反应器中，反应30±10分钟，用dmf洗涤树脂。甲醇收缩，将该肽树脂真空干燥12小时以上，称量肽树脂的重量15.13g。裂解液配置：按10ml/g的比例，配置裂解液：(dcm:冰乙酸:三氟乙醇＝5:1:1)乙醚/石油醚：根据100ml/g树脂的比例，其中乙醚：石油醚＝1:1v/v树脂称量：称取15.13gw(g)干燥的肽树脂，投入至裂解反应瓶中。在冰浴(0-5℃)条件下，缓慢加入配置的冰冻裂解液1513ml，充分搅拌0.5小时，撤去冰浴。室温(20-30℃)下充分搅拌树脂,反应1.5～2.0小时，反应完毕后收集滤液。搅拌下将滤液缓慢加入10倍体积的冰冻乙醚/石油醚中，搅拌均匀，离心，收集沉淀。将所得中间体3，真空干燥8.0小时以上，置于冰箱，冷藏保存。产品5.17g，产品收率在95.8％，产品纯度为95.7％。实施例4制备中间体3按照如下步骤操作：(1)中间体5的制备名称分子量比例投料量(g)ctc树脂(sub1.00mm/g)/1.010.00fmoc-glu(otbu)-oh425.483.012.76diea129.2412.015.51称取2-chlorotritylchlorideresin树脂10.00g10.00mmol(w克)(nmmol)，将树脂加入到反应器中，加入dmf充分洗涤、溶胀树脂。以2-chlorotritylchlorideresin树脂摩尔量n为基数，按一定投料比称量以下物料：fmoc-glu(otbu)-oh12.76g(3.0倍量)，用适量dmf溶解，加入到反应器中，加入diea15.51g(12.0倍量)，偶联反应2.0±0.5小时，dmf洗涤3次。用dcm/meoh/diea(3:1:1)封闭10分钟，重复1次。甲醇收缩，将该肽树脂真空干燥12小时以上，称量肽树脂的重量14.05g。检测该ctc-glu(otbu)的替代度为0.54mmol/g，n0mmol＝14.0*0.54＝7.59mmol。(2)中间体4的制备名称分子量比例投料量(g)ctc-glu(otbu)(sub0.54mmol/g)分子量1.0014.05fmoc-peg4-oh487.553.0011.10hbtu379.243.008.63diea129.243.002.94hynic343.293.007.81hbtu379.243.008.63diea129.243.002.94称取ctc-glu(otbu)14.05g7.59mmol(w0克)(n0mmol)，将树脂加入到反应器中，加入dmf洗涤树脂后，将20％dblk[20％哌啶/dmf(v/v)](用量3-4ml/克树脂)加入反应器中，反应10+10分钟，用dmf洗涤树脂。以ctc-glu(otbu)树脂摩尔量n0为基数，按一定投料比称量以下物料：fmoc-peg4-oh11.10g(3.0倍量)；hbtu8.63g(3.0倍量)；用适量dmf溶解。冰浴下加入diea2.94g(3.0倍量)，活化反应3±1分钟后加入到反应器中。偶联反应2.0±0.1小时，用dmf洗涤4次。检测反应：取少量反应液，滴3-5滴茚三酮溶液，加热至沸腾；以dmf洗涤树脂颗粒，观察是否显色，以确定反应是否完全。重复上述操作将hynic偶联到树脂上。甲醇收缩，将该肽树脂真空干燥12小时以上，称量肽树脂的重量16.37g。(3)中间体3的制备裂解液配置：按10ml/g的比例，配置裂解液：(三氟乙酸:水＝95:5)乙醚/石油醚：根据100ml/g树脂的比例，其中乙醚：石油醚＝1:1v/v树脂称量：称取16.37gw(g)干燥的肽树脂，投入至裂解反应瓶中。在冰浴(0-5℃)条件下，缓慢加入配置的冰冻裂解液164ml，充分搅拌0.5小时，撤去冰浴。室温(20-30℃)下充分搅拌树脂,反应1.5～2.0小时，反应完毕后收集滤液。搅拌下将滤液缓慢加入10倍体积的冰冻乙醚/石油醚1640ml中，搅拌均匀，离心，收集沉淀。将所得中间体3,真空干燥8.0小时以上，置于冰箱，冷藏保存。产品5.06g，产品收率在95.6％，产品纯度为97.2％。本发明根据联肼尼克酰胺聚乙二醇双环五肽的的特殊结构，将该化合物拆分成两个片段，通过活化酯的形式进行对接，这样使得制备工艺更加简单，避免了很多副反应，产品纯度较高，收率较高，从原料价格和反应条件方面考虑，为制备该化合物的优选路线。以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何形式上的限制，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，依据本发明的技术实质，对以上实施例所作的任何简单的修改、等同替换与改进等，均仍属于本发明技术方案的保护范围之内。当前第1页1 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