针对D-二聚体的结合蛋白及其应用和检测D-二聚体的方法与流程

本发明涉及抗体
技术领域：
，具体而言，涉及一种针对d-二聚体的结合蛋白及其应用和检测d-二聚体的方法。
背景技术：
：d-二聚体(dd)是血液中的纤维蛋白，经过活化和水解，产生的一种特异的，最简单的降解产物，是特异性的纤溶过程标记物。人体内的纤溶系统主要维持着血管壁的正常通透性、血液的流动状态和组织修复，在病理状态下机体发生凝血，凝血酶会作用于纤维蛋白转变为交联的纤维蛋白，交联纤维蛋白在溶解过程中，释放出x’、y’、d’、e’等碎片，并形成dd、dd/e、yd/yd、yy/dd等复合物。这些碎片进一步降解为最小的片段dd和dd/e复合物，dd分子量约62000d，在体内半衰期>3h，主要经肾脏排泄。d-二聚体水平的升高反映了体内存在着凝血及纤溶活性增强的重要分子标志物，代表血块在血管循环系统中形成，是急性血栓形成的一个敏感的标记物。心肌梗死、脑梗死、肺栓塞、静脉血栓形成、手术、肿瘤、弥漫性血管内凝血、感染及组织坏死等均可导致d-二聚体升高。1972年，gaffney首先提出d-二聚体检测，可作为监测凝血性疾病的“有用的工具”。随后在1983年，rylatt等提出基于单克隆抗体检测d-dimer(乳胶凝集法)。近年来，应用单克隆抗体和蛋白质连接技术，科研工作者推出了血栓导向溶栓剂。基本原理是利用抗原〔d—二聚体〕和抗体〔抗d—二聚体单抗)之间的亲和力，将抗血栓特异性成分的单抗与溶栓药物相连接，形成抗体－溶栓剂复合体。其中的单抗如同导弹一样，可携带溶栓剂特异地与血栓结合，使得血栓部位的溶栓剂高度聚集，从而增强对血栓的溶解作用。后来又发现将抗d—二聚体单抗标记放射性核素，在抗体与抗原特异性结合过程中，可将放射性核素携带到血栓局部，再用放射性核素检测仪监测体内放射性核素的分布，从而达到利用导向示踪剂定位诊断血栓的目的。d-二聚体在临床上作为血栓性疾病溶栓治疗的特异性监测指标。因为纤溶蛋白降解产物中，唯有d-二聚体交联碎片可反映血栓形成后的溶栓活性。因此，理论上，d-二聚体的定量检测可定量反映药物的溶栓效果、及可用于诊断、筛选新形成的血栓。在溶栓治疗中，d-二聚体含量变化一般有以下特点：①溶栓后d-二聚体含量在短期内明显上升，而后逐渐下降，提示治疗有效；②溶栓后d-二聚体含量持续升高或下降缓慢，提示溶栓药物用量不足；③溶栓治疗应持续到d-二聚体含量下降至正常范围。另外，溶栓治疗结束后，应定期观察一段时间的d-二聚体的变化以防血栓复发。据报道，肿瘤也会引起患者d-二聚体浓度升高，并且可以作为分期、预后等判断标准。masatoshioya等在一项研究中发现，结直肠癌患者的d-二聚体比良性疾病患者的明显要高，术前的d-二聚体与肿瘤的病理结果和分期正相关。术前d-二聚体水平高的患者的术后生存期明显要比低的患者短。对128例恶性肿瘤患者进行d-二聚体测定，结果发现：急性白血病组、恶性淋巴瘤组、实体瘤组初发组分别较对照组明显增高.有明显差异(p<0.05)，缓解期明显低于初发期(p<0.05)。研究表明，在肝脏疾病中，血浆d—二聚体的含量明显增高，且与肝病的严重程度呈正相关。wilder等测定59例急性和慢性肝病思者血浆d—二聚体，其中48例有不同程度的升高。各型肝炎患者d二聚体水平明显高于对照组并且具有显著性差异(p<0.01)，患者d二聚体的水平依次为重型肝炎组>；肝硬化组>；慢性肝炎组中，重度组>；急肝组>；慢性肝炎组，这可能与抗凝系统受损有关。除此之外，文献也报道了d-二聚体在脑梗，心梗，肾病，新生儿窒息等多种疾病临床检测上的应用。目前临床上已经有许多单克隆抗体能够区分d—二聚体和单体的d，可以在纤维蛋白原存在的情况下，监测纤维蛋白降解产物。这些抗d—二聚体的抗体不仅可以检测游离的d—二聚体，而且可以检测大的纤维蛋白复合物中聚合的d域，包括在凝血过程早期形成的铰链的纤维蛋白复合体。对d—二聚体抗原的准确测定，可以早期发现血管内凝血。d-二聚体的检测方法有三p试验、胶乳凝集法(latex)、elisa法、免疫渗滤胶体金显色反应法等，而临床最常用是：elisa、latex和免疫过滤胶体金染色法，其中latex法测定速度快，但结果重复性差，敏感度不如elisa法；elisa法敏感度高，但检测时耗时较长。免疫过滤胶体金显色反应能定量检测，灵敏度高，结果与elisa结果可媲美，但是特异性不强，受脂质颗粒干扰。目前用的这些检测方法都是建立在特异单抗的基础上的，也就是说针对d-二聚体的单抗制备成为提高检测灵敏度和特异性的关键。目前用于检测d-二聚体的单克隆抗体灵敏度、特异性以及亲和力上都存在一些缺陷，还有较大的改善空间，因此，本领域针对检测d-二聚体的单克隆抗体的仍然存在着强烈需求。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种d-二聚体的结合蛋白及其应用和检测d-二聚体的方法。本发明提供的结合蛋白可以特异性结合d-二聚体，具有较好的结合活性和亲和力，有利于提高检测的特异性和灵敏度，可用于d-二聚体的检测和d-二聚体水平异常疾病的诊断，为d-二聚体的检测提供多种蛋白选择，该结合蛋白也可用于制备血栓导向溶栓剂，为血栓的溶栓提供一种新的思路和选择。名词定义术语“结合蛋白”泛指包含cdr区的一切蛋白/蛋白片段，特别是抗体或抗体功能片段。“抗体”此用语包括多克隆抗体及单克隆抗体，“抗体功能片段”包括上述这些抗体的抗原化合物结合片段，包括fab、f(ab’)2、fd、fv、scfv、双特异抗体和抗体最小识别单位，以及这些抗体和片段的单链衍生物。抗体的类型可以选择igg1、igg2、igg3、igg4、iga、igm、ige、igd。此外，“抗体”此用语包括天然发生的抗体以及非天然发生的抗体，包括例如嵌合型(chimeric)、双功能型(bifunctional)和人源化(humanized)抗体，以及相关的合成异构形式(isoforms)。“抗体”此用语可和“免疫球蛋白”互换使用。抗体的“可变区”或“可变结构域”是指抗体的重链或轻链的氨基端结构域。重链的可变结构域可以被称为“vh”。轻链的可变结构域可以被称为“vl”。这些结构域通常是抗体的最可变的部分，并含有抗原结合位点。轻链或重链可变区(vl或vh)由被三个称为“互补决定区”或“cdr”的高变区打断的构架区构成。构架区和cdr的范围已被精确定义，例如在kabat(参见《免疫重要的蛋白质的序列》(sequencesofproteinsofimmunologicalinterest)，e.kabat等，美国卫生与人类服务部(u.s.departmentofhealthandhumanservices)，(1983))和chothia中。抗体的构架区，即构成要件轻链和重链的组合的构架区，起到定位和对齐cdr的作用，所述cdr主要负责与抗原的结合。当在本文中使用时，“骨架区”或“fr”区意味着抗体可变结构域的排除被定义为cdr的那些区域之外的区域。每个抗体可变结构域构架可以被进一步细分成被cdr分隔开的毗邻区域(fr1、fr2、fr3和fr4)。通常情况下，重链和轻链的可变区vl/vh可由以下编号的cdr与fr按如下组合排列连接获得：fr1-cdr1-fr2-cdr2-fr3-cdr3-fr4。当在本文中使用时，与多肽或核酸相关联的术语“纯化的”或“分离的”是指多肽或核酸不是处于其天然介质中或天然形式下。因此，术语“分离的”包括从其原始环境，例如如果它是天然存在的，从天然环境取出的多肽或核酸。例如，分离的多肽通常不含通常与其结合或通常与其混合或在溶液中的至少某些蛋白质或其他细胞组分。分离的多肽包括细胞裂解物中包含的天然生产的所述多肽，纯化或部分纯化形式的所述多肽，重组多肽，被细胞表达或分泌的所述多肽，以及在异源宿主细胞或培养物中的所述多肽。与核酸相关联，术语“分离的”或“纯化的”是指所述核酸不在其天然的基因组背景中(例如在载体中，作为表达盒，连接到启动子，或人工引入到异源宿主细胞中)。本发明的示例性实施方案：第一方面，本发明实施例提供一种针对d-二聚体的结合蛋白，所述结合蛋白包括抗原结合结构域；所述抗原结合结构域包括如下互补决定区中的至少一个，或者包括与下述至少一个互补决定区的序列具有至少80％的序列同一性的相似互补决定区：互补决定区cdr-vh1，其氨基酸序列为g-y-x1-f-t-x2-y-n-x3-h，其中：x1是t或s，x2是d或n，x3是l、v或i；互补决定区cdr-vh2，其氨基酸序列为y-i-x1-p-y-x2-g-e-t-x3-y-n-q，其中：x1是y或d，x2是l、v或i，x3是a或g；互补决定区cdr-vh3，其氨基酸序列为a-r-x1-g-x2-y-x3-p-w-f-t，其中：x1是s或t，x2是n或d，x3是n或d；互补决定区cdr-vl1，其氨基酸序列为q-s-x1-x2-n-s-g-x3-q-k-x4-y，其中：x1是i或l，x2是f、v或l，x3是s或t，x4是d或n；互补决定区cdr-vl2，其氨基酸序列为x1-a-s-x2-r-x3-s，其中：x1是g、f或w，x2是s或t，x3是d或e；互补决定区cdr-vl3，其氨基酸序列为x1-x2-d-y-s-y-p-x2-t，其中：x1是q或k，x2是q或n，x3是i、v或l。本发明实施例提供的结合蛋白含有抗原结合结构域，该抗原结合结构域包括上述互补决定区中的至少一个，上述互补决定区的氨基酸序列是本发明首次发现并揭示，是一种新的序列，可赋予该结合蛋白特异性结合d-二聚体抗原的能力，且该结合蛋白具有较好的结合活性以及亲和力，使用本发明的结合蛋白检测d-二聚体，有利于提高检测d-二聚体的灵敏度和特异性，该结合蛋白可以用于d-二聚体水平异常疾病的诊断，为d-二聚体的检测提供多种蛋白选择，该结合蛋白也可用于制备血栓导向溶栓剂，为血栓的溶栓提供一种新的思路和选择。在可选的实施方式中，所述互补决定区cdr-vh1中，x2是d；所述互补决定区cdr-vh2中，x1是y；所述互补决定区cdr-vh3中，x1是s；所述互补决定区cdr-vl1中，x4是n；所述互补决定区cdr-vl2中，x2是t；所述互补决定区cdr-vl3中，x1是q。在可选的实施方式中，所述互补决定区cdr-vh1中，x1是t。在可选的实施方式中，所述互补决定区cdr-vh1中，x1是s。在可选的实施方式中，所述互补决定区cdr-vh1中，x3是l。在可选的实施方式中，所述互补决定区cdr-vh1中，x3是v。在可选的实施方式中，所述互补决定区cdr-vh1中，x3是i。在可选的实施方式中，所述互补决定区cdr-vh2中，x2是l。在可选的实施方式中，所述互补决定区cdr-vh2中，x2是v。在可选的实施方式中，所述互补决定区cdr-vh2中，x2是i。在可选的实施方式中，所述互补决定区cdr-vh2中，x3是a。在可选的实施方式中，所述互补决定区cdr-vh2中，x3是g。在可选的实施方式中，所述互补决定区cdr-vh3中，x2是n。在可选的实施方式中，所述互补决定区cdr-vh3中，x2是d。在可选的实施方式中，所述互补决定区cdr-vh3中，x3是n。在可选的实施方式中，所述互补决定区cdr-vh3中，x3是d。在可选的实施方式中，所述互补决定区cdr-vl1中，x1是i。在可选的实施方式中，所述互补决定区cdr-vl1中，x1是l。在可选的实施方式中，所述互补决定区cdr-vl1中，x2是f。在可选的实施方式中，所述互补决定区cdr-vl1中，x2是v。在可选的实施方式中，所述互补决定区cdr-vl1中，x2是l。在可选的实施方式中，所述互补决定区cdr-vl1中，x3是s。在可选的实施方式中，所述互补决定区cdr-vl1中，x3是t。在可选的实施方式中，所述互补决定区cdr-vl2中，x1是g。在可选的实施方式中，所述互补决定区cdr-vl2中，x1是f。在可选的实施方式中，所述互补决定区cdr-vl2中，x1是w。在可选的实施方式中，所述互补决定区cdr-vl2中，x3是d。在可选的实施方式中，所述互补决定区cdr-vl2中，x3是e。在可选的实施方式中，所述互补决定区cdr-vl3中，x2是q。在可选的实施方式中，所述互补决定区cdr-vl3中，x2是n。在可选的实施方式中，所述互补决定区cdr-vl3中，x3是i。在可选的实施方式中，所述互补决定区cdr-vl3中，x3是v。在可选的实施方式中，所述互补决定区cdr-vl3中，x3是l。在可选的实施方式中，所述相似互补决定区与上述互补决定区的序列具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％的序列同一性。在可选的实施方式中，所述抗原结合结构域与d-二聚体蛋白具有kd≤5.95×10-7mol/l的亲和力。在可选的实施方式中，所述抗原结合结构域与d-二聚体蛋白具有kd≤5×10-7mol/l、4×10-7mol/l、3×10-7mol/l、2×10-7mol/l、1×10-7mol/l、9×10-8mol/l、8×10-8mol/l、7×10-8mol/l、6×10-8mol/l、5×10-8mol/l、4×10-8mol/l、3×10-8mol/l、2×10-8mol/l、1×10-8mol/l、9×10-9mol/l、8×10-9mol/l、7×10-9mol/l、6×10-9mol/l或5×10-9mol/l的亲和力。在可选的实施方式中，所述抗原结合结构域与d-二聚体蛋白具有5.40×10-9mol/l≤kd≤5.95×10-7mol/l的亲和力。kd的检测参考本发明实施例中的方法进行。在可选的实施方式中，上述的各互补决定区中的突变位点(即xn位点，n＝1，2，3或4)选自下述突变组合1-51中的任一种：在可选的实施方式中，所述互补决定区cdr-vh1中，x2是n；所述互补决定区cdr-vh2中，x1是d；所述互补决定区cdr-vh3中，x1是t；所述互补决定区cdr-vl1中，x4是d；所述互补决定区cdr-vl2中，x2是s；所述互补决定区cdr-vl3中，x1是k。可选的实施方式中，上述的各互补决定区中的突变位点(即xn位点，n＝1，2，3或4)选自下述突变组合52-60中的任一种：在可选的实施方式中，所述结合蛋白中包括至少3个互补决定区(例如重链的3个互补决定区，或者轻链的3个互补决定区)；或者，所述结合蛋白包括至少6个互补决定区(如：重链的3个互补决定区以及轻链的3个互补决定区)；在可选的实施方式中，所述结合蛋白为包含可变区和恒定区的完整抗体。在可选的实施方式中，所述结合蛋白为抗体的功能性片段，例如纳米抗体、f(ab’)2、fab’、fab、fv、scfv、双特异抗体和抗体最小识别单位中的任意一种；上述抗体的功能片段通常具有与其来源抗体相同的结合特异性。本领域技术人员根据本发明记载的内容容易理解到，上述抗体的功能片段可以通过比如酶消化的方法(包括胃蛋白酶或木瓜蛋白酶)和/或通过化学还原分裂二硫键的方法获得。上述抗体的功能片段还可以通过也是本领域技术人员所知的重组遗传学技术或通过例如自动肽合成仪，比如appliedbiosystems等销售的自动肽合成仪合成获得。在可选的实施方式中，所述结合蛋白包括序列依次如seqidno:1-4所示的轻链骨架区fr-l1、fr-l2、fr-l3及fr-l4，和/或，序列依次如seqidno:5-8所示的重链骨架区fr-h1、fr-h2、fr-h3及fr-h4。需要说明的是，基于本发明揭示的内容，所述结合蛋白的重链或轻链骨架区的种属来源可以为人，以构成人源化抗体。在可选的实施方式中，所述结合蛋白还包含抗体恒定区。在可选的实施方式中，所述抗体恒定区选自igg1、igg2、igg3、igg4、iga、igm、ige和igd中的任意一者的恒定区。在可选的实施方式中，所述抗体恒定区的种属来源为牛、马、乳牛、猪、绵羊、山羊、大鼠、小鼠、狗、猫、兔、骆驼、驴、鹿、貂、鸡、鸭、鹅、火鸡、斗鸡或人。在可选的实施方式中，所述抗体恒定区来源于小鼠。在可选的实施方式中，所述抗体恒定区的轻链恒定区序列如seqidno:9所示，所述抗体恒定区的重链恒定区序列如seqidno:10所示。seqidno:1-10的序列如下表所示：第二方面，本发明实施例提供前述实施方式任一项所述的结合蛋白制备用于诊断d-二聚体水平异常的疾病的试剂或试剂盒中的应用。需要说明的是，本发明提供的结合蛋白可以检测d-二聚体，因此，只要是以d-二聚体为标志物的任何疾病，本发明提供的结合蛋白都可以用于制备该疾病的诊断或预后评估，其均属于本发明的保护范围。在可选的实施方式中，d-二聚体水平异常疾病为血栓形成性疾病。在可选的实施方式中，所述血栓形成性疾病选自心肌梗死、脑梗死、肺栓塞、肾病、肿瘤以及弥漫性血管内凝血中的一种或几种。第三方面，本发明实施例提供一种用于诊断d-二聚体水平异常的疾病的试剂或试剂盒，其含有如上所述的结合蛋白。在可选的实施方式中，d-二聚体水平异常疾病为血栓形成性疾病。在可选的实施方式中，所述血栓形成性疾病选自心肌梗死、脑梗死、肺栓塞、肾病、肿瘤以及弥漫性血管内凝血中的一种或几种。第四方面，本发明实施例提供一种血栓导向溶栓剂，其含有溶栓药物，所述溶栓药物连接有如上所述的结合蛋白。需要说明的是，上述的溶栓药物可以根据实际需要选择，本发明对其类型并不作任何限定，无论选择何种溶栓药物，只要是将本发明提供的结合蛋白连接该溶栓药物形成的血栓导向溶栓剂，即属于本发明的保护范围。第五方面，本发明实施例提供一种检测d-二聚体的方法，其包括：将前述实施方式任一项所述的结合蛋白与待测样本混合。在可选的实施方式中，上述检测方法是以非疾病的诊断为目的。需要说明的是，本领域技术人员可以基于抗体/抗原结合形成免疫复合物的特点对待测样本中的d-二聚体蛋白进行定性或定量检测。基于抗体抗原结合形成免疫复合物对抗原或抗体进行检测的方法包括：(1)通过沉淀反应实现检测目的，包括：单向免疫扩散试验、双向免疫扩散试验、免疫比浊法、对流免疫电泳、免疫电泳以及免疫印迹法等；(2)通过标记显示信号强度的指示剂实现检测目的，包括：免疫荧光法、放射免疫分析法、酶联免疫分析法(例如双抗体夹心法、间接法或竞争法等)以及化学发光免疫分析法等。指示剂可以根据不同的检测方法合理选择，包括但不限于如下描述的指示剂：(1)免疫荧光法中，指示剂可以是荧光染料，例如是荧光素类染料(包括异硫氰酸芠光素(fiic)、羟基光素(fam)、四氯光素(tet)等或其类似物)、罗丹明类染料(包括红色罗丹明(rbitc)、四甲基罗丹明(tamra)、罗丹明b(tritc)等或其类似物)、cy系列染料(包括cy2、cy3、cy3b、cy3.5、cy5、cy5.5、cy3等或其类似物)、alexa系列染料(包括alexafluor350、405、430、488、532、546、555、568、594、610、33、647、680、700、750等或其类似物)、蛋白类染料(包括藻红蛋白(pe)、藻蓝蛋白(pc)、别藻蓝蛋白(apc)、多甲藻黄素-叶绿素蛋白(precp)等)；(2)放射免疫分析法中，指示剂可以是放射性同位素，例如：212bi、131i、111in、90y、186re、211at、125i、188re、153sm、213bi、32p、94mtc、99mtc、203pb、67ga、68ga、43sc、47sc、110min、97ru、62cu、64cu、67cu、68cu、86y、88y、121sn、161tb、166ho、105rh、177lu、172lu和18f等。(3)酶联免疫分析法中，指示剂可以是催化底物显色的酶(例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶或葡萄糖氧化酶等)。(4)化学发光免疫分析法中，指示剂可以是化学发光试剂，例如吖啶酯、辣根过氧化物酶和鲁米诺、碱性磷酸酶和amppd，电化学发光剂三联吡啶钌和三丙胺等。基于此，在本发明公开了上述结合蛋白基础上，本领域技术人员容易想到采用上述的任意一种方法或几种方法的组合或其他的方法，以实现对待测样本中d-二聚体的定量或定性检测，无论选用何种方法，只要是利用了本发明公开的结合蛋白来检测d-二聚体，其均属于本发明的保护范围。在可选的实施方式中，所述结合蛋白标记有显示信号强度的指示剂，以使所述结合蛋白与d-二聚体蛋白结合的复合物被检测。第六方面，本发明实施例提供一种分离的核酸，其编码如前述实施方式任一项所述的结合蛋白；在可选的实施方式中，所述核酸为dna或rna。在本发明公开了上述结合蛋白的氨基酸序列基础上，本领域技术人员根据氨基酸对应的密码子容易获得编码上述结合蛋白的核酸序列，并根据密码子的简并性，可以得到多种编码上述结合蛋白的核酸序列，无论是何种核酸序列，只要其编码上述结合蛋白，其均属于本发明的保护范围。第七方面，本发明实施例提供一种载体，其含有前述实施方式所述的核酸。其中的核酸序列与至少一种调节序列可操作连接。“可操作连接”指的是核酸序列以允许表达的方式与调节序列连接。调节序列选择用来在合适的宿主细胞中指导目的蛋白质的表达，调节序列包含启动子、增强子和其它的表达调控元件。在本文中，载体可以指包含本发明的核酸或其片段的、能够携带遗传信息并且可以将遗传信息递送到细胞中的分子或试剂。典型的载体包括质粒、病毒、噬菌体、黏粒和微型染色体。载体可以是克隆载体(即用于将遗传信息转移到细胞中的载体，可以繁殖所述细胞并且可以选择存在或不存在所述遗传信息的所述细胞)或表达载体(即包含必要的遗传元件从而允许所述载体的遗传信息在细胞中表达的载体)。因此，克隆载体可以包含选择标记，以及与所述克隆载体所指定的细胞类型相匹配的复制起点，而表达载体则包含对于影响指定靶细胞中的表达必要的调节元件。本发明的核酸或其片段可以插入到合适的载体中以形成携带本发明核酸片段的克隆载体或表达载体。这种新载体也是本发明的一部分。所述载体可以包括质粒、噬菌体、黏粒、微型染色体或病毒，也包括只在特定细胞中瞬时表达的裸dna。本发明克隆载体和表达载体能够自发的复制，因此能够为用于随后克隆的高水平表达或高水平复制目的提供高拷贝数。表达载体可以包括用于驱动本发明的核酸片段表达的启动子，可选的还包括编码使所述蛋白表达产物分泌或整合到膜上的信号肽序列，以及可选的还包括编码终止子的核酸序列。当在生产菌株或细胞系中操作表达载体时，载体引入到宿主细胞中时可以整合到宿主细胞的基因组中，也可以不能被整合到宿主细胞基因组中。载体通常携带复制位点，以及能够在转化细胞中提供表型选择的标记序列。第八方面，本发明实施例提供一种宿主细胞，其含有前述实施方式所述的载体。本发明的表达载体可用于转化宿主细胞。这种转化后的宿主细胞也是本发明的一部分，可以是用于增殖本发明的核酸片段和载体、或用于重组制备本发明的结合蛋白的培养细胞或细胞系。本发明的宿主细胞包括微生物如细菌(如大肠杆菌、芽孢杆菌等)。宿主细胞也包括来自多细胞生物如真菌、昆虫细胞、植物细胞或哺乳动物细胞，优选来自哺乳动物的细胞，例如cho细胞。第九方面，本发明实施例提供一种生产前述实施方式任一项所述的结合蛋白的方法，其包括：培养前述实施方式所述的宿主细胞，从培养基中或从所培养的宿主细胞中分离纯化得到所述结合蛋白。所述生产方法可以是例如，用编码至少一部分结合蛋白的核酸载体转染宿主细胞，在合适的条件下培养该宿主细胞使其表达该结合蛋白。宿主细胞也可以用一个或多个表达载体转染，该表达载体可以单独或结合地包含编码至少一部分结合蛋白的dna。利用常规的纯化蛋白质和肽的技术可从培养基或细胞裂解物中分离结合蛋白，所述技术包括硫酸铵沉淀，层析(如离子交换，凝胶过滤，亲合层析等)和/或电泳。构建合适的含有目的编码和调控序列的载体可以使用本领域公知的标准连接和限制技术进行。将分离的质粒、dna序列或合成的寡核苷酸按需要的形式切割、加尾和再连接。可以用任何方法向编码序列中引入突变以产生本发明的变体，这些突变可以包含缺失或插入或置换等。附图说明为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。图1为实施例1的d-二聚体的单克隆抗体进行还原性的sds-page。具体实施方式为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开内容所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。尽管与本文描述的那些方法和材料类似或等同的任何方法和材料都可用于本文的制剂或单位剂量的实践或测试，但现在描述一些方法和材料。除非另有说明，否则本文采用或考虑的技术是标准方法。材料、方法和实例仅是说明性而非限制性的。除非另外指明，否则实践本发明将采用细胞生物学、分子生物学(包含重组技术)、微生物学、生物化学和免疫学的常规技术，所述常规技术在本领域技术人员的能力范围内。文献中充分解释了这种技术，如《分子克隆：实验室手册(molecularcloning:alaboratorymanual)》，第二版(sambrook等人，1989)；《寡核苷酸合成(oligonucleotidesynthesis)》(m.j.gait编，1984)；《动物细胞培养(animalcellculture)》(r.i.freshney编，1987)；《酶学方法(methodsinenzymology)》(学术出版社有限公司(academicpress，inc.)；《实验免疫学手册(handbookofexperimentalimmunology)》(d.m.weir和c.c.blackwell编)；《哺乳动物细胞用基因转移载体(genetransfervectorsformammaliancells)》(j.m.miller和m.p.calos编，1987)；《当代分子生物学方法(currentprotocolsinmolecularbiology)》(f.m.ausubel等人编，1987)；《pcr:聚合酶链反应(pcr:thepolymerasechainreaction)》(mullis等人编，1994)；以及《当代免疫学方法(currentprotocolsinimmunology)》(j.e.coligan等人编，1991)，所述文献中的每个文献均通过引用明确并入本文中。下文参考用于说明的实例应用描述了本发明的若干方面。应当理解，阐述了许多具体细节、关系和方法以提供对本发明的充分理解。然而，相关领域普通技术人员将很容易认识到，可以在没有具体细节中的一个或多个具体细节的情况下或用其它方法实践本发明。本发明不限于展示的活动或事件排序，因为一些活动可以以不同的顺序和/或与其它活动或者事件同时发生。此外，实施根据本发明的方法不需要所有展示的活动或事件。以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。实施例1本实施例中限制性内切酶、primestardna聚合酶购自takara公司。magextractor-rna提取试剂盒购自toyobo公司。bdsmarttmracecdnaamplificationkit试剂盒购自takara公司。pmd-18t载体购自takara公司。质粒提取试剂盒购自天根公司。引物合成和基因测序由invitrogen公司完成。本实施例提供了一种制备抗d-二聚体的重组抗体的方法1重组质粒的构建(1)引物扩增heavychain和lightchain5’race引物：(2)抗体可变区基因克隆及测序从分泌抗d-二聚体的单克隆抗体的杂交瘤细胞株中提取中rna，用smartertmracecdnaamplificationkit试剂盒及试剂盒中的smarteriiaoligonucleotide和5'-cds引物进行第一链cdna合成，获得的第一链cdna产物作为pcr扩增模板。lightchain基因以universalprimeramix(upm)、nesteduniversalprimera(nup)和miggckr引物进行扩增，heavychain基因以universalprimeramix(upm)、nesteduniversalprimera(nup)和miggchr引物进行扩增。其中lightchain的引物对扩增出0.8kb左右的目的条带，heavychain的引物对扩增出1.4kb左右的目的条带。用琼脂糖凝胶电泳纯化回收，产物用rtaqdna聚合酶进行加a反应后插入到pmd-18t载体中，转化到dh5α感受态细胞中，长出菌落后分别取heavychain及lightchain基因克隆，送invitrogen公司进行测序。(3)抗d-二聚体的单克隆抗体可变区基因的序列分析将上述测序得到的基因序列放在imgt抗体数据库中进行分析，并利用vnti11.5软件进行分析确定重链和轻链引物对扩增出的基因都是正确的，其中lightchain扩增出的基因片段中，vl基因序列为342bp，属于vkii基因家族，其前方有57bp的前导肽序列；heavychain引物对扩增出的基因片段中，vh基因序列为357bp，属于vh1基因家族，其前方有57bp的前导肽序列。(4)重组抗体表达质粒的构建pcdnatm3.4vector为构建的重组抗体真核表达载体，该表达载体已经引入hindiii、bamhi、ecori等多克隆酶切位点，并命名为pcdna3.4a表达载体，后续简称3.4a表达载体；根据上述pmd-18t中抗体基因测序结果，设计抗d-二聚体抗体的轻链和重链基因特异性引物，两端分别带有hindiii、ecori酶切位点和保护碱基，引物如下：通过pcr扩增方法扩出0.75kb的lightchain基因片段和1.42kb的heavychain基因片段。heavychain和lightchain基因片段分别采用hindiii/ecori双酶切，3.4a载体采用hindiii/ecori双酶切，将片段和载体纯化回收后heavychain基因和lightchain基因分别连接3.4a表达载体中，分别得到heavychain和lightchain的重组表达质粒。2稳定细胞株筛选(1)重组抗体表达质粒瞬时转染cho细胞，确定表达质粒活性质粒用超纯水稀释至400ng/ml，调节cho细胞1.43×107cells/ml于离心管中，100μl质粒与700μl细胞混合，转入电转杯，电转，第3、5、7天取样计数，第7天收样检测。包被液稀释羊抗鼠igg1μg/ml进行微孔板包被，每孔100μl，4℃过夜；次日，洗涤液清洗2次，拍干；加入封闭液(20％bsa+80％pbs)，每孔120μl，37℃，1h，拍干；加入稀释后的细胞上清，100μl/孔，37℃，60min；甩掉板内液体，拍干，加入20％鼠阴性血封闭，每孔120μl，37℃，1h；甩掉板内液体，拍干，加入稀释的d-二聚体抗原，每孔100μl，37℃，40min；洗涤液清洗5次，拍干；加入标记hrp的d-二聚体单克隆抗体，每孔100μl，37℃，30min；加入显色液a液(50μl/孔)，加入显色液b液(50μl/孔)，10min；加入终止液，50μl/孔；酶标仪上450nm(参考630nm)处读od值。结果显示细胞上清稀释1000倍后反应od仍大于1.0，未加细胞上清孔反应od小于0.1，表明质粒瞬转后产生的抗体对d-二聚体蛋白都有活性。(2)重组抗体表达质粒线性化准备下述试剂：buffer50μl、dna100μg/管、puvⅰ酶10μl、无菌水补至500μl，37℃水浴酶切过夜；先用等体积酚/氯仿/异戊醇(下层)25:24:1，再用氯仿(水相)依次进行抽提；0.1倍体积(水相)3m醋酸钠和2倍体积乙醇冰上沉淀，70％乙醇漂洗沉淀，去除有机溶剂，待乙醇挥发完全用适量的灭菌水进行复融，最后进行浓度的测定。(3)重组抗体表达质粒稳定转染，加压筛选稳定细胞株质粒用超纯水稀释至400ng/ml，调节cho细胞1.43×107cells/ml于离心管中，100μl质粒与700μl细胞混合，转入电转杯，电转，次日计数；25μmol/lmsx96孔加压培养约25天。显微镜下观察标记长有细胞的克隆孔，并记录汇合度；取培养上清，送样检测；挑选抗体浓度，相对浓度高的细胞株转24孔，3天左右转6孔；3天后保种批培，调整细胞密度0.5×106cells/ml，2.2ml进行批培养，细胞密度0.3×106cells/ml，2ml进行保种；7天6孔批培上清送样检测，挑选抗体浓度及细胞直径较小的细胞株转tpp保种传代。3重组抗体生产(1)细胞扩培细胞复苏之后先在125ml规格的摇瓶中培养，接种体积为30ml，培养基为100％dynamis培养基，放置于转速120r/min，温度为37℃，二氧化碳为8％的摇床中。培养72h，以50万cells/ml接种密度接种扩培，扩培体积根据生产需求进行计算，培养基为100％dynamis培养基。之后每72h扩培一次。当细胞量满足生产需求时，严格控制接种密度为50万cells/ml左右进行生产。(2)摇瓶生产及纯化摇瓶参数：转速120r/min，温度为37℃，二氧化碳为8％。流加补料：在摇瓶中培养至72h时开始每天补料，hyclonetmcellboosttmfeed7a每天流加初始培养体积的3％，feed7b每天流加量为初始培养体积的千分之一，一直补到第12天(第12天补料)。葡萄糖在第六天补加3g/l。第13天收样。用proteina亲和层析柱进行亲和纯化。取4μg纯化的抗体(即为d-二聚体单克隆抗体)进行还原性sds-page，电泳图如图1所示。在还原性sds-page后显示两条带，1条mr为50kd(即重链，seqidno:14)，另一条mr为28kd(即轻链，seqidno:12)。实施例2抗体的性能检测(1)实施例1抗体及其突变体的活性检测进一步分析，实施例1的d-二聚体单克隆抗体(wt)的重链可变区如seqidno:13所示，其中，重链的各互补决定区的氨基酸序列如下：cdr-vh1：g-y-s(x1)-f-t-n(x2)-y-n-v(x3)-h；cdr-vh2：y-i-d(x1)-p-y-l(x2)-g-e-t-a(x3)-y-n-q；cdr-vh3：a-r-t(x1)-g-n(x2)-y-d(x3)-p-w-f-t；其轻链可变区如seqidno:11所示，其中，轻链的各互补决定区的氨基酸序列如下：cdr-vl1：q-s-i(x1)-v(x2)-n-s-g-s(x3)-q-k-d(x4)-y；cdr-vl2：g(x1)-a-s-s(x2)-r-d(x3)-s；cdr-vl3：k(x1)-q(x2)-d-y-s-y-p-i(x2)-t。在实施例1的d-二聚体单克隆抗体基础上，在互补决定区中对于抗体活性有关的位点进行突变，其中，x1、x2、x3、x4均为突变位点。见下表1。表1与抗体活性有关的突变位点结合活性检测：包被液(pbs)稀释羊抗鼠igg1μg/ml进行微孔板包被，每孔100μl，4℃过夜；次日，洗涤液(pbs)清洗2次，拍干；加入封闭液(20％bsa+80％pbs)，每孔120μl，37℃，1h，拍干；加入稀释后的d-二聚体单克隆抗体，100μl/孔，37℃，60min；甩掉板内液体，拍干，加入20％鼠阴性血封闭，每孔120μl，37℃，1h；甩掉板内液体，拍干，加入稀释d-二聚体，每孔100μl，37℃，40min；洗涤液清洗5次，拍干；加入另一株标记hrp的d-二聚体单克隆抗体，每孔100μl，37℃，30min；加入显色液a液(50μl/孔，含2.1g/l柠檬酸、12.25g/l柠檬酸、0.07g/l乙酰苯胺和0.5g/l过氧化脲)，加入显色液b液(50μl/孔，含1.05g/l柠檬酸、0.186g/ledta·2na、0.45g/ltmb和0.2ml/l浓hcl)，10min；加入终止液(含0.75g/edta·2na和10.2ml/l浓h2so4)，50μl/孔；酶标仪上450nm(参考630nm)处读od值。结果见表2。表2抗体及其突变体的活性数据抗体浓度(ng/ml)12562.531.2515.6257.81250wt1.7251.2130.9560.6520.4310.023突变11.9841.4811.1290.8710.5390.048突变21.9181.4821.1050.8610.5460.074突变31.9001.4741.1360.8940.5810.067突变41.9761.4491.1090.8860.5170.059突变50.8450.5670.3150.2430.2010.046突变60.2240.031----突变70.3560.021----表2数据可以看出，wt和突变1-5具有与抗原的结合活性，而突变6和7在低于31.25ng/ml浓度下未检测出od值，说明表1中所列突变位点的氨基酸突变方式具有不同预期性。(2)实施例1抗体及其突变体的亲和力检测(a)在突变1的基础上，对其他位点进行突变，各突变的序列见下表3。表3与抗体亲和力有关的突变位点亲和力检测：利用amc传感器，将纯化出来的抗体(表3中的各突变抗体)用pbst从50μg/ml开始进行2倍梯度稀释，d-二聚体用pbst进行梯度稀释；运行流程：缓冲液1(pbst)中平衡60s，抗体溶液中固化抗体300s，缓冲液2(pbst)中孵育180s，抗原溶液中结合420s，缓冲液2中解离1200s，用10mmph1.69gly溶液及缓冲液3进行传感器再生，输出数据。(kd表示平衡解离常数即亲和力；kon表示结合速率；kdis表示解离速率。)表4亲和力检测数据从表4可以看出，突变1以及突变1-1至突变1-50的亲和力较好，说明表5中的突变位点的突变方式对亲和力没有负面影响，突变后可以取得较好的亲和力。(b)在wt的基础上，对其他位点进行突变，并检测各突变体的亲和力，各突变的序列见下表5，对应的亲和力数据见表6。表5以wt为骨架进行的突变表6以wt为骨架进行的突变的亲和力检测结果表6中数据显示，表5所列突变位点对抗体亲和力影响较小，均具有较好的亲和力。(3)裸抗稳定性考核将上述表格中的抗体置于4℃(冰箱)、-80℃(冰箱)、37℃(恒温箱)放置21天，取7天、14天、21天样品进行状态观察，并对21天样品进行活性检测，结果显示三种考核条件下抗体放置21天均未见明显蛋白状态变化，活性也未随考核温度的升高呈下降越势，说明自产抗体稳定。下表为突变1考核21天的酶免活性检测od结果。表7抗体浓度(ng/ml)12531.2504℃，21天样品1.8271.1080.059-80℃，21天样品1.8411.1160.04837℃，21天样品1.8941.1350.074在不同温度下存放21天后，本发明实施例的抗体活性变化不大，说明本发明实施例提供的抗体具有较好的稳定性。以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。sequencelisting<110>东莞市朋志生物科技有限公司<120>针对d-二聚体的结合蛋白及其应用和检测d-二聚体的方法<160>14<170>patentinversion3.5<210>1<211>26<212>prt<213>人工序列<400>1aspilevalmetthrglnserproserserleuthrvalthralagly151015glulysvalthrmetsercyslysserser2025<210>2<211>17<212>prt<213>人工序列<400>2leuthrtrptyrglnglnlysproglyglnserprolysleuleuile151015tyr<210>3<211>32<212>prt<213>人工序列<400>3glyvalproaspargphethrglyserglyserglythraspphethr151015leuthrileserservalglnalagluaspleualavaltyrtyrcys202530<210>4<211>11<212>prt<213>人工序列<400>4pheglyalaglythrlysleugluleulysarg1510<210>5<211>25<212>prt<213>人工序列<400>5gluvalglnpheglnglnserglyprogluleuvallysproglyala151015servallysilesercyslysalaser2025<210>6<211>14<212>prt<213>人工序列<400>6trpvallysglnserhisglylysserileglutrpilegly1510<210>7<211>34<212>prt<213>人工序列<400>7lysphelysserlysalathrleuthrvalaspaspserserserthr151015alatyrmetgluleuargserleuthrsergluaspseralavaltyr202530tyrcys<210>8<211>12<212>prt<213>人工序列<400>8tyrtrpglyglnglythrleuvalthrvalserala1510<210>9<211>106<212>prt<213>人工序列<400>9alaaspalaalaprothrvalserilepheproproserserglugln151015leuthrserglyglyalaservalvalcyspheleuasnasnphetyr202530prolysaspileasnvallystrplysileaspglysergluarggln354045asnglyvalleuasnsertrpthraspglnaspserlysaspserthr505560tyrsermetserserthrleuthrleuthrlysaspglutyrgluarg65707580hisasnsertyrthrcysglualathrhislysthrserthrserpro859095ilevallysserpheasnargasnglucys100105<210>10<211>335<212>prt<213>人工序列<400>10alalysthrthrproproservaltyrproleualaproglycysgly151015aspthrthrglyserservalthrleuglycysleuvallysglytyr202530pheprogluservalthrvalthrtrpasnserglyserleuserser354045servalhisthrpheproalaleuleuglnserglyleutyrthrmet505560serserservalthrvalproserserthrtrpproserglnthrval65707580thrcysservalalahisproalaserserthrthrvalasplyslys859095leugluproserglyproileserthrileasnprocysproprocys100105110lysglucyshislyscysproalaproasnleugluglyglyproser115120125valpheilepheproproasnilelysaspvalleumetileserleu130135140thrprolysvalthrcysvalvalvalaspvalsergluaspasppro145150155160aspvalglnilesertrpphevalasnasnvalgluvalhisthrala165170175glnthrglnthrhisarggluasptyrasnserthrileargvalval180185190seralaleuproileglnhisglnasptrpmetserglylysgluphe195200205lyscyslysvalasnasnlysaspleuproserproilegluargthr210215220ileserlysilelysglyleuvalargalaproglnvaltyrvalleu225230235240proproproglugluglumetthrlyslysaspvalserleuthrcys245250255leuvalvalglypheasnproglyaspileservalglutrpthrser260265270asnglyhisthrglugluasntyrlysasnthrgluprovalleuasp275280285seraspglysertyrphemettyrserlysleuasnmetlysthrser290295300lystrpglulysthraspserphesercysasnvalarghisglugly305310315320leulysasntyrtyrleulyslysthrileserargserprogly325330335<210>11<211>114<212>prt<213>人工序列<400>11aspilevalmetthrglnserproserserleuthrvalthralagly151015glulysvalthrmetsercyslysserserglnserilevalasnser202530glyserglnlysasptyrleuthrtrptyrglnglnlysproglygln354045serprolysleuleuiletyrglyalaserserargaspserglyval505560proaspargphethrglyserglyserglythraspphethrleuthr65707580ileserservalglnalagluaspleualavaltyrtyrcyslysgln859095asptyrsertyrproilethrpheglyalaglythrlysleugluleu100105110lysarg<210>12<211>220<212>prt<213>人工序列<400>12aspilevalmetthrglnserproserserleuthrvalthralagly151015glulysvalthrmetsercyslysserserglnserilevalasnser202530glyserglnlysasptyrleuthrtrptyrglnglnlysproglygln354045serprolysleuleuiletyrglyalaserserargaspserglyval505560proaspargphethrglyserglyserglythraspphethrleuthr65707580ileserservalglnalagluaspleualavaltyrtyrcyslysgln859095asptyrsertyrproilethrpheglyalaglythrlysleugluleu100105110lysargalaaspalaalaprothrvalserilepheproproserser115120125gluglnleuthrserglyglyalaservalvalcyspheleuasnasn130135140phetyrprolysaspileasnvallystrplysileaspglyserglu145150155160ar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