淀粉样六肽及其广谱抑制细菌和真菌生物膜的应用的制作方法

本发明涉及淀粉样六肽及其广谱抑制细菌和真菌生物膜的应用，属于生物制药领域。

背景技术：

人类约60％细菌性疾病是由生物膜引起的，细菌形成生物膜后极大的增强了对外界环境的抵抗能力。目前临床上可用于控制生物膜的药物均为杀菌剂，包括洗必泰、抗生素等，长期使用杀菌剂可造成体内菌群失调，使细菌产生耐药，导致全身疾病。而目前尚无任何有效的单纯抗生物膜而不杀菌的药物，因此，有待寻找新型的抗生物膜而不杀菌的药物。

多肽类具有合成简单、毒性小、药效快及免疫原性低等特点，近年受到越来越广泛的关注。但目前研究的肽抑制剂，包括抗菌肽等，多具有杀菌作用，通过减少细菌数量来减少细菌生物膜的形成，存在效率低、不能杀死生物膜内部的“休眠菌”、可能导致细菌耐药等缺陷。因此，目前的抗菌肽并非理想的抗生物膜制剂。

2012年chu等在《science》上首次报道，人小肠潘氏细胞分泌的防御肽6(32个氨基酸组成)，通过形成淀粉样纤维包裹细菌，抑制其生物膜形成，且防御肽6无杀菌作用。随后，2016年kumar等发现淀粉样多肽aβ单体(42个氨基酸组成)可结合到细菌膜上，逐渐聚合成淀粉样纤维包裹细菌，起到阻止细菌侵袭的作用。可见，淀粉样多肽可能成为新型的抗生物膜而不杀菌的制剂。但以上两种多肽长度较长，体外合成较困难，花费成本高，且淀粉样多肽aβ属于阿尔兹海默症的致病蛋白，不适宜临床应用。如肽段越短，则合成越简单，越节约成本。因此，有必要寻找高效、价廉、毒性小的新型淀粉样肽制剂。

研究表明，4-7个氨基酸组成的短肽是形成淀粉样纤维的最小结构。bednarska等认为，从细菌蛋白质组中寻找淀粉样肽抑制剂，可能起到更强的效果。变异链球菌是公认的致龋菌，其表面含有淀粉样纤维结构，pac蛋白的c123段(由487个氨基酸组成)是变异链球菌淀粉样纤维的组成蛋白。因此，为寻找更高效的抗生物膜而不杀菌的淀粉样多肽，我们从变异链球菌淀粉样组成蛋白-pac蛋白c123段出发，寻找可抑制细菌生物膜形成的淀粉样短肽抑制剂。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种具有抑制细菌生物膜形成和不杀菌作用的淀粉样六肽。

本发明的另一目的是提供所述淀粉样六肽在制备抑制生物膜形成的药物中的应用。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种淀粉样六肽，所述淀粉样六肽在体外可聚合成淀粉样纤维。

优选地，所述淀粉样六肽的氨基酸序列包括ala-ser-asn-ile-val-ile、thr-ser-phe-val-leu-val、gly-ile-asp-leu-lys-ile、phe-ala-lys-val-asp-ile、ile-ala-val-gly-thr-phe，其对应的氨基酸缩写分别为现asnivi、tsfvlv、gidlki、fakvdi、iavgtf。

本发明所述的淀粉样六肽的具体特征：六肽，可用zipperdb、tango和waltz等淀粉样纤维预测软件预测具有形成淀粉样纤维能力；合成时通过n端乙酰化和c端酰胺化修饰；体外证实可形成刚性淀粉样纤维；可广谱抑制细菌、真菌生物膜的形成，包括革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和真菌；通过形成淀粉样纤维包裹细菌或真菌，阻止生物膜形成；不杀菌；对细胞毒性小或无毒性。

另一方面，本发明还提供所述的淀粉样六肽在制备抑制生物膜形成的药物中的应用。

作为本发明所述应用的一种优选实施方式，所述淀粉样六肽用于抑制革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和真菌生物膜的形成。所述淀粉样六肽具有广谱抗生物膜形成的作用，且不具有杀菌作用。

作为本发明所述应用的一种优选实施方式，所述淀粉样六肽用于形成淀粉样纤维包裹细菌和真菌。

作为本发明所述应用的一种优选实施方式，所述革兰氏阳性菌包括变链菌、血链球菌和金黄色葡萄球菌；革兰氏阴性菌包括大肠杆菌；真菌包括白色念珠菌。

作为本发明所述应用的一种优选实施方式，所述淀粉样六肽对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和真菌无杀菌作用。

再一方面，本发明还提供一种抑制生物膜形成的药物，所述药物含有本发明所述的淀粉样六肽。

作为本发明所述药物的一种优选实施方式，所述药物还含有药学上可接受的载体。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：本发明所述的淀粉样六肽在体外可聚合成淀粉样纤维，可通过形成淀粉样纤维包裹细菌或真菌，起到广谱抑制细菌、真菌生物膜的形成，包括革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和真菌，但不杀菌，对细胞毒性小或无毒性，不会造成细菌耐药，有望成为新型的高效抗生物膜形成的廉价药物。

附图说明

图1为表1编号为p1-p13的六肽体外聚合，经tem观察能否形成淀粉样纤维的结果示意图。

图2为淀粉样六肽对生物膜形成和游离菌增殖的影响结果图。

图3为淀粉样六肽形成淀粉样纤维包裹变链菌透射电镜和扫描电镜观察图。

图4为淀粉样六肽对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和真菌的生物膜形成的抑制结果图。

图5为淀粉样六肽对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和真菌游离菌增殖的影响结果图。

图6为六肽对人口腔粘膜上皮角化细胞(normaloralkeratinocyte，nok)形态及增殖的影响结果图。

图7为其他物种来源的淀粉样六肽对变链菌生物膜形成的影响结果图。

具体实施方式

为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。

实施例1

本实施例为本发明所述的在体外可聚合成淀粉样纤维的淀粉样六肽5条asnivi、tsfvlv、gidlki、fakvdi、iavgtf。通过淀粉样纤维预测软件预测，用zipperdb、tango和waltz三种淀粉样纤维预测软件预测c123序列中可形成淀粉样纤维的短肽段。筛选的淀粉样短肽需满足：至少有两个软件共同指向，且对应zipperdb的结合能<-23kcal/mol。并在体外经透射电镜观察，证实其可聚合成淀粉样纤维。

具体预测方法为：登陆pubmed，检索protein，输入streptococcusmutans，pac，下载氨基酸序列信息，筛选出c123段序列(1000-1486aa)。登陆zipperdb(http://services.mbi.ucla.edu/zipperdb)，tango(http://tango.crg.es)和waltz(http://waltz.switchlab.org)网站，输入c123序列，得到预测的c123段可形成淀粉样纤维的序列。综合以上三种软件预测特点，选取waltz或tango可与zipperdb交集的短肽，且zipperdb显示rosettaenergy<-23kcal/mol。

预测筛选结果：根据筛选条件筛选出14条淀粉样短肽，且均为六肽，在体外成功合成13条，合成时通过n端乙酰化c端酰胺化保护六肽，模仿其在母体中状态，具体序列见表1。

采用固相合成法合成上述六肽，具体方法如下：步骤1：选择400mg改性树脂开始合成多肽，加入反应器20％pip/dmf，振荡反应器20min；步骤2：过滤除去溶剂，向体系加满dmf，振荡反应器1min，过滤除去液体，该操作进行三次；步骤3：取150ul加入苯酚的乙醇溶液、茚三酮的乙醇溶液和一勺树脂加入到检测管中，将检测管放入100℃下20s，查看树脂是否有颜色变化，如果颜色改变，则表示fmoc脱除成功将配置好的相应的氨基酸溶液加入到反应器中，并将其记录在记录表中，加入1mldic/dmf溶液，反应器振荡1h。步骤3中，如果颜色没有发生变化，表示偶联成功，则重复步骤2对树脂进行洗涤。重复以上步骤，加入相应的氨基酸至多肽合成完毕。

表1zipperdb、tango和waltz软件预测的pac蛋白c123序列中的六肽

上述表1中，预测的六肽以zipperdb显示的结合能(rosettaenergy)排序，rosettaenergy数值<-23代表具有淀粉样纤维形成能力，数值越低代表预测形成淀粉样纤维能力越强。

实验例1

本实验例为本发明表1中编号p1-p13的六肽是否能形成淀粉样纤维的验证及能形成淀粉样纤维的六肽抑制生物膜的形成但不杀菌的效果的验证。

材料：(1)六肽的储存与使用，六肽以冻干粉的形式长期储存，分装1mg/管。每次取出1mg，先用100ul的dmso溶解，加入900ul双蒸水，调整浓度为1mg/ml，于-20℃冰箱作为母液临时储存。使用时，母液加入培养基稀释至不同浓度(0.1mg/ml，0.05mg/ml，0.025mg/ml和0.0125mg/ml)，对照组为含有相同浓度dmso的不加淀粉样六肽的培养基，用于游离菌和生物膜的培养。(2)细菌培养：变异链球菌与血链球菌游离菌培养条件为：脑心浸润液培养基(bhi,brain-heartinfusion，bhi)，37℃，5％co2，10％h2，85％n2，16-18h；生物膜培养条件为：bhi+1％蔗糖(简称bhis)，37℃，5％co2，10％h2，85％n2，24h。大肠杆菌游离菌培养条件为：溶源性肉汤培养基(lysogenybroth，lb)，37℃，常氧，16-18h；生物膜培养条件为：0.5g/l酵母提取物(yeastextract)+10g/l酪蛋白氨基酸(casaminoacids)，37℃，常氧，24h。金黄色葡萄球菌游离菌培养条件为：胰蛋白胨大豆肉汤(trypticasesoybroth，tsb)，37℃，常氧，16-18h；生物膜培养条件为：tsb+3％nacl+0.5％葡萄糖(简称tsbng)，37℃，常氧，24h。白色念珠菌游离菌培养条件为：沙保氏培养基(salouraudliquidmedium，slm)，37℃，常氧，16-18h；生物膜培养条件为：90％人工唾液+10％胎牛血清+1％蔗糖37℃，常氧，24h。

实验方法：

(1)六肽体外聚合成淀粉样纤维的验证：取六肽母液，用双蒸水稀释成0.05mg/ml，于ph＝3，60℃下，使表1的13条六肽在体体外聚合24h，保证有聚合成淀粉样纤维能力的六肽能完全聚合。聚合结束后，取10ul溶液，滴至200目带碳膜的铜网上，吸附2min，吸取溶液，3％的磷钨酸负染2min，吸去负染液。透射电镜下观察六肽聚合成淀粉样纤维的形貌。可聚合成长的刚直状淀粉样纤维的六肽称为淀粉样六肽，不能聚合成淀粉样纤维的六肽称为非淀粉样六肽。实验结果如图1所示。

(2)淀粉样六肽对游离菌增殖和生物膜量的作用：不同浓度(0.1mg/ml，0.05mg/ml，0.025mg/ml和0.0125mg/ml)淀粉样六肽或非淀粉样六肽单体溶液加入上述细菌游离菌和生物膜的培养基中，培养至相应的时间点(游离菌培养16-18h，生物膜培养24h)，观察对游离菌增殖和生物膜形成量的影响。游离菌增殖检测：酶标仪检测od600和点板计数，实验结果如图2所示。

(3)扫描电镜观察淀粉样六肽/非淀粉样六肽对变异链球菌生物膜形貌的影响：变异链球菌生物膜培养时加入0.05mg/ml的淀粉样六肽或非淀粉样六肽，培养至6h和24h。2.5％的戊二醛前固定3h，30％至无水乙醇依次脱水，叔丁醇固定3次，10min/次，六甲基硅烷冷冻干燥3h以上，喷金，扫描电镜下观察形貌。结果如图3所示。

(4)淀粉样六肽对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和真菌的生物膜形成的抑制作用：随机选取其中3条淀粉样六肽(asnivi，tsfvlv和gidlki)，和3条非淀粉样六肽(yssntv，liggii和tyssnt)作为对照，研究其对血链球菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和白色念珠菌等革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和真菌的生物膜形成的抑制作用，结果如图4所示，透射电镜图片仅展示tsfvlv(p3)和liggii(p8)的结果。

(5)淀粉样六肽对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和真菌游离菌增殖的影响：选取其中3条淀粉样六肽(asnivi，tsfvlv和gidlki)，和3条非淀粉样六肽(yssntv，liggii和tyssnt)作为对照，研究其对血链球菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和白色念珠菌等革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和真菌游离菌增殖的影响，结果如图5所示，透射电镜图片仅展示tsfvlv(p3)和liggii(p8)的结果。

(6)淀粉样六肽或非淀粉样六肽对细胞毒性的影响：培养人口腔粘膜角化上皮细胞细胞，以8000个/孔接种于96孔板中，培养基中加入淀粉样六肽或非淀粉样六肽，于37℃常氧培养48h。倒置显微镜观察细胞形貌；cellcountingkit-8试剂盒检测细胞贴壁增殖情况，结果如图6所示。

(7)其它物种来源六肽对变链菌生物膜和游离菌的作用：为探究是否其他物种来源的淀粉样六肽也具有抑制生物膜形成但不杀菌的特性，我们用zipperdb查找人、鼠和hiv病毒来源的六肽，挑选zipperdb上显示的上述物种的第一个预测的蛋白序列中形成淀粉样纤维能力最强的六肽，获得三条六肽(gqsiai、sshmcm、nqsvsi)，具体序列信息见表2。合成六肽时通过n端乙酰化和c端酰胺化修饰，体外验证上述三条六肽是否能形成淀粉样纤维，透射电镜观察。六肽加入变链菌游离菌和生物膜培养基中，终浓度为0.05mg/ml，观察对游离菌增殖和生物膜量的影响，结果如图7所示。

表2其它物种来源的六肽

实验结果：

(1)六肽体外聚合成淀粉样纤维的验证结果：表1的13条六肽中，发现p1(asnivi)、p3(tsfvlv)、p6(gidlki)、p7(fakvdi)和p13(iavgtf)这5条六肽可体外形成刚性淀粉样纤维，称为淀粉样六肽，其淀粉样纤维的模式图如图1所示。由图1可知：图1a：zipperdb预测的六肽聚合成淀粉样纤维的模式图(冠状面)，六肽聚合成淀粉样纤维为表1中的p3(tsfvlv)；图1b：zipperdb预测的六肽聚合成淀粉样纤维的模式图(横断面)，六肽聚合成淀粉样纤维为表1中的p3(tsfvlv)；图1c-图1o为表1中的p1-p13体外聚合，tem观察聚合情况，可知p1(asnivi)、p3(tsfvlv)、p6(gidlki)、p7(fakvdi)和p13(iavgtf)在体外聚合成淀粉样纤维，其它六肽未见形成淀粉样纤维。

(2)淀粉样六肽对游离菌增殖和生物膜量的作用：发现5条淀粉样六肽p1(asnivi)、p3(tsfvlv)、p6(gidlki)、p7(fakvdi)和p13(iavgtf)在0.0125mg/ml-0.1mg/ml时均具有抑制变异链球菌生物膜形成的作用，且不具有杀变异链球菌的作用。图2a：13条六肽对变链菌生物膜形成的影响：与对照组相比，p1、p3、p6、p7和p13可抑制变链菌生物膜的形成，作用效果呈浓度依赖性(p<0.05)，其他六肽对变链菌生物膜形成无明显影响(p>0.05)。图2b：13条六肽对游离变链菌增殖的影响，可见13条六肽均不影响游离变链菌的增殖。图2c：点板计数结果显示13条六肽不影响游离变链菌的活菌数。

(3)扫描电镜观察淀粉样六肽/非淀粉样六肽对变异链球菌生物膜形貌的影响：透射电镜和扫描电镜下可见淀粉样六肽形成淀粉样纤维包裹变链菌。图3显示，图3a-图3c：肉眼观察对照组、p3组、p8组24h生物膜形成情况，可见对照组和p8组形成稳定贴壁的生物膜，p3组形成絮状物质漂浮在培养基中。图3d-图3f：透射电镜观察对照组、p3组、p8组24h时变链菌生物膜形貌，可见p3组变链菌周围出现大量淀粉样纤维包裹变链菌。图3g-图3i：扫描电镜观察对照组、p3组、p8组6h时变链菌生物膜形貌，可见6h时p3即形成淀粉样纤维包裹变链菌生物膜。图3j-图3l：扫描电镜观察对照组、p3组、p8组24h时变链菌生物膜形貌，可见对照组和p8组形成变链菌生物膜团块，p3组变链菌被大量淀粉样纤维包裹。

(4)淀粉样六肽对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和真菌的生物膜形成的抑制作用：图4显示与对照组(control)和非淀粉样六肽组(p8)相比，淀粉样六肽(p3)具有广谱抗生物膜的作用，可通过形成淀粉样纤维包裹细菌，抑制血链球菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和白色念珠菌等革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和真菌等生物膜形成。

(5)淀粉样六肽对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和真菌游离菌增殖的影响：图5a：与对照组(control)和非淀粉样六肽组(p8)相比，淀粉样六肽(p3)可通过形成淀粉样纤维包裹细菌游离菌。图5b：淀粉样六肽对变异链球菌、血链球菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和白色念珠菌等不具有杀菌作用。

(6)淀粉样六肽或非淀粉样六肽对细胞毒性的影响，图6：淀粉样六肽对人口腔粘膜上皮角化细胞(normaloralkeratinocyte，nok)形态及增殖的影响。图6a：对照组nok贴壁，有触角；图6b：p1组，nok变圆顿，无触角；图6c：p3组，nok变圆顿，无触角；图6d：p6组，nok贴壁，有触角；图6e：p5组，nok贴壁，有触角；图6f：p8组，nok贴壁，有触角；图6g：p9组，nok贴壁，有触角。图6h：细胞计数实验(cck-8)结果显示p1和p3组贴壁细胞量较对照组减少(p<0.05)，p6组贴壁细胞量较对照组无统计学差异。说明，部分淀粉样六肽无细胞毒性。

(7)其它物种来源六肽对变链菌生物膜和游离菌的作用：发现具有淀粉样纤维形成能力的六肽(gqsiai)同样可抑制细菌生物膜的形成而不杀菌，说明淀粉样六肽的作用与物种来源无关。图7a-图7c：透射电镜观察其它物种来源的六肽(gqsiai、sshmcm、nqsvsi)是否聚合成淀粉样纤维，可见gqsiai可聚合成淀粉样纤维。图7d：gqsiai、sshmcm、nqsvsi对变链菌生物膜形成的影响，可见淀粉样六肽gqsiai可抑制变链菌生物膜的形成(p<0.01)。图7e：透射电镜观察淀粉样六肽gqsiai聚合成淀粉样纤维包裹变链菌。图7f：其它物种来源的3条六肽对游离变链菌增殖均无影响。

综上所述，本发明所述的淀粉样六肽的具体特征：六肽；可用zipperdb、tango和waltz等淀粉样纤维预测软件预测具有形成淀粉样纤维能力；合成时通过n端乙酰化和c端酰胺化修饰；体外证实可形成刚性淀粉样纤维；可通过形成淀粉样纤维包裹细菌或真菌，实现广谱抑制细菌、真菌生物膜的形成，包括革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和真菌；不杀菌；对细胞毒性小或无毒性。本发明所述的淀粉样六肽有广谱抗生物膜形成的作用，且不杀菌，不会造成耐药，细胞毒性小，有望成为新型的高效抗生物膜形成的廉价药物。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

sequencelisting

<110>中山大学附属口腔医院

<120>淀粉样六肽及其广谱抑制细菌和真菌生物膜的应用

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