miRNA在制备用于检测KSHV潜伏感染的试剂盒中的用途的制作方法

本发明属于医学生物技术领域，具体地，涉及mirna在制备用于检测kshv潜伏感染的试剂盒中的用途。

背景技术：

卡波氏肉瘤(kaposi’ssarcoma，ks)是一种病变多发生在软组织内的以内皮细胞为主要来源的恶性肿瘤。根据流行病学和临床特征ks可以分为经典型、艾滋病相关型(aids-ks)、免疫抑制型和非洲地方型。在我国经典型ks主要发生于新疆维吾尔族和哈萨克族。

ks发病的病原学基础是卡波氏肉瘤相关疱疹病毒(kaposisarcoma-associatedherpesvirus，kshv)，也叫人疱疹病毒8型(hhv-8)的感染，由chang等首先从aids-ks患者的肉瘤组织中发现。随后，在各型的ks中均发现了kshv的高表达。研究发现kshv是卡波氏肉瘤发生的必需因素和主要因素，与ks的发生关系密切。

kshv感染细胞后以两种方式存在，即持续的潜伏感染和短暂的裂解感染。对于潜伏感染，往往很难做到精确检测。

mirna是一类长约23个核苷酸非编码的小分子rna。它广泛存在于多细胞生物中。mirna通过基因转录后与靶mrna3’utr互补结合，使靶mrna降解或抑制蛋白质翻译。它们参与信号转导、增殖、凋亡、侵袭或肿瘤血管形成。在肿瘤学、病毒学、神经生物学、胚胎发育等领域有许多成熟研究。

然而，目前尚缺乏利用mirna检测kshv潜伏感染的研究和应用。

技术实现要素：

本发明目的在于解决上述技术问题，而提供mirna在制备kshv潜伏感染检测试剂盒中的用途。本发明利用4例经典型ks患者的肿瘤组织和瘤旁正常组织进行了microrna芯片的筛选，进一步通过rt-qpcr验证，意外地发现mir-485-5p和mir-155可以作为检测kshv潜伏感染的标志物，从而完成本发明。

本发明一方面提供mirna在制备用于检测kshv潜伏感染的试剂盒中的用途，所述mirna选自mir-155和mir-485-5p中的至少一种。

在本发明的一些实施方案中，所述mirna选自mir-155和mir-485-5p中两种。

在本发明的一些实施方案中，所述mirna来源于外周血。

本发明第二方面提供用于定量检测mirna表达量的试剂在制备用于检测kshv潜伏感染的试剂盒中的用途，其中，所述mirna选自mir-155和mir-485-5p中的至少一种。

在本发明的一些实施方案中，所述mirna选自mir-155和mir-485-5p中两种。

在本发明的一些实施方案中，所述表达量是指所述mirna在外周血中的表达量。

在本发明的一些实施方案中，所述用于定量检测mirna表达量的试剂为实时荧光定量pcr相关试剂。在本发明的另一些实施方案中，所述用于定量检测mirna表达量的试剂为mirna测序试剂。

本发明第三方面提供一种用于检测kshv潜伏感染的试剂盒，所述试剂盒包括用于定量检测mirna表达量的试剂，其中，所述mirna选自mir-155和mir-485-5p中的至少一种。

在本发明的一些实施方案中，所述用于定量检测mirna表达量的试剂为实时荧光定量pcr相关试剂。在本发明的一些具体实施方案中，所述实时荧光定量pcr相关试剂包括能够特异性扩增所述mirna的反转录产物的引物组合。在本发明的一些优选实施方案中，能够特异性扩增mir-485-5p的引物组合包括具有seqidno.5所示核苷酸序列的上游引物和具有seqidno.6所示核苷酸序列的下游引物；能够特异性扩增mir-155的引物组合包括具有seqidno.9所示核苷酸序列的上游引物和具有seqidno.10所示核苷酸序列的下游引物。

在本发明的一些具体实施方案中，所述实时荧光定量pcr相关试剂还包括荧光染料。在本发明的另一些具体实施方案中，所述实时荧光定量pcr相关试剂还包括能够特异性与所述mirna的反转录产物杂交的探针。

在本发明的另一些实施方案中，所述用于定量检测mirna表达量的试剂为mirna测序试剂。

本发明的有益效果

相对于现有技术，本发明至少具有以下技术效果：

1.本发明可以在kshv潜伏感染阶段检测出来，从而实验早期干预，具有重要的临床应用价值。

2.本发明利用患者外周血即可进行检测，无创、方便、快捷。

3.本发明提供了检测kshv潜伏感染新的标志物，适用于临床，能够为临床上治疗kshv提供更好的辅助。

附图说明

图1示出了感染kshv的细胞中mir-485-5p、mir-374a-5p和mir-155相对未感染kshv的细胞中的表达水平。bac代表islk-bac细胞，219代表islk-219细胞。

图2示出了ks患者、kshv阳性患者中mir-485-5p、mir-374a-5p和mir-155相对于健康对照的表达水平。

图3示出了mir-155在ks患者和健康对照者之间roc曲线分析结果。

图4示出了mir-485-5p在ks患者和健康对照者之间roc曲线分析结果。

图5示出了mir-155和mir-485-5p联合在ks患者和健康对照者(kshv阴性)之间的roc曲线分析结果。

图6示出了mir-155在kshv阳性患者和健康对照者之间roc曲线分析结果。

图7示出了mir-485-5p在kshv阳性患者和健康对照者之间roc曲线分析结果。

图8示出了mir-155和mir-485-5p联合检测在kshv阳性个体和健康对照者(kshv阴性)之间的roc曲线分析结果。

具体实施方式

为了使本发明所解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。

实施例

以下例子在此用于示范本发明的优选实施方案。本领域内的技术人员会明白，下述例子中披露的技术代表发明人发现的可以用于实施本发明的技术，因此可以视为实施本发明的优选方案。但是本领域内的技术人员根据本说明书应该明白，这里所公开的特定实施例可以做很多修改，仍然能得到相同的或者类似的结果，而非背离本发明的精神或范围。

除非另有定义，所有在此使用的技术和科学的术语，和本发明所属领域内的技术人员所通常理解的意思相同，在此公开引用及他们引用的材料都将以引用的方式被并入。

那些本领域内的技术人员将意识到或者通过常规试验就能了解许多这里所描述的发明的特定实施方案的许多等同技术。这些等同将被包含在权利要求书中。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的仪器设备，如无特殊说明，均为实验室常规仪器设备；下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

实施例1mirna芯片分析

1组织样本收集

收集在新疆维吾尔自治区第六人民医院就诊的14例卡波氏肉瘤患者(ks患者)肿瘤组织和瘤旁正常组织，手术切除后立即放在液氮中储存，所有标本均经过组织学检查确诊卡波氏肉瘤，所有标本均行鼠单克隆抗体hhv-8[ln35](1:50；abcam，剑桥，英国)进行免疫组化实验。同时，抽取ks患者和kshv潜伏感染患者(kshv阳性)外周血样本，另抽取10例健康个体(kshv阴性)作为对照。其中，潜伏感染患者是通过检测kshv潜伏期蛋白lana和裂解期蛋白rta确定的，本发明中，共有17例患者经检测lana蛋白表达而rta蛋白不表达，从而确定为kshv潜伏感染。

卡波氏肉瘤肿瘤和瘤旁组织(共28例样本)用于mirna芯片分析，外周血样本(ks患者14例，kshv潜伏感染患者17例，健康个体10例)用于rt-qpcr分析。

2组织标本取材

(1)征求患者同意并签字后，所有患者均皮损区域拍照后详细留取疾病信息后在活检室进行皮肤活检术。

(2)常规消毒皮肤，局部麻醉后数分钟取材。

(3)以利刀作棱形切口，刀应与皮肤垂直，切口的方向应于皮纹一致。

(4)切口应深达皮下组织，取肿瘤组织2cm长，0.5cm宽，并切取瘤旁正常组织，留取0.5cm×0.5cm大小的肿瘤组织放入10％甲醛固定液中行病理诊断，剩余肿瘤组织及瘤旁组织分别放入冷存管中，放入液氮中存储。并作相应标记。

(5)尽量不损伤组织以免影响标本质量。

(6)缝合切口。

(7)5-7天拆线。

3mirna芯片分析

使用第七代mircurylna^tmarray(v.18.0)(exiqon，copenhagen，denmark)包括3100个捕获探针，覆盖了所有的人类、鼠以及所有病毒的mirna，此外，还包含有25个mirplus^tm人类mirna。

3.1rna提取

①组织样本匀浆

先使用biopulverizer粉碎机冰冻粉碎组织样本，再用mini-bead-beater-16对粉碎的组织样本进行匀浆。

②两相分离：首先匀浆的组织样本在室温下孵育5min，然后1ml样本中加入0.2ml氯仿，剧烈振荡15sec，室温孵育3min。4℃12,000×g离心15min。

③沉淀rna：将上层水相转移到新的离心管中，然后向新离心管中加入1.5倍体积的100％酒精，上下颠倒离心管使其彻底混匀。

④吸取700μl样本，加入到2mlrneasyminispin收集柱中，室温≥8000×g离心15sec，弃上清液。如果液体大于700μl，吸取剩余的样品重复第④步，弃去上清液。

⑤向2mlrneasyminispin收集柱中加入700μlbufferrwt，室温≥8000×g离心15sec，弃上清液。

⑥再向rneasyminispin收集柱中加入500ulrpebuffer，室温≥8000×g离心15sec，弃上清液。

⑦把rneasyminispin收集柱转移到新的2ml离心管中，全速离心1min。

⑧把rneasyminispin收集柱转移到新的1.5ml离心管中，再向rneasyminispin收集柱的膜上直接加入无rna酶的水20μl，室温≥8000×g离心1min。。

⑨洗提的rna进行rna质量检测。

3.2rna质量检测

①紫外吸收测定法：使用nd-1000测定rna浓度和纯度

浓度测定：260nm处读值为1表示40ngrna/μl。样品rna浓度计算公式为：a260×40ng/μl。如rna溶于20μldepc水中，取1μl用于测定，测得a260＝65.003，那么rna浓度＝65.003×40ng/μl＝2600.12ng/μl。剩余样品rna为19μl，剩余rna总量为：19μl×2600.12ng/μl＝49.4μg。

纯度检测：a260/a280比值范围1.8到2.1，表示纯度纯。

4对ks肿瘤和瘤旁组织的总rna抽提和质检结果理想，总rna的a260/a280的值都介于1.8-2.1之间，a260/a230大于1.8。

②变性琼脂糖凝胶电泳

首先制备变性琼脂糖凝胶，取3μgrna样品与3倍体积的上样染液混匀，在上样染液中加入eb至终浓度为10μg/ml。加热混合的上样染液至70℃，孵育15min后，在琼脂糖凝胶上点样，5–6v/cm电压下电泳，当溴酚兰指示剂进胶2–3cm后，停止电泳，取出凝胶在紫外透射光下观察并拍照。

总rna的电泳带18s和28s均清晰，表明核酸成份完整，无降解，无蛋白质和有机溶剂等污染。

3.3标记mirna

试剂及试剂盒：mircurytmarraypowerlabelingkit(cat#208032-a，exiqon)

①冰上解冻除了酶之外的所有试剂15-20min，振荡混匀后轻微离心；

②按下表配制反应液，充分混匀，所有操作均在冰上操作；

③反应液37℃孵育30min；

④95℃终止反应后立即将反应管置于冰上2-15min，短暂离心；

⑤按下表配cip反应液，反应管中添加荧光标记试剂，充分混匀：

⑥反应管在16℃下避光孵育1h；

⑦反应管在65℃下孵育15min后终止标记反应，轻微离心后将反应管置于4℃冰箱。

3.4mirna芯片杂交

①按下表配制芯片杂交溶液：

②杂交溶液在95℃下避光孵育2min；

③孵育后冰上放置2-15min，混匀；

④取出盖玻片；

⑤将mircury^tm芯片置于盖玻片上，中间留有空隙，做成杂交室；

⑥将芯片和盖破片组成的杂交室装入3.1cm×9cm的热收缩杂交袋中。

⑦热收缩杂交袋开口用金属夹子夹紧，迅速将其浸入95℃热水中，杂交袋收缩并紧裹杂交室。

⑧取出热收缩杂交袋并擦干袋子外面的水，用剪刀剪掉杂交袋顶端的多余部分，然后将其放入50℃烘干箱烘干10min以上。

⑨从加样孔加入180ul杂交混合液，并用1×杂交缓冲液补充液体，加至液面距顶端约0.5cm处。

⑩将第二个热收缩杂交袋剪掉一半，垂直套在装有杂交室的第一个热收缩杂交袋上。

11)用镊子夹住杂交室顶端，整个垂直浸入95℃热水中。

12)将杂交室放入56℃烘干箱，置于摇床上过夜。

3.5芯片洗涤

杂交后，将芯片从杂交袋中取出，首先用洗液a在56℃下洗2min，然后用洗液b室温下轻轻的洗芯片，再用洗液b室温下洗芯片2min，然后用洗液c室温下洗芯片2mim，再用水清洗芯片，最后在1000rpm离心5min下甩干芯片，芯片干燥后立即进行芯片扫描。

3.6mirna芯片扫描和分析

使用axongenepix4000b芯片扫描仪对芯片进行图像扫描，再采用genepixprov6.0对芯片结果进行原始数据分析。

方法如下：

芯片上每个探针的绿色信号强度经过去背景化后，4个重复探针取其平均值。对数据采用中位数标准化的方法进行标准化处理，进而得到标准化后的数据，选取每张芯片上的修正值(前景值-背景值)都>＝50的非对照探针做标准化，以这部分探针中值作为标准化因子对整张芯片的点做标准化处理，即各个mirna修正值/中位值＝标准值。经过标准化后，采用t检验计算出差异表达的mirna。最后对差异表达的mirna芯片数据进行聚类分析和相关性分析。

3.7统计学分析

扫描的图像输入到genepixpro6.0软件，以达到网格校准和数据提取。平均重复mirnas，选择在所有样本中mirnas强度≥30的样本用于计算标准化因素。数据使用中位数进行标准化。在2组样本差异倍数大于2和p<0.05的mirna认为有统计学差异。

结果显示：在3100个mirna探针中，有185个差异表达的mirna，包括74个上调和111个下调的mirnas，最显著的上调mirnas是hsa-mir-485-5p、hsa-mir-155和has-mir-374a-5p(如下表所示)。

实施例2实时荧光定量pcr(rt-qpcr)验证

利用kshv分别感染细胞islk-bac和islk-219，检测感染后细胞中mir-485-5p、mir-374a-5p和mir-155的表达，利用未感染kshv细胞islk-puro作为对照。

同时，分别检测ks患者血清、kshv阳性患者(kshv潜伏感染)血清中mir-485-5p、mir-374a-5p和mir-155的表达，利用kshv阴性的健康个体作为对照。

mir-485-5p茎环引物序列(seqidno.1)：

5'-gtcgtatccagtgcagggtccgaggtattcgcactggatacgacgaattc-3'。

mir-374a-5p茎环引物序列(seqidno.2)：

5'-gtcgtatccagtgcagggtccgaggtattcgcactggatacgaccactta-3'。

mir-155茎环引物序列(seqidno.3)：

5'-ctcaactggtgtcgtggagtcggcaattcagttgagacccctat-3'。

内参u6茎环引物序列(seqidno.4)：

5'-cgcttcacgaatttgcgtgtcat-3'。

mir-485-5p实时荧光定量pcr引物：

上游：5'-cgagaggctggccgtgat-3'(seqidno.5)，

下游：5'-agtgcagggtccgaggtatt-3'(seqidno.6)。

mir-374a-5p实时荧光定量pcr引物：

上游：5'-cgcgcgttataatacaacctga-3'(seqidno.7)，

下游：5'-agtgcagggtccgaggtatt-3'(seqidno.8)。

mir-155实时荧光定量pcr引物：

上游：5'-acactccagctgggttaatgctaatcgtgat-3'(seqidno.9)，

下游：5'-ccagtgcagggtccgaggt-3'(seqidno.10)。

内参u6实时荧光定量pcr引物：

上游：5'-gcttcggcagcacatatactaaaat-3'(seqidno.11)，

下游：5'-cgcttcacgaatttgcgtgtcat-3'(seqidno.12)。

1样本中mirna的提取

①样本中加入裂解液mz，样本和裂解液mz各取200μl，在振荡器上充分混合振荡30sec。

②混匀后的溶液静置5min，此步骤目的是将核酸蛋白复合物充分分散。

③以下步骤在室温下操作，离心取上清放入无rnase的离心管中，转速设置为12,000rpm，离心10min。

④氯仿200μl，充分混匀，剧烈振荡15sec，室温静置5min。

⑤转速设置为12,000rpm，离心15min，rna在三层中的最上层，把上层rna转移到无rnase的离心管中，保存液体备用。

⑥在保存的液体中加入无水乙醇66μl，此时加入的无水乙醇约是总体积的1/4，在转入吸附柱mirspin前需保证溶液充分混合，有时溶液会出现沉淀，室温静置2min，转速设置为12,000rpm，离心15sec，离心后吸附柱mirspin丢弃，保存液体备用。

⑦在保存的液体中加入无水乙醇132μl，此时加入的无水乙醇约是总体积的1/2，在转入吸附柱mirelute前需保证溶液充分混合，有时溶液会出现沉淀，室温静置2min，转速设置为12,000rpm，离心时间30sec，离心后弃掉流出液，保留吸附柱mirspin。

⑧向吸附柱mirelute中加入500μl去蛋白液mrd，静置2min后离心，转速设置为12,000rpm，离心时间30sec，液体可弃去。

⑨漂洗液rw600μl，加入到吸附柱mirelute中，静置2min，转速设置为12,000rpm，离心时间30sec，弃废液。

⑩重复操作步骤⑨。

11)将吸附柱mirelute放入2ml收集管中，转速设置为12,000rpm，离心时间1min，去除残余液体。将吸附柱mirelute放在超净工作台上，静置片刻晾干。此步骤的目的是去掉吸附柱中的漂洗液。

12)取新的无rnase1.5ml离心管，将吸附柱mirelute放入其中，加无rnaseddh2o20μl，静置2min后离心，转速设置为12,000rpm，离心时间2min。

13)提取样本中的总srna，获得质量和纯度较好、片段大小在200bp以下的总srna。最后用核酸测定仪测定总srna的浓度和纯度，srna置于-80℃保存备用。

2rna逆转录

逆转录过程主要分为两步，此过程使用天根公司的第一链合成试剂盒(mircutemirnacdna)进行：

2.1mirna3’逆转录加poly(a)处理：

①冰上冷却无rnase反应管，反转录总体系为20μl。

②冷却10分钟，按顺序加入下表中试剂。

③最后加入e.colipoly(a)polymerase，用移液器轻混匀上述配置的反应液。

④反应管配平离心后，在培养箱内37℃静置反应60min，反应液直接用于后续实验，也可-20℃或静置-80℃保存，-80℃保存时间较长。

2.2poly(a)修饰的mirna进行逆转录反应：

①逆转录反应使用的是oligo(dt)-universaltag，此方法采用的是通用逆转录引物，在冰上冷却无rnase反应管，反转录总体系为20μl。

②冷却10min，按顺序加入下表中所示试剂。

③移液器充分混合反应，短暂离心后37℃60min静置反应，即生成cdna第一链，反应液-20℃储存备用。

④使用琼脂糖凝胶电泳来检测mirna的完整性。

3荧光定量检测

①进行荧光定量实验时选用tiangen公司的荧光定量检测试剂盒(fp401)。需要使用的材料为reverseprimer，2×mircutemirnapremix。

②上下轻微均匀混合颠倒2×mircutemirnapremix，防止气泡产生，否则影响实验，短暂轻微离心后使用。

③冰上冷却abi八连反应管，反转录总体系为20μl。

④预冷10min后，按下列参数进行。

⑤使用abi公司的7500fast荧光定量检测仪进行荧光定量检测，对样本进行3次重复测定。

⑥充分混合后离心30s，避免反应液起泡，使样品聚集到管的底部。将八连反应管放入7500fast荧光定量检测仪进行荧光定量检测。

⑦荧光定量按下列参数进行。溶解曲线分析：95℃15sec，60℃1min，95℃15sec(此时收集荧光信号)，60℃15min。

⑦采用u6rna作为内参，u6rna从天根公司购买，以u6rna的拷贝数作为校正基数，获得各样本的ct值，同样本中rna的ct值减去u6的ct值获得△ct值。以健康对照者血清中△ct的值作为校正基数，得出△△ct值，使用公式计算出各样本中的mirna的表达量。

4统计学分析

数据采用spss20.0软件进行统计分析，用均数±标准差表示测量数据，单因素方差分析比较mirna的组间差异性，p<0.05为差异有统计学意义。运用统计软件对检测结果作图，对结果进行受试者工作特征曲(receiveroperatingcharacteristiccurve，roc曲线)分析，横坐标为1－特异性，纵坐标为敏感性，计算曲线下面积auc(areaunderthecurve，auc)，auc>0.9表示诊断确切性较高，auc＝0.7-0.9为诊断确切性较好，auc＝0.5-0.7为诊断确切性较低，auc<0.5为无诊断价值。

使用荧光定量pcr检测到样本的循环数阈值与荧光信号阈值的扩增图形，曲线扩增显示目的样本扩增良好，样本三次重复显示重复性良好。

荧光定量pcr检测结果如下：

(1)kshv感染细胞后mirna表达水平

结果显示(如图1)：相对于没有kshv感染的细胞，kshv感染的细胞中，三种mirna均不同程度地表达升高。其中，相对于不同细胞系，感染kshv的islk-219细胞中三种mirna表达升高显著高于感染kshv的islk-bac细胞。而在同一细胞系中，mir-155相对表达量最高，而mir-347a-5p相对表达量升高不明显。

(2)ks患者、kshv阳性患者中mirna表达水平

结果显示(如图2)：相对于kshv阴性血清，(1)ks患者和kshv阳性患者血清中mir-155和mir-485-5p均出现高表达现象，其中mir-155相对表达量最高，而mir-347a-5p相对表达量与对照并无显著性差异。(2)ks患者血清中，相对于kshv阳性血清中，mir-155和mir-485-5p相对表达水平更高。

roc曲线分析结果如下：

(1)ks患者和健康对照者roc曲线分析

mir-155和mir-485-5p在ks患者和健康对照者(kshv阴性)之间的roc曲线分析结果分别见图3和图4，mir-155的auc达到0.991，敏感性和特异性分别为96.7％和93.3％，说明mir-155能够很好地区分ks患者和健康对照者，从而对ks进行确诊；mir-485-5p在kshv阳性血清和kshv阴性血清对照者的roc曲线分析显示，auc为0.980，敏感性和特异性分别为90.0％和100％，说明mir-485-5p同样在ks患者和健康对照者之间有一定的诊断确切性。

mir-155和mir-485-5p联合在ks患者和健康对照者(kshv阴性)之间的roc曲线分析结果见图5，auc达到0.996，敏感性和特异性分别为100％和93.3％，说明mir-155和mir-485-5p联合检测能够更好地区分ks患者和健康对照者，从而对ks进行确诊。

(2)kshv阳性患者和健康对照者roc曲线分析

mir-155和mir-485-5p在kshv阳性个体和健康对照者(kshv阴性)之间的roc曲线分析结果分别见图6和图7，mir-155的auc达到0.969，敏感性和特异性分别为93.3％和86.7％，说明mir-155可以作为kshv潜伏感染的检测标志物；mir-485-5p在kshv阳性血清和kshv阴性血清对照者的roc曲线分析显示，auc为0.931，敏感性和特异性分别为86.7％和86.7％，说明mir-485-5p同样可以作为kshv潜伏感染的检测标志物。

mir-155和mir-485-5p联合检测在kshv阳性个体和健康对照者(kshv阴性)之间的roc曲线分析结果分别见图8。auc达到0.984，敏感性和特异性分别为96.7％和93.3％，说明mir-155和mir-485-5p同时作为kshv潜伏感染的检测标志物，检测效果更好。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110>石河子大学

<120>mirna在制备用于检测kshv潜伏感染的试剂盒中的用途

<130>xy-2019-1-w-088

<160>12

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>50

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

gtcgtatccagtgcagggtccgaggtattcgcactggatacgacgaattc50

<210>2

<211>50

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

gtcgtatccagtgcagggtccgaggtattcgcactggatacgaccactta50

<210>3

<211>44

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

ctcaactggtgtcgtggagtcggcaattcagttgagacccctat44

<210>4

<211>23

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

cgcttcacgaatttgcgtgtcat23

<210>5

<211>18

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>5

cgagaggctggccgtgat18

<210>6

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>6

agtgcagggtccgaggtatt20

<210>7

<211>22

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>7

cgcgcgttataatacaacctga22

<210>8

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>8

agtgcagggtccgaggtatt20

<210>9

<211>31

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>9

acactccagctgggttaatgctaatcgtgat31

<210>10

<211>19

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>10

ccagtgcagggtccgaggt19

<210>11

<211>25

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<213>人工序列(artificialsequence)

<400>11

gcttcggcagcacatatactaaaat25

<210>12

<211>23

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<213>人工序列(artificialsequence)

<400>12

cgcttcacgaatttgcgtgtcat23