特发性肺纤维化疾病诊断标志物及其制备诊断或预后工具中的应用的制作方法

本发明属于医学诊断技术领域，具体涉及一种特发性肺纤维化疾病诊断标志物及其制备诊断或预后工具中的应用。

背景技术：

特发性肺纤维化（ipf）是一种慢性进行性致死疾病，其病理学特点为肺实质破坏、肺泡上皮细胞表型显著变化、细胞外基质的沉积以及成纤维细胞异常增殖与积累。现在已知200多种原因可以引起特发性肺纤维化，如遗传性疾病、自身免疫性疾病、暴露于环境中有毒物质、药物和放射等。越来越多的证据表明，在肺纤维化的发生发展过程中，不仅广泛存在着个体间异质性（inter-heterogeneity）和个体内组织细胞的异质性（intra-heterogeneity），而且还广泛存在着个体在细胞和分子等各种层次的动态变化。当前对肺纤维化的发病机制研究发现与线粒体功能障碍密切相关。利用蛋白质组学的技术能更好地全面解析复杂疾病的机制、筛选疾病标志物、研究药物作用靶点、筛选特殊功能蛋白质等。已有的组学研究发现肺纤维化患者的血清中ccna2、pbmc、cd28等的异常表达，蛋白质修饰主要体现在cdkn2b、car10、mgmt等的甲基化和casz1的超甲基化等，代谢组学结果表明腺苷三磷酸降解途径、糖酵解途径、谷胱甘肽生物合成途径和鸟氨酸转氨酶途径中均发生了明显的变化。据统计，全球每年约新增特发性肺纤维化患者500万人，预后较差，诊断后中位生存期为2-3年。特发性肺纤维化的病因不明确、诊断易混淆等特点，在临床上用于诊断特发性肺纤维化的手段往往缺乏特异性，迫切需要更高效、稳定的手段来预警或判断特发性肺纤维化。因此开发一种可用于准确诊断ipf的方法是亟待解决的问题。

细胞色素c氧化酶（cox）是线粒体呼吸链的末端酶。它是一种多亚基酶复合物，可将电子从细胞色素c转移到分子氧上，并促进跨线粒体内膜的质子电化学梯度。该复合物由13个线粒体和核编码亚基组成。线粒体编码的亚基执行电子转移和质子泵活动。核编码亚基的功能可能在复合物的调控和组装中发挥作用。该基因（cox5b）编码人线粒体呼吸链酶的核编码亚基vb。在功能正常的线粒体中，该蛋白位于线粒体内膜上，当线粒体受到损伤，线粒体膜电位去极化，内外膜损伤，位于线粒体内膜的呼吸链复合体iii解体，cox5b蛋白释放到血清中。

技术实现要素：

本发明的目的是提供了一种特发性肺纤维化疾病诊断标志物及其制备诊断或预后工具中的应用，通过lc-ms/ms质谱的dia方法检测到cox5b在特发性肺纤维化患者的血液中的含量比正常人高。cox5b蛋白是线粒体内膜上呼吸链复合体iii的组成成分之一，在特发性肺纤维化患者血清中cox5b蛋白水平较高，说明ipf患者线粒体损伤严重，cox5b蛋白释放到血清中，并且cox5b蛋白水平与ipf患者生存os负相关，生存差的ipf患者血清中cox5b蛋白水平较高，可以进一步开发诊断特发性肺纤维化疾病的工具。

本发明为实现上述目的采用如下技术方案，特发性肺纤维化疾病诊断标志物，其特征在于该诊断标志物为cox5b基因表达产物，cox5b基因的编码序列包括以下任一一种dna序列：

（1）序列表中seqidno.2所示的dna序列；

（2）在严格条件下与（1）限定的dna序列杂交且编码相同功能蛋白质的dna序列；

（3）与（1）或（2）限定的dna序列具有70%以上同源性，且编码相同功能蛋白质的dna序列。

优选的，所述cox5b基因表达产物包括cox5b蛋白、cox5b蛋白的功能等同物以及cox5b蛋白的部分肽，其中cox5b蛋白的部分肽含有与特发性肺纤维化相关的功能域；cox5b蛋白的功能等同物包括cox5b蛋白保守性变异蛋白质，或其活性片段，或其活性衍生物，等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧条件下能与cox5b的dna杂交的dna所编码的蛋白质。

优选的，所述cox5b蛋白是具有下列氨基酸序列的蛋白质：

（1）由序列表中seqidno.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

（2）将seqidno.1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与seqidno.1所示的氨基酸序列具有相同功能的由seqidno.1所示的氨基酸序列衍生的蛋白质，取代、缺失或者添加的氨基酸的个数通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个；

（3）与seqidno.1所示的氨基酸序列具有至少80%同源性的氨基酸序列构成的多肽，又称为序列同一性的多肽。

优选的，所述cox5b基因及其表达产物的来源包括但不限于血液、组织液、尿液、唾液、肺组织、支气管肺泡灌洗样本或呼出气冷凝液或脊髓液。

本发明所述特发性肺纤维化疾病诊断标志物在制备诊断或预后工具中的应用，其特征在于：通过rt-pcr、实时定量pcr、免疫检测、原位杂交、芯片或高通量测序平台检测cox5b基因的表达水平以诊断特发性肺纤维化疾病，在ipf患者血清中cox5b含量较高，说明ipf患者线粒体损伤严重，cox5b释放到血清中，并且cox5b含量与ipf患者生存os负相关，生存差的ipf患者血清中cox5b含量较高。

优选的，用rt-pcr诊断特发性肺纤维化的产品至少包括一对特异扩增cox5b基因的引物；用实时定量pcr诊断特发性肺纤维化的产品至少包括一对特异扩增cox5b基因的引物；用免疫检测诊断特发性肺纤维化的产品包括与cox5b基因表达产物特异性结合的抗体；用原位杂交诊断特发性肺纤维化的产品包括与cox5b基因的核酸序列杂交的探针；用芯片诊断特发性肺纤维化的产品包括蛋白芯片和基因芯片；其中蛋白芯片包括与cox5b蛋白特异性结合的抗体，基因芯片包括与cox5b基因的核酸序列杂交的探针。

优选的，用实时定量pcr诊断特发性肺纤维化的产品至少包括一对特异扩增cox5b基因的引物，该引物序列如seqidno.3和seqidno.4、seqidno.5和seqidno.6、seqidno.7和seqidno.8、seqidno.9和seqidno.10及seqidno.11和seqidno.12所示。

优选的，所述工具通过检测样本中cox5b基因的表达来诊断特发性肺纤维化，该工具包括芯片、试剂盒、试纸或高通量测序平台。

优选的，所述芯片包括基因芯片或蛋白质芯片，所述基因芯片包括固相载体以及固定在固相载体的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括用于检测cox5b基因转录水平的针对cox5b基因的寡核苷酸探针，所述蛋白质芯片包括固相载体以及固定在固相载体的cox5b蛋白的特异性抗体；所述试剂盒包括基因检测试剂盒或蛋白免疫检测试剂盒，所述基因检测试剂盒包括用于检测cox5b基因转录水平的试剂，所述蛋白免疫检测试剂盒包括cox5b蛋白的特异性抗体；所述试纸包括用于检测cox5b基因转录水平的试剂；所述高通量测序平台包括用于检测cox5b基因转录水平的试剂。

优选的，所述检测cox5b基因转录水平的试剂包括针对cox5b基因的引物和/或探针。

本发明涉及细胞色素c氧化酶亚基5b作为特发性纤维化ipf血清标志物的新发现，cox5b是线粒体内膜上呼吸链复合体iii的组成成分之一，在ipf患者血清中cox5b含量较高，说明ipf患者线粒体损伤严重，cox5b释放到血清中，并且cox5b含量与ipf患者生存os负相关，生存差的ipf患者血清中cox5b含量较高。本发明的研究成果为临床上进行特发性肺纤维化疾病的诊断提供了一种无创的方法，适于临床推广。

附图说明

图1是利用qpcr检测特发性肺纤维化（ipf）和正常人（n）相比cox5b基因的差异表达；

图2是elisa检测特发性肺纤维化（ipf）和正常人（n）相比cox5b蛋白的差异表达；

图3是lc-ms/ms检测特发性肺纤维化（ipf）和正常人（n）相比cox5b蛋白的差异表达。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明的上述内容做进一步详细说明，但不应该将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本发明上述内容实现的技术均属于本发明的范围。

本发明通过lc-ms/ms质谱的dia方法检测到cox5b蛋白的表达水平在特发性肺纤维化患者的血液中的含量比正常人高。cox5b是线粒体内膜上呼吸链复合体iii的组成成分之一，在特发性肺纤维化患者血清中cox5b蛋白含量较高，说明ipf患者线粒体损伤严重，cox5b基因表达产物释放到血清中，并且cox5b蛋白含量与ipf患者生存os负相关，生存差的ipf患者血清中cox5b蛋白含量较高，可以进一步开发诊断特发性肺纤维化疾病的工具。

根据本发明的一个方面，本发明提供了检测cox5b基因表达产物的产品在制备诊断特发性肺纤维化的工具中的应用。

进一步，上面所提到的检测产品包括：通过rt-pcr、实时定量pcr、免疫检测、原位杂交、芯片或高通量测序平台、lc-ms/ms质谱检测cox5b基因的表达水平以诊断特发性肺纤维化的产品。

进一步，所述用rt-pcr诊断特发性肺纤维化的产品至少包括一对特异扩增cox5b基因的引物（三对引物seqidno.3和seqidno.4、seqidno.5和seqidno.6、seqidno.7和seqidno.8）；所述用实时定量pcr诊断特发性肺纤维化的产品至少包括一对特异扩增cox5b基因的引物（2对引物seqidno.9和seqidno.10及seqidno.11和seqidno.12）；所述用免疫检测诊断特发性肺纤维化的产品包括与cox5b基因表达产物特异性结合的抗体；所述用原位杂交诊断特发性肺纤维化的产品包括与cox5b基因的核酸序列杂交的探针；所述用芯片诊断特发性肺纤维化的产品包括：蛋白芯片和基因芯片；其中蛋白芯片包括与cox5b蛋白特异性结合的抗体，基因芯片包括与cox5b基因的核酸序列杂交的探针。

在本发明的具体实施方案中，所述用实时定量pcr诊断特发性肺纤维化的产品至少包括一对特异扩增cox5b基因的引物的序列如序列表seqidno.3和seqidno.4、seqidno.5和seqidno.6、seqidno.7和seqidno.8、seqidno.9和seqidno.10及seqidno.11和seqidno.12所示。

优选地，所述诊断工具包括芯片、试剂盒、试纸或高通量测序平台、lc-ms/ms质谱检测。其中，高通量测序、lc-ms/ms质谱测序平台是特殊的诊断工具，检测cox5b基因表达的产品可以应用于该平台实现对cox5b基因的表达情况的检测。随着高通量测序/质谱测序技术的发展，对一个人的基因表达谱的构建将成为十分便捷的工作。通过对比疾病患者和正常人群的基因表达谱，容易分析出哪个基因的异常与疾病相关。因此，在高通量测序/质谱测序中获知cox5b基因的异常与特发性肺纤维化相关也属于cox5b基因的用途，同样在本发明的保护范围之内。

根据本发明的另一个方面，本发明还提供了一种诊断特发性肺纤维化的工具，所述产品包括芯片、试剂盒、试纸或高通量测序/质谱平台。

其中，所述芯片包括基因芯片、蛋白质芯片；所述基因芯片包括固相载体以及固定在固相载体的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括用于检测cox5b基因转录水平的针对cox5b基因的寡核苷酸探针；所述蛋白质芯片包括固相载体以及固定在固相载体的cox5b蛋白的特异性抗体；所述基因芯片可用于检测包括cox5b基因在内的多个基因(例如与特发性肺纤维化相关的多个基因)的表达水平。所述蛋白质芯片可用于检测包括cox5b蛋白在内的多个蛋白质（例如与特发性肺纤维化相关的多个蛋白质）的表达水平。通过将多个与特发性肺纤维化的标志物同时检测，可大大提高特发性肺纤维化诊断的准确率。其中，所述试剂盒包括基因检测试剂盒和蛋白免疫检测试剂盒；所述基因检测试剂盒包括用于检测cox5b基因转录水平的试剂；所述蛋白免疫检测试剂盒包括cox5b蛋白的特异性抗体。进一步，所述试剂包括使用rt-pcr、实时定量pcr、免疫检测、原位杂交或芯片方法检测cox5b基因表达水平过程中所需的试剂。优选地，所述试剂包括针对cox5b基因的引物和/或探针。根据cox5b基因的核苷酸序列信息容易设计出可以用于检测cox5b基因表达水平的引物和探针。

所述高通量测序平台包括检测cox5b基因表达水平的试剂。所述试纸包括试纸载体和固定在试纸载体上的寡核苷酸，所述寡核苷酸能够检测cox5b基因的转录水平。与cox5b基因的核酸序列杂交的探针可以是dna、rna、dna-rna嵌合体、pna或其它衍生物。所述探针的长度没有限制，只要完成特异性杂交、与目的核苷酸序列特异性结合，任何长度都可以。所述探针的长度可短至25、20、15、13或10个碱基长度。同样，所述探针的长度可长至60、80、100、150、300个碱基对或更长，甚至整个基因。由于不同的探针长度对杂交效率、信号特异性有不同的影响，所述探针的长度通常至少是14个碱基对，最长一般不超过30个碱基对，与目的核苷酸序列互补的长度以15-25个碱基对最佳。所述探针自身互补序列最好少于4个碱基对，以免影响杂交效率。

进一步，所述cox5b蛋白的特异性抗体包括单克隆抗体、多克隆抗体。所述cox5b蛋白的特异性抗体包括完整的抗体分子、抗体的任何片段或修饰。只要所述片段能够保留与cox5b蛋白的结合能力即可。用于蛋白质水平的抗体的制备时本领域技术人员公知的，并且本发明可以使用任何方法来制备所述抗体。

在本发明的具体实施方案中，所述针对cox5b基因的引物序列如序列表seqidno.3和seqidno.4所示。

用于诊断特发性肺纤维化的cox5b基因及其表达产物的来源包括但不限于血液、组织液、尿液、唾液、肺组织、支气管肺泡灌洗样本或呼出气冷凝液、脊髓液等体液。在本发明的具体实施方案中，用于诊断特发性肺纤维化的cox5b基因及其表达产物的来源是血液。在发明的具体实施方案中，血液是取自特发性肺纤维化患者和正常人的外周血液。

本发明的cox5b基因(nm_001862.3)的具体序列可在国际公共核酸序列数据库genebank中查询到。

本发明的cox5b基因的编码序列包括以下任一一种dna分子：

（1）序列表中seqidno.2所示的dna序列；

（2）在严格条件下与（1）限定的dna序列杂交且编码相同功能蛋白质的dna序列；

（3）与（1）或（2）限定的dna序列具有70%、优选地，90%以上同源性，且编码相同功能蛋白质的dna序列。

在本发明的具体实施方案中，所述cox5b基因的编码序列是seqidno.2所示的dna序列。

在本发明的上下文中，cox5b基因表达产物包括cox5b蛋白以及cox5b蛋白的部分肽。所述cox5b蛋白的部分肽含有与特发性肺纤维化相关的功能域。

cox5b蛋白包括cox5b蛋白以及cox5b蛋白的任何功能等同物。所述功能等同物包括cox5b蛋白保守性变异蛋白质、或其活性片段，或其活性衍生物，等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧条件下能与cox5b的dna杂交的dna所编码的蛋白质。

进一步的，cox5b蛋白是具有下列氨基酸序列的蛋白质：

（1）由序列表中seqidno.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

（2）将seqidno.1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与seqidno.1所示的氨基酸序列具有相同功能的由seqidno.1所示的氨基酸序列衍生的蛋白质。取代、缺失或者添加的氨基酸的个数通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个；

（3）与seqidno.1所示的氨基酸序列具有至少80%同源性（又称为序列同一性），更优选地，与seqidno.1所示的氨基酸序列至少约90%至95%的同源性，常为96%、97%、98%、99%同源性的氨基酸序列构成的多肽。

在本发明的具体实施方案中，所述cox5b蛋白是具有seqidno.1所示的氨基酸序列的蛋白质。

通常，已知的是，一个蛋白质中一个或多个氨基酸的修饰不会影响蛋白质的功能。

本领域技术人员会认可改变单个氨基酸或小百分比的氨基酸或对氨基酸序列的个别添加、缺失、插入、替换是保守修饰，其中蛋白质的改变产生具有相似功能的蛋白质。提供功能相似的氨基酸的保守替换表是本领域公知的。

通过添加一个氨基酸或多个氨基酸残基修饰的蛋白质的例子是cox5b蛋白的融合蛋白。对于与cox5b蛋白融合的肽或者蛋白质没有限制，只要所得的融合蛋白保留cox5b蛋白的生物学活性即可。

本发明的cox5b蛋白也包括对seqidno.1所示的氨基酸序列的非保守修饰，只要经过修饰的蛋白质仍然能够保留cox5b蛋白的生物学活性即可。在此类修饰蛋白质中突变的氨基酸数目通常是10个或者更少，例如6个或者更少，例如3个或者更少。

在本发明的上下文中，诊断特发性肺纤维化既包括待检测者是否已经患有特发性肺纤维化、也包括判断待检测者是否存在患有特发性肺纤维化的风险，还包括预测特发性肺纤维化患者的预后。

实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件分子克隆：实验室手册（newyork:coldspringharborlaboratorypress,1989）中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

筛选特发性肺纤维化患者和正常人中差异表达的基因

1、临床研究对象：

选取特发性肺纤维化患者30例，其中男性21例，女性9例，年龄范围30-83岁，诊断标准均符合中国呼吸学会间质性肺病和美国胸科协会（ats）修订的《特发性肺纤维化诊疗规范》。

排除标准：（1）合并其它肺部疾病者，如支气管哮喘、肺间质纤维化、肺癌等；（2）有其它部位感染者；（3）伴有严重心脑血管疾病、糖尿病、血液系统疾病、恶性肿瘤、脏器功能衰竭、肝炎者；（4）患免疫系统疾病或者近期使用过免疫抑制剂者。

正常对照：选取体检的健康人30人，其中男性18人，女性12人，年龄范围32-70。

入选标准：无慢性咳嗽、咳痰、喘息等病史；近期无上呼吸道感染、肺部感染史；无全身其他部位感染者；无其他肺部疾病者；近期未使用免疫抑制剂或者无全身免疫系统疾病者；无器官功能衰竭或者严重心脑血管疾病、肿瘤者；无过敏性疾病者。入选对象行肺功能检查均排除并与特发性肺纤维化组对比，在性别、年龄上差异均无统计学意义具有可比性。所有研究对象均签署了知情同意书。

2、样本采集

所有研究对象于清晨空腹状态下，抽取外周静脉血10ml，edta抗凝。

研究对象：

按照实施例1的方法选择特发性肺纤维化患者30例，正常人30例。

3、血液样本总rna提取

实施例2

验证特发性肺纤维化患者和正常人中差异表达的基因

4、elisa检测cox5b

实施例2验证特发性肺纤维化患者和正常人中差异表达的cox5b。

5、血液总肽段提取，质谱检测

利用lc-ms/ms质谱实施例2验证特发性肺纤维化患者和正常人血液中cox5b的含量。

结果如图1-3显示，与正常人相比，特发性肺纤维化患者血液中cox5b基因的mrna水平显著升高，差异具有统计学意义（p<0.05），结果同elisa和蛋白质组学检测结果。

以上实施例描述了本发明的基本原理、主要特征及优点，本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明原理的范围下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进均落入本发明保护的范围内。

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<110>河南师范大学

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序列表

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<213>人工序列(artificialsequence)

<400>10

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<210>11

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ccagcttgtaatgggctccac21