本发明涉及生物化工技术领域，具体而言，涉及一种酿酒酵母的培养方法。
背景技术：
近年来，燃料乙醇作为新的可再生燃料替代品日益受到各国的重视，乙醇发酵是通过酿酒细胞的培养获得其代谢产物，但是传统的细胞培养方式所得发酵液酵母细胞浓度都不高，因此代谢产物乙醇浓度的提高也受到了限制。通过提高酵母细胞培养浓度能够提高单位体积发酵液中菌体或者其代谢产物的浓度，相应地缩小生物反应器的体积和降低下游分离提纯费用，缩短生产周期，减少废水量，减少设备投资，从而降低生产成本，达到提高生产效率的目的。国内外学者主要从以下方面提高酵母细胞浓度。
(1)菌种改造
酵母的发酵性能直接影响到酒精质量与生产成本，传统的物理、化学诱变育种技术、细胞杂交及原生质体融合技术是获得耐高温、高产酒精酵母菌株的最有效方法。在此基础上，针对酵母细胞高密度培养技术的研究主要集中在扩大可发酵糖范围或对酵母调控基因的分子生物学改造上。
(2)营养物质
葡萄糖是酵母菌进行酒精发酵的主要基质，糖浓度过高时，由于发酵液中渗透压大，不利酵母的生长繁殖，同时也不利于酵母细胞内酒化酶将糖份发酵为酒精。糖浓度过低时，发酵液中营养物质被耗用而不足，使酵母处于饥饿状态，酒化酶活力低、发酵率低、酒精度低，因此，控制合理的糖浓度十分重要。除了碳源外，需添加微量的营养盐，其中的n源至关重要，研究表明：发酵液中游离氨基氮浓度在150mg/l～870mg/l范围内，游离氨基氮浓度与酒精发酵速度是有直接关系的，游离氨基氮浓度越高，发酵速度越快。
(3)工艺条件的选择
针对原料处理、接种量、营养物质补给、生长抑制物的积累、溶氧(dissolvedoxygen，do)、发酵温度、ph值、补料方式及发酵液流体特性等来进行过程控制，在维持产率和比生产率不降低的同时，提高发酵液内酵母细胞的密度。
然而，上述方法(1)的投入成本高，过程复杂。方法(2)和(3)的酵母细胞浓度的提高程度不够明显。
技术实现要素：
本发明的主要目的在于提供一种酿酒酵母的培养方法，以解决现有技术中的酵母细胞浓度提高工艺复杂或效果不明显的问题。
为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种酿酒酵母的培养方法，其包括以下步骤：s1，将糖化醪液通过固液分离获得糖化液，在糖化液中加入尿素和磷酸氢二铵，其中尿素的投加量为0.5～1.5g/l，磷酸氢二铵的投加量为0.25～0.75g/l，得到基液；s2，在磁力搅拌发酵设备中加入经活化的酿酒酵母的干酵母溶液，然后将基液以0.5～1.5ml/min的流加速度流入发酵设备中，在温度28～32℃、无菌空气通气量0.1～1l/min条件下培养15～17h，得到种子发酵液；其中干酵母溶液的体积为基液体积的1/10～1/5；s3，将种子发酵液接入未经固液分离的糖化醪液中进行发酵，其中种子发酵液的体积为糖化醪液体积的1/3～2/3，培养温度为28～32℃；s4，当糖浓度低于1g/l时，发酵过程结束。
进一步地，糖化醪液为玉米原料经糖化后得到的醪液。
进一步地，步骤s1中，在得到基液后，还包括对基液进行灭菌处理的步骤。
进一步地，步骤s2中，将基液流入发酵设备的过程中，采用恒速流入。
进一步地，步骤s3中，在将种子发酵液接入之前，还包括对未经固液分离的糖化醪液进行灭菌处理和冷却的步骤。
进一步地，步骤s1中固液分离的方法采用离心分离、抽滤或过滤机过滤。
进一步地，上述培养方法包括以下步骤：s1，将玉米原料经糖化后得到的醪液通过固液分离获得糖化液800ml，在糖化液中加入0.67g尿素和0.33g磷酸氢二铵，得到基液，并对其进行灭菌处理；s2，在容积为2l的磁力搅拌发酵设备中加入200ml经1h活化的酿酒酵母的0.1亿/ml的干酵母溶液，然后将基液以0.88ml/min的流加速度恒速流入发酵设备中，在温度30℃、无菌空气通气量0.2l/min条件下培养16h，且该过程中的磁力搅拌速度为150r/min，得到种子发酵液；s3，取60ml未经固液分离的玉米原料经糖化后得到的醪液，将40ml种子发酵液接入其中进行发酵，培养温度为30℃；s4，当糖浓度低于1g/l时，发酵过程结束。
进一步地，上述培养方法包括以下步骤：s1，将玉米原料经糖化后得到的醪液通过固液分离获得糖化液800ml，在糖化液中加入0.5g尿素和0.25g磷酸氢二铵，得到基液，并对其进行灭菌处理；s2，在容积为2l的磁力搅拌发酵设备中加入200ml经1h活化的酿酒酵母的0.1亿/ml的干酵母溶液，然后将基液以0.7ml/min的流加速度恒速流入发酵设备中，在温度32℃、无菌空气通气量0.1l/min条件下培养16h，且该过程中的磁力搅拌速度为150r/min，得到种子发酵液；s3，取60ml未经固液分离的玉米原料经糖化后得到的醪液，将40ml种子发酵液接入其中进行发酵，培养温度为30℃；s4，当糖浓度低于1g/l时，发酵过程结束。
进一步地，上述培养方法包括以下步骤：s1，将玉米原料经糖化后得到的醪液通过固液分离获得糖化液800ml，在糖化液中加入0.5g尿素和0.25g磷酸氢二铵，得到基液，并对其进行灭菌处理；s2，在容积为2l的磁力搅拌发酵设备中加入200ml经1h活化的酿酒酵母的0.1亿/ml的干酵母溶液，然后将基液以1.2ml/min的流加速度恒速流入发酵设备中，在温度30℃、无菌空气通气量0.1l/min条件下培养16h，且该过程中的磁力搅拌速度为150r/min，得到种子发酵液；s3，取60ml未经固液分离的玉米原料经糖化后得到的醪液，将40ml种子发酵液接入其中进行发酵，培养温度为30℃；s4，当糖浓度低于1g/l时，发酵过程结束。
进一步地，上述培养方法包括以下步骤：s1，将玉米原料经糖化后得到的醪液通过固液分离获得糖化液800ml，在糖化液中加入0.58g尿素和0.27g磷酸氢二铵，得到基液，并对其进行灭菌处理；s2，在容积为2l的磁力搅拌发酵设备中加入200ml经1h活化的酿酒酵母的0.1亿/ml的干酵母溶液，然后将基液以1.3ml/min的流加速度恒速流入发酵设备中，在温度29℃、无菌空气通气量0.3l/min条件下培养17h，且该过程中的磁力搅拌速度为150r/min，得到种子发酵液；s3，取60ml未经固液分离的玉米原料经糖化后得到的醪液，将40ml种子发酵液接入其中进行发酵，培养温度为32℃；s4，当糖浓度低于1g/l时，发酵过程结束。
本发明从发酵工艺的角度提高了酵母的生长速率，提高发酵速率，缩短发酵周期，实现了酵母细胞高浓度发酵。且该工艺采用的营养盐价格低廉，无需对现有设备进行改造，能够有效降低乙醇生产装置能耗，增加乙醇产量。
具体实施方式
需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将结合实施例来详细说明本发明。
正如背景技术部分所描述的，现有技术中在制备高浓度酵母细胞时存在工艺复杂或浓度提高程度不明显的问题。
为了解决上述问题，本发明提供了一种酿酒酵母的培养方法，其包括以下步骤：s1，将糖化醪液通过固液分离获得糖化液，在糖化液中加入尿素和磷酸氢二铵，其中尿素的投加量为0.5～1.5g/l，磷酸氢二铵的投加量为0.25～0.75g/l，得到基液；s2，在磁力搅拌发酵设备中加入经活化的酿酒酵母的干酵母溶液，然后将s1中得到的基液以0.5～1.5ml/min的流加速度流入发酵设备中，在温度28～32℃、无菌空气通气量0.1～1l/min条件下培养15～17h，得到种子发酵液；其中干酵母溶液的体积为基液体积的1/10～1/5；s3，将种子发酵液接入未经固液分离的糖化醪液中进行发酵，其中种子发酵液的体积为糖化醪液体积的1/3～2/3，培养温度为28～32℃；s4，当糖浓度低于1g/l时，发酵过程结束。
本发明能够控制发酵体系中的糖浓度保持适宜的水平，不要过高或过低，使得酵母细胞在一个适宜的环境中生长，从而达到提高酵母生长速度的效果。本发明从发酵工艺的角度提高了酵母的生长速率，提高发酵速率，缩短发酵周期，实现了酵母细胞高浓度发酵。且该工艺采用的营养盐价格低廉，无需对现有设备进行改造，能够有效降低乙醇生产装置能耗，增加乙醇产量。
在一种优选的实施方式中，糖化醪液为玉米原料经糖化后得到的醪液。
在一种优选的实施方式中，步骤s1中，在得到基液后，还包括对基液进行灭菌处理的步骤。进一步优选地，步骤s3中，在将种子发酵液接入之前，还包括对未经固液分离的糖化醪液进行灭菌处理和冷却的步骤。更优选地，步骤s2中，将基液流入发酵设备的过程中，采用恒速流入。采用恒速方式流入，可以保持发酵体系中适宜的且稳定的糖浓度，从而提高酵母的生长速率，缩短发酵周期，实现酵母细胞高浓度培养。
上述固液分离过程可以采用本领域常用的固液分离方式，在一种优选的实施方式中，步骤s1中固液分离的方法采用离心分离、抽滤或过滤机过滤。上述几种固液分离方式的固液分离效率较高，效果更佳。
在一种优选的实施方式中，上述培养方法包括以下步骤：s1，将玉米原料经糖化后得到的醪液通过固液分离获得糖化液800ml，在糖化液中加入0.67g尿素和0.33g磷酸氢二铵，得到基液，并对其进行灭菌处理；s2，在容积为2l的磁力搅拌发酵设备中加入200ml经1h活化的酿酒酵母的0.1亿/ml的干酵母溶液，然后将基液以0.88ml/min的流加速度恒速流入发酵设备中，在温度30℃、无菌空气通气量0.2l/min条件下培养16h，且该过程中的磁力搅拌速度为150r/min，得到种子发酵液；s3，取60ml未经固液分离的玉米原料经糖化后得到的醪液，将40ml种子发酵液接入其中进行发酵，培养温度为30℃；s4，当糖浓度低于1g/l时，发酵过程结束。
在一种优选的实施方式中，上述培养方法包括以下步骤：s1，将玉米原料经糖化后得到的醪液通过固液分离获得糖化液800ml，在糖化液中加入0.5g尿素和0.25g磷酸氢二铵，得到基液，并对其进行灭菌处理；s2，在容积为2l的磁力搅拌发酵设备中加入200ml经1h活化的酿酒酵母的0.1亿/ml的干酵母溶液，然后将基液以0.7ml/min的流加速度恒速流入发酵设备中，在温度32℃、无菌空气通气量0.1l/min条件下培养16h，且该过程中的磁力搅拌速度为150r/min，得到种子发酵液；s3，取60ml未经固液分离的玉米原料经糖化后得到的醪液，将40ml种子发酵液接入其中进行发酵，培养温度为30℃；s4，当糖浓度低于1g/l时，发酵过程结束。
在一种优选的实施方式中，上述培养方法包括以下步骤：s1，将玉米原料经糖化后得到的醪液通过固液分离获得糖化液800ml，在糖化液中加入0.5g尿素和0.25g磷酸氢二铵，得到基液，并对其进行灭菌处理；s2，在容积为2l的磁力搅拌发酵设备中加入200ml经1h活化的酿酒酵母的0.1亿/ml的干酵母溶液，然后将基液以1.2ml/min的流加速度恒速流入发酵设备中，在温度30℃、无菌空气通气量0.1l/min条件下培养16h，且该过程中的磁力搅拌速度为150r/min，得到种子发酵液；s3，取60ml未经固液分离的玉米原料经糖化后得到的醪液，将40ml种子发酵液接入其中进行发酵，培养温度为30℃；s4，当糖浓度低于1g/l时，发酵过程结束。
在一种优选的实施方式中，上述培养方法包括以下步骤：s1，将玉米原料经糖化后得到的醪液通过固液分离获得糖化液800ml，在糖化液中加入0.58g尿素和0.27g磷酸氢二铵，得到基液，并对其进行灭菌处理；s2，在容积为2l的磁力搅拌发酵设备中加入200ml经1h活化的酿酒酵母的0.1亿/ml的干酵母溶液，然后将基液以1.3ml/min的流加速度恒速流入发酵设备中，在温度29℃、无菌空气通气量0.3l/min条件下培养17h，且该过程中的磁力搅拌速度为150r/min，得到种子发酵液；s3，取60ml未经固液分离的玉米原料经糖化后得到的醪液，将40ml种子发酵液接入其中进行发酵，培养温度为32℃；s4，当糖浓度低于1g/l时，发酵过程结束。
以下结合具体实施例对本申请作进一步详细描述，这些实施例不能理解为限制本申请所要求保护的范围。
实施例1
(1)将糖化醪液通过固液分离获得清澈的糖化液800ml，加入尿素0.67g，磷酸氢二铵0.33g，灭菌处理后备用；
(2)在磁力搅拌发酵设备的2l培养瓶中加入200ml活化1h的0.1亿/ml干酵母溶液，将步骤(1)的糖化液采用0.88ml/min的流加速率恒速流加入培养瓶中。培养温度30℃，通气量0.2l/min，搅拌转速150r/min；
(3)步骤(2)中培养16h时酵母数量为6.8亿/ml，取40ml接入未经固液分离的60ml糖化醪液中启动发酵，发酵温度30℃。
(4)步骤(3)发酵液中糖浓度低于1g/l时所需时间为20h，得到的最终酵母数量为7.3亿/ml。
实施例2
(1)将糖化醪液通过固液分离获得清澈的糖化液800ml，加入尿素0.5g，磷酸氢二铵0.25g，灭菌处理后备用；
(2)在磁力搅拌发酵设备的2l培养瓶中加入200ml活化1h的0.1亿/ml干酵母溶液，将步骤(1)的糖化液采用0.7ml/min的流加速率恒速流加入培养瓶中。培养温度32℃，通气量0.1l/min，搅拌转速150r/min。
(3)步骤(2)中培养16h时酵母数量为6.2亿/ml，取40ml接入未经固液分离的60ml糖化醪液中启动发酵，发酵温度30℃。
(4)步骤(3)发酵液中糖浓度低于1g/l时所需时间为21.5h，得到的最终酵母数量为6.7亿/ml。
实施例3
(1)将糖化醪液通过固液分离获得清澈的糖化液800ml，加入尿素0.5g，磷酸氢二铵0.25g，灭菌处理后备用；
(2)在磁力搅拌发酵设备的2l培养瓶中加入200ml活化1h的0.1亿/ml干酵母溶液，将步骤(1)的糖化液采用1.2ml/min的流加速率恒速流加入培养瓶中。培养温度30℃，通气量0.1l/min，搅拌转速150r/min。
(3)步骤(2)中培养16h时酵母数量为5.8亿/ml，取40ml接入未经固液分离的60ml糖化醪液中启动发酵，发酵温度30℃。
(4)步骤(3)发酵液中糖浓度低于1g/l时所需时间为21.5h，得到的最终酵母数量为6.2亿/ml。
对比例1
(1)将糖化醪液通过固液分离获得清澈的糖化液800ml加入磁力搅拌发酵设备的2l培养瓶中，加入尿素0.5g，磷酸氢二铵0.25g，灭菌处理后备用。
(2)在步骤(1)的培养瓶中加入200ml活化1h的0.1亿/ml干酵母溶液，培养温度30℃，通气量0.1l/min，搅拌转速150r/min；
(3)步骤(2)中培养16h时酵母数量为5.1亿/ml，取40ml接入未经固液分离的60ml糖化醪液中启动发酵，发酵温度30℃。
(4)步骤(3)发酵液中糖浓度低于1g/l时所需时间为22.5h，得到的最终酵母数量为5.5亿/ml。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。