一种抗犬细小病毒的基因工程抗体及其应用的制作方法

本发明属于抗体工程技术领域，具体涉及一种抗犬细小病毒的基因工程抗体及其应用。

背景技术：

犬细小病毒(canineparovirus,cpv)属于细小病毒科细小病毒属，是家犬和几种野生食肉动物的重要病原体，主要的自然宿主是犬。犬被感染后会引发犬细小病毒病，该病分为肠炎型和心肌炎型，具有发病率高、传染性强、死亡率高等特点，可造成严重经济损失，严重危害中国养犬业的发展。

预防犬细小病毒病的疫苗主要有：灭活苗、弱毒苗和多联苗，但是对市场上疫苗的免疫效果调查研究发现，仅20％的疫苗能产生100％保护力的抗体。对于犬细小病毒感染，目前尚没有特效药物，临床上多采用对症治疗、支持疗法和特异性疗法联合应用。其中，特异性疗法，一般早期采用犬细小病毒单克隆抗体及犬细小病毒抗血清。市售抗血清有异种动物免疫血清和犬源血清，异种动物血清虽然能保护幼龄动物和成年动物免受感染，但无法连续注射，否则将造成剧烈的过敏反应，严重时可导致动物死亡；而犬源血清具有犬源缺乏和制备成本高的特点。临床上采用的抗犬细小病毒单克隆抗体为鼠源单克隆抗体，由于鼠源单克隆抗体注射至其他种源动物时易产生抗鼠源抗体导致治疗效果下降影响了临床应用。随着宠物犬的数量增多，研究犬细小病毒病的诊断和防治具有重要意义。

目前，市场上的犬细小病毒单克隆抗体和抗血清具有较强的免疫原性，在治疗过程中会存在副作用降低疗效，限制了其临床应用。因此，制备低免疫原性、高亲和力、特异性强的单克隆抗体更有利于推动抗体药物的大规模临床应用。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种抗犬细小病毒的基因工程抗体及其应用，可表现出良好的中和犬细小病毒的活性作用，抑制犬细小病毒对红细胞的凝集作用佳，且用于治疗犬细小病毒感染时可降低免疫原性和产生的过敏反应。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种抗犬细小病毒的基因工程抗体，所述基因工程抗体中包括犬源抗体的恒定区和鼠源抗体的可变区；

所述恒定区包括重链恒定区和轻链恒定区，所述重链恒定区的核苷酸序列如seqidno.5所示；所述轻链恒定区的核苷酸序列如seqidno.6所示；

所述可变区包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区的核苷酸序列如seqidno.1所示；所述轻链可变区的核苷酸序列如seqidno.2所示。

优选的，所述重链可变区的编码氨基酸序列如seqidno.3所示；所述轻链可变区的编码氨基酸序列如seqidno.4所示。

优选的，所述基因工程抗体的种类包括：单链抗体、双链抗体或嵌合抗体。

优选的，所述基因工程抗体的种类还包括：所述单链抗体、双链抗体或嵌合抗体的衍生物、功能等同物或同源物，以及抗体片段或含有抗原结合结构域的任何多肽。

本发明还提供了所述基因工程抗体在制备防治犬细小病毒感染药物中的应用。

相比于现有技术，本发明具有以下有益效果：本发明将已获得的犬细小病毒单克隆抗体的可变区序列与犬源抗体恒定区进行组装，得到抗犬细小病毒的基因工程嵌合抗体，表现出良好的中和犬细小病毒的活性，可应用于单克隆抗体犬源化研究和犬细小病毒的防治等领域，对推动犬源化单克隆抗体药物的发展具有重要意义。

本发明所述基因工程抗体，对犬细小病毒具有良好的中和活性，且能抑制犬细小病毒对红细胞的凝集作用，可将其应用于犬细小病毒病的防治研究等领域，对推动犬源化单克隆抗体药物的发展具有重要意义。

在本发明实施例中，经过试验验证，所述基因工程抗体的细胞上清液的血凝抑制效价为1：2⁴～2⁵；中和效价为1:203，因此所述抗体为中和抗体，可以与cpv有效结合阻断其对细胞的感染，具有一定治疗作用，可添加药学上可接受的载体，用于制备治疗犬细小病毒感染药物。

附图说明

图1为实施例1中犬源化cpv基因工程抗体的结构示意图，犬源化cpv基因工程抗体包含两条轻链和两条重链，其轻链由n端可变区vl和c端恒定区cl组成，重链由n端可变区vh和c端恒定区ch

(ch1-ch2-ch3)组成，其中vl和vh来自鼠源cpv单克隆抗体可变区，cl和ch来自犬源抗体恒定区；

图2为实施例1中犬源化cpv基因工程抗体的轻重链的真核表达载体酶切鉴定图；

图3为实施例2提供的犬源化cpv基因工程抗体的血凝抑制结果图；

图4为实施例2提供的犬源化cpv基因工程抗体与cpv的中和试验中的病毒回归对照；

图5为实施例2提供的犬源化cpv基因工程抗体与cpv的中和试验细胞病变结果图；

图6为实施例2提供的犬源化cpv基因工程抗体间接免疫荧光检测结果图。

具体实施方式

本发明提供了一种抗犬细小病毒的基因工程抗体，结构示意图如图1所示，所述基因工程抗体中包括犬源抗体的恒定区和鼠源抗体的可变区；

所述恒定区包括重链恒定区和轻链恒定区，所述重链恒定区的核苷酸序列如seqidno.5所示；所述轻链恒定区的核苷酸序列如seqidno.6所示；

所述可变区包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区的核苷酸序列如seqidno.1所示；所述轻链可变区的核苷酸序列如seqidno.2所示。

本发明所述基因工程抗体为鼠源cpv单克隆抗体的犬源化改造，本发明对所述鼠源cpv单克隆抗体的制备方法并没有特殊限定，在本发明实施例中按照中国专利cn109627331a的方法制备鼠源cpv单克隆抗体。

本发明在组装所述基因工程抗体时，优选的将鼠源抗体的重链可变区基因序列与犬源抗体重链恒定区基因序列组装，轻链可变区基因序列与犬源抗体轻链恒定区基因序列组装，经密码子优化后，其重链的核苷酸序列优选如seqidno.7所示，轻链的核苷酸序列优选如seqidno.8所示。本发明对所述组装的方法并没有特殊限定，利用本发明的常规组装方法即可。

在本发明中，所述重链可变区的编码氨基酸序列优选如seqidno.3所示；所述轻链可变区的编码氨基酸序列优选如seqidno.4所示。

在本发明中，所述基因工程抗体的种类优选包括：单链抗体、双链抗体或嵌合抗体，以及所述单链抗体、双链抗体或嵌合抗体的衍生物、功能等同物或同源物，以及抗体片段或含有抗原结合结构域的任何多肽。

本发明还提供了所述基因工程抗体在制备防治犬细小病毒感染药物中的应用。

本发明所述药物中还包括药学上可接受的辅料，本发明对所述辅料的具体种类并没有特殊限定。

下面结合实施例对本发明提供的抗犬细小病毒的基因工程抗体及其应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

鼠源cpv单克隆抗体的犬源化改造

(1)犬源化cpv基因工程抗体的构建

采用公开号cn109627331a的专利申请说明书实施例的方法，获得小鼠cpv单克隆抗体，经测序其重链可变区的核苷酸序列如seqidno.1所示，其轻链可变区的核苷酸序列如seqidno.2所示，连于克隆载体，挑取克隆进行测序，采用imgt对测序结果在线分析得到抗体序列的重链氨基酸序列如seqidno.3所示，轻链氨基酸序列如seqidno.4所示。

将已获得的小鼠cpv单克隆抗体的重链可变区基因序列与犬源抗体重链恒定区基因序列(如seqidno.5所示)(ncbigenbank：af354265.1)组装，轻链可变区基因序列与犬源抗体轻链恒定区基因序列(如seqidno.6所示)(ncbireferencesequence:xr_003234360.1)组装，经密码子优化后(重链基因序列如seqidno.7所示，轻链基因序列如seqidno.8所示)，分别构建到pcdna3.1(+)表达载体。转化至dh5α感受态细胞中，挑取单克隆进行菌液扩增。采用无内毒素质粒提取试剂盒提取质粒，对提取的质粒进行酶切鉴定结果如图2所示，泳道1为酶切后的pcdna3.1(+)和轻链产物，泳道2为酶切后的pcdna3.1(+)和重链产物，由此证明犬源化cpv基因工程抗体轻链和重链成功构建到真核表达载体pcdna3.1(+)上。

实施例2

犬源化cpv基因工程抗体的表达及活性研究

(1)犬源化cpv基因工程抗体的真核表达

以1×10⁶cells/孔细胞密度将hek-293贴壁细胞接种于六孔板中生长12h后，进行瞬时转染实验。按轻链：重链＝1：1混合后与pei(1μg/μl)为1：3的比例转染至于hek-293细胞中进行表达，转染72h后收集上清进行活性鉴定。

(2)血凝抑制法测定上清中犬源化cpv基因工程抗体对犬细小病毒与猪红细胞结合的阻抗作用

在96孔v型血凝板中25μl/孔加入pbs(0.15mph6.5)，在第一列中分别加入25μl犬源化cpv基因工程抗体，每个抗体做3个重复，做2倍比梯度稀释，稀释至最后一排弃去25μl，25μl/孔加入八单位抗原(即3个血凝单位的cpv溶液)，猪红细胞对照区加入25μl/孔pbs，37℃1h。随后，50μl/孔加入1％猪红细胞液，4℃1h，竖立血凝板记录结果。

实验结果如图3所示，a、b排为cpv单克隆抗体，c、d、e排为正常hek-293细胞上清液，f、g、h排为表达的犬源化cpv基因工程抗体的细胞上清液，i、j、k排为表达的空质粒细胞上清液，l排为1％猪红细胞液对照，m排为八倍抗原对照。在各对照均成立情况下，犬源化cpv基因工程抗体的细胞上清液的血凝抑制效价为1：2⁴～2⁵。结果说明犬源化cpv基因工程抗体可抑制犬细小病毒对猪红细胞的凝集作用。

(2)犬源化cpv基因工程抗体的中和犬细小病毒活性检测

将待检样品(实验组，空白293细胞组，空质粒对照组)和阳性对照组样品(cpv单克隆抗体)在96孔板中做2倍比梯度稀释，每个稀释度做4孔重复，稀释后每孔加入100个tcid50/0.05ml的cpv病毒稀释液0.05ml，置37℃1h。每孔再加入0.1mlf81细胞悬液(细胞浓度2×10⁵～3×10⁵cells/ml)，轻轻混匀后放入37℃5％co2恒温培养箱中，5日后显微镜下观察细胞病变(cpe)统计结果，根据reed-muench法计算细胞上清的中和效价。

病毒对照组：即病毒回归试验，每次检测都要设立病毒对照。将本次检测稀释好的100个tcid50的病毒再做10倍梯度稀释，分别将100、10、1、0.1、0.01个tcid50的病毒每孔加入0.05ml。结果0.01、0.1个tcid50应不引起病变，100、10个tcid50必须引起细胞病变。

细胞对照组：正常细胞对照应在整个中和试验中一直保持良好的形态。

图4中0.01、0.1个tcid50cpv完全未引起f81细胞病变；100、10、1个tcid50cpv完全引起f81细胞的病变，表明病毒组符合病毒回归实验结果要求。实验结果如图5所示，其中a为正常f81细胞；b为cpv单克隆抗体；c为表达犬源化cpv基因工程抗体的hek-293细胞上清液；d为表达空质粒的hek-293细胞上清液；e为正常hek-293细胞上清液；f为cpv对照；细胞对照组完全无病变f81细胞一直保持良好的形态，表明本实验所用的f81细胞适用中和效价检测实验。表1结果表明上清液中犬源化cpv基因工程抗体的中和效价结果为1:203。结果说明该抗体为中和抗体，可以与cpv有效结合阻断其对细胞的感染，具有一定治疗作用，可添加药学上可接受的载体，用于制备治疗犬细小病毒感染药物。

表1hek-293细胞上清中和检测结果

(3)犬源化cpv基因工程抗体的间接免疫荧光检测

在96孔细胞板中100μl/孔加入f81细胞悬液(2×10⁵～3×10⁵cells/ml)，100μl/孔加入100个tcid50/100μl的cpv。37℃5％co2培养箱培养。48h后，弃上清，200μl/孔加入80％冷丙酮室温条件下固定细胞30min。弃液，100μl/孔pbst洗板3次，3min/次。将孔内液体拍净，50μl/孔加入犬源化cpv基因工程抗体，37℃孵育1h。弃液，100μl/孔pbst洗板3次，3min/次，孵育二抗，二抗为兔抗犬igg/fitc1:200倍稀释，伊文思蓝1:300倍稀释，混合后50μl/孔加入，37℃避光孵育1h。弃液，100μl/孔pbst洗板3次，3min/次，荧光显微镜下观察结果。

实验结果如图6所示，其中a为被cpv感染的f81细胞；b为正常f81细胞；可见正常f81细胞未被cpv感染，呈红色，而被cpv感染的f81细胞出现病变呈绿色荧光，说明犬源化cpv基因工程抗体能与cpv结合且犬源化改造成功。结果表明经过犬源化改造后的cpv抗体依然能保持其活性，同时表明这种改造方法有效，进而可以应用在其他犬类疾病防治性抗体犬源化改造等方面，推动犬类抗体药物发展。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110>长春工业大学

<120>一种抗犬细小病毒的基因工程抗体及其应用

<160>8

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<213>人工序列(artificialsequence)

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