一种具有抑菌作用的青霉菌及应用的制作方法

本发明涉及植物病原菌防治技术领域，特别是涉及一种具有抑菌作用的青霉菌及应用。

背景技术：

柑桔是重要的水果，有许多病原菌为害柑桔，对柑桔的安全生产带领巨大威胁。其中柑桔炭疽病菌和柑桔黑点病菌是柑桔上的重要病原物，分别引起柑桔炭疽病和柑桔黑点病。在生产过程中，这两种病害都为害果实、叶片和枝干，带来严重的经济损失。

比如，公开号为cn108184875a的发明公开了一种含松脂酸铜和克菌丹的组合物、制备方法及其应用，属于农药技术领域。所述含松脂酸铜和克菌丹的组合物，包括如下重量份数的原料：松脂酸铜1-30份和克菌丹1-70份。本发明采用松脂酸铜和克菌丹为原料，制成组合物，能产生较高的增效作用，扩大杀菌广谱，克服和延缓病原菌产生抗药性。尤其对柑桔红蜘蛛、柑桔锈壁虱、柑桔树脂病、柑桔炭疽病、柑桔霜霉病、柑桔溃疡病、柑桔灰霉病和柑桔粉虱蚜虫有明显的增效作用，防治效果好。

公开号为cn108184879a的发明公开了一种含喹啉铜和丙森锌的组合物、制备方法及其应用，属于农药技术领域。所述含喹啉铜和丙森锌的组合物，包括如下重量份数的原料：喹啉铜1-50份和丙森锌1-50份。本发明采用喹啉铜和丙森锌为原料，制成组合物，能产生较高的增效作用，扩大杀菌广谱，克服和延缓病原菌产生抗药性。尤其对柑桔红蜘蛛、柑桔锈壁虱、柑桔树脂病、柑桔炭疽病、柑桔霜霉病、柑桔溃疡病、柑桔灰霉病和柑桔粉虱蚜虫有明显的增效作用，防治效果好。

传统的农药防治往往污染环境，在柑桔果实中还有农药残留，危害人体健康。筛选有益真菌进行生物防治，是提高柑桔安全生产的重要方法。

真菌种类繁多，其中青霉属真菌在环境中经常发现，由于其分类特征少，不同种间的形态特征有交叠，传统的形态分类有许多争议。随着现代分子生物学的发展，在青霉属真菌的分类中提出了系统发育学种多位点序列型(multilocussequencetypingforphylogeneticspecies)的概念，通过多个基因位点序列信息进行种类鉴定，提出了青霉属真菌种的dna生物标签进行鉴定(dnabarcodingforidentification)，目前已经接受了370多个种的dna生物标签，对青霉属的真菌进行分类鉴定。

技术实现要素：

本发明分离到一种青霉属的真菌，研究证明对柑桔炭疽病菌和柑桔黑点病菌等具有强烈的抑制作用，通过dna生物标签进行鉴定，明确这个菌是青霉属的一个新种。

一种具有抑菌作用的青霉菌，命名为penicilliumsp.，株号z863，保藏号为cctccno：m2019870。本发明青霉菌菌株z863是从西藏自治区林芝地区林芝县林芝镇(北纬29.60146度，东经94.41736度)的土壤中分离得到。经相关基因序列比对，菌株z863与penicilliumjanczewskii、p.nigricans、p.griseoazureum、p.echinatum的亲缘关系较近，但是并不属于其中的任何一个种类，表明是个新种。将该新筛选到的z863菌株命名为penicilliumsp.，株号z863，于2019年10月30日保藏于位于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏号为cctccno：m2019870。

本发明又提供了所述的青霉菌在抑制病原菌生长中的应用。所述病原菌为稻瘟病菌、柑桔黑点病菌、柑桔炭疽病菌或柑桔黑斑病菌。

本发明又提供了所述的青霉菌在防治芸香科植物病原菌感染中的应用。病原菌为柑桔黑点病菌、柑桔炭疽病菌或柑桔黑斑病菌。所述芸香科植物可以是容易感染上述病原菌的植物，比如，橙子、柚子、柑桔。优选所述芸香科植物为柑桔。防治方式可以是将含有青霉菌株z863的防治药物喷洒在植株上和/或喷洒在植株根部附近的土壤中。

本发明还提供了所述的青霉菌在防治水稻病原菌感染中的应用。病原菌为稻瘟病菌。防治方式可以是将含有青霉素菌株z863的防治药物喷洒在水稻上和/或喷洒在水稻根部附近的土壤中。

本发明经筛选分离到一株具有抑菌作用的青霉菌z863，通过形态和dna生物标签进行鉴定，明确青霉菌z863是青霉属的一个新种，菌株z863对稻瘟病菌、柑桔黑点病菌、柑桔炭疽病菌、柑桔黑斑病菌都有明显的抑制作用，能够用于作为生防菌剂。

附图说明

图1为菌株z863在不同培养基上的菌落形态检测结果图，共检测了cya、mea、cza和yes四种培养基。

图2为菌株z863的形态特征检测结果图，其中小图1：分生孢子梗的分支状态；小图2：分生孢子在瓶梗上的着生状态；小图3：分生孢子梗与瓶梗；小图4：瓶梗的形态；小图5：瓶梗在基梗上的着生方式；小图6：分生孢子的形态，标尺＝10μm。

图3为采用its、cam、bena三个片段合并后构建的系统发育树(数值表示boostrap值)。

图4为菌株z863对病菌半径的抑制率检测结果图。

图5为z863菌株对柑桔黑点病菌的抑制作用对峙培养图，其中a为对峙培养组，b为单独培养柑桔黑点病菌图。

图6为z863菌株对柑桔黑斑病菌的抑制作用对峙培养图，其中a为对峙培养组，b为单独培养柑桔黑斑病菌图。

图7为z863菌株对柑桔炭疽病菌的抑制作用对峙培养图，其中a为对峙培养组，b为单独培养柑桔炭疽病菌图。

图8为z863菌株对稻瘟病菌的抑制作用对峙培养图，其中a为对峙培养组，b为单独培养稻瘟病菌图。

图9为z863菌株对赤霉菌的抑制作用对峙培养图，其中a为对峙培养组，b为单独培养小麦赤霉病菌图。

图10为z863菌株对梨轮纹病菌的抑制作用对峙培养图，其中a为对峙培养组，b为单独培养梨轮纹病菌图。

图11为z863菌株对立枯丝核菌的抑制作用对峙培养图，其中a为对峙培养组，b为单独培养立枯丝核菌图。

具体实施方式

实施例1菌种分离

从全国各地采集土壤样品，采用选择性培养基稀释平板法分离，过程如下：称取10g土样，放入装有小钢珠与90ml无菌水的250ml三角瓶中，在摇床上以120r·min^-1摇10min，使土样充分分散，即成10倍稀释液；再吸取10倍稀释液1ml，加入到9ml无菌水的离心管中，充分混匀；然后再从中取1ml，加入到9ml无菌水的离心管中，充分混匀，即配成稀释1000倍的稀释液。将已融化的pda培养基倒入培养皿中，每皿15ml；待培养基冷却成平板后，吸取稀释1000倍的土样稀释液0.1ml加到pda培养基平板上，再用无菌涂布器将稀释液涂匀，每个浓度重复3次。在25℃的光照培养箱中培养3天后观察菌落，挑取菌落的菌丝于新的pda平板上，待菌落直径长到3cm时再次转接到pda平板上。

pda培养基：200g马铃薯，20g葡萄糖，18g琼脂，0.3g氯霉素(chloramphenicol)，1000ml蒸馏水。

pdb液体培养基：200g马铃薯，20g葡萄糖，18g琼脂，1000ml蒸馏水。

从西藏自治区林芝地区林芝县林芝镇(北纬29.60146度，东经94.41736度)的土壤中分离到菌株z863。

实施例2菌种形态鉴定

培养基：

查氏浓缩液(czapekconcentrate)(100ml)：硝酸钠(nano3)30g，氯化钾(kcl)5g，七水硫酸镁(mgso4·7h2o)5g，七水硫酸铁(feso4·7h2o)0.1g，水(h2o)加至100ml。

微量元素储备液(traceelementsstocksolution)(100ml)：五水硫酸铜(cuso4·5h2o)0.5g，七水硫酸锌(znso4·7h2o)0.5g，水(h2o)加至100ml。

查氏蔗糖培养基(cza)：查氏浓缩液(czapekconcentrate)10ml，蔗糖(sucrose)30g，微量元素储备液(traceelementsstocksolution)1ml，琼脂粉agar20g，水加至1000ml。

查氏蔗糖酵母培养基(cya)：查氏浓缩液(czapekconcentrate)10ml，蔗糖(sucrose)30g，微量元素储备液(traceelementsstocksolution)1ml，酵母提取物(yeastextract)5g，磷酸氢二钾(k2hpo4)1g，琼脂粉(agar)20g，水(h2o)加至1000ml。

玉米粉培养基(mea)：玉米粉提取物(maltextract)50g，微量元素储备液(traceelementsstocksolution)1ml，琼脂粉(agar)20g，水(h2o)加至1000ml。

酵母膏蔗糖培养基(yes)：酵母提取物(yeastextract)20g，蔗糖(sucrose)150g，七水硫酸镁(mgso4·7h2o)0.5g，微量元素储备液(traceelementsstocksolution)1ml，琼脂粉(agar)20g，水(h2o)加至1000ml。

将z863菌株接种到9cm的平板上，每个培养皿中接3个接种点，25℃培养7天，进行菌落形态观察；用60％的乳酸作浮载剂，制片，在显微镜下观察菌丝和分生孢子的形态。

菌落形态观察结果如图1所示：

菌落在cza上25℃培养7天，直径16-18mm，菌落边缘不整齐，绒毛状，浅灰色背面灰白色，可溶性色素缺乏。

菌落在cya上25℃培养7天，直径30-32mm，有大量放射状皱纹，质地通常絮状或绒毡状，白色至浅黄色，中间菌落有绒毡状较厚，无放射状皱褶，灰白色。菌落表面有大量黄褐色渗出液，可溶性色素缺乏。

菌落在mea上25℃培养7天，直径20-30mm，菌落不平整，质地绒毡状，白色至浅灰色，带有少量灰绿色菌丝团。中间菌落有绒毡状脐状突起，无放射状皱褶，灰白色。菌落表面有大量黄褐色渗出液，可溶性色素缺乏。

在yes上25℃培养7天：直径42-44mm，有大量放射状皱纹，质地通常絮状或绒毡状，白色至浅黄色，中间菌落有绒毡状较厚，无放射状皱褶，白色。菌落表面无渗出液，可溶性色素缺乏。

菌丝和分生孢子的形态观察结果如图2所示：

在mea上，分生抱子梗发生于气生菌丝或拖曳菌丝，壁平滑；帚状枝主要是单轮生，双轮生较少存在，梗基单生，其顶端膨大。瓶梗每轮2-8个或更多，典型瓶状，梗颈短而明显；分生抱子呈现球形或近球形，显著刺状粗糙。分生抱子链疏松，近于圆柱状或不规则。分生孢子梗20-100×2-2.5μm，梗基7-16×2.5-3.2μm，瓶梗6-8×2.0-2.5μm。孢子球形至椭球形，2.6-4.5μm。

z863的基梗和分生孢子的形态与penicilliumjanczewskii非常形似。该菌株与penicilliumjanczewskii的区别：z863在cya培养基上菌落颜色浅，在2周内也是灰白色而不会成为灰绿色；分生孢子梗单轮生为主，双轮生较少存在，梗基单生。而penicilliumjanczewskii在cya培养基上培养2周，菌落成为灰绿色至灰黑色；帚状枝主要是双轮生，三轮生、单轮生都存在，梗基每轮2-4个。

实施例3分离到的菌株的分子鉴定

(1)dna提取

1)在pda平板上22℃培养z863菌株7天后，用牙签刮取平板上的菌丝，放入已灭菌的含有300μl提取缓冲液1.5ml离心管中；

提取缓冲液的配方为：1mkcl，100mmtris-hcl，10mmedta，ph＝8.0；

2)将挑取的菌丝用电磨机研碎，然后再加入300μl提取缓冲液，剧烈震荡2min；

3)10000rpm离心10min；

4)吸取上清液，转移至另一新的离心管中，弃沉淀；

5)在上清液中加入等体积的异丙醇(分析纯)，轻轻颠倒混匀数次后，12000rpm离心10min，沉淀核酸；

6)轻轻倒去上清液，将含有沉淀的离心管倒置在吸水纸上排干水分；

7)再加入300μl70％乙醇，轻轻颠倒混匀数次后，12000rpm离心2min；

8)轻轻倒去上清液，重复步骤7)一次；

9)将离心管倒置在吸水纸上排干水分，置于37℃下15min，使乙醇充分挥发；

10)用50μlddh2o重悬沉淀，得到z863基因组dna，浓度达到30ng/μl。

(2)真菌核糖体itsrdna基因、微管蛋白bena基因、转绿因子tef基因、核糖体lsurdna基因、核糖体ssurdna基因、钙调蛋白cam基因、rna聚合酶结合蛋白rpb2基因、β-tubulin基因的pcr扩增

its引物：上游引物its1序列为：5′-tccgtaggtgaacctgcgg-3′，下游引物its4序列为：5′-tcctccgcttattgatatgc-3′；

微管蛋白bena基因引物：上游引物bt2a：ggtaaccaaatcggtgctgctttc，下游引物bt2b：accctcagtgtagtgacccttggc；

cam引物：上游引物cmd5：ccgagtacaaggargccttc，下游引物cmd6：ccgatrgaggtcatracgtgg；

rpb2引物：上游引物5f：gaygaymgwgatcayttygg，下游引物7cr：cccatrgcttgyttrcccat；

ssu引物：上游引物ns1：gtagtcatatgcttgtctc，下游引物ns4：cttccgtcaattcctttaag；

lsu引物：上游引物lr5：atcctgagggaaacttc，下游引物lror：acccgctgaacttaagc；

tef引物：上游引物ceff2：ggcttcaacgtgaagaacg；下游引物cefr1：ccgtkcaarccrgagatgg；

β-tubulin引物：上游引物t12：taacaactgctgggccaagggtcac；下游引物t22；tctggatgttgttgggaatcc。

pcr扩增在50μl反应体系中进行，体系中含有：上下游引物各2μm，dntps200μm，mgcl21.5mm，10×pcrbuffer5μl，模版dna2μl，taq酶2u。

pcr扩增反应在朗基mg96g型pcr仪上进行。反应条件：94℃预变性2min，然后35个循环包括：94℃变性30s，55℃退火40s，72℃延伸1min。最后72℃后延伸10min。

(3)pcr产物的回收纯化

pcr反应结束后，pcr产物经1％的琼脂糖凝胶电泳检测后，采用爱思进生物技术公司的dna凝胶纯化试剂盒，按照试剂盒说明书的步骤进行，步骤如下：

1)将50μlpcr产物全部加到1％的琼脂糖凝胶的点样孔中，按5v/cm的电泳条件电泳30min；

2)电泳结束后，在紫外灯下用刀片切取含目的dna片段的凝胶，置于2ml离心管中，称重；

3)按照1mg凝胶加入3ml的de-a缓冲液的标准，加入de-a缓冲液到收集凝胶的2ml离心管中，75℃保温10min，期间振荡数次，至完全融化；

4)加入0.5倍de-a体积的de-b缓冲液，混合均匀；

5)将dna制备管放入2ml离心管中，将混合液转移到dna制备管中，12000rpm离心1min，弃上清；

6)将dna制备管放回2ml离心管中，加500μl缓冲液w1，12000rpm离心30s；

7)将dna制备管放回2ml离心管中，加700μl缓冲液w2，12000rpm离心30s；

8)重复步骤7)一次；

9)将dna制备管放回2ml离心管中，12000rpm离心2min。以排干膜上洗涤液；

10)将dna制备管放回2ml离心管中，加50μl的ddh2o，10000rpm离心1min，洗脱dna置-20℃下保存。

(4)基因的测序和序列分析

经电泳检测后的已经纯化回收的目的dna片段送至上海生工用abiprisma377型自动测序仪进行测序。测序结果经过严格核对后，得到如seqidno.1-seqidno.8(分别为its、bena、lsu、ssu、tef、rpb2、cam、tubulin的扩增所得片段)所示的dna片段序列。

在ncbi网站上，将测得z863菌株的its的核苷酸序列用blast在genbank数据库中查找和比对同源或相似的核苷酸序列。对比结果显示，此序列与登录号为mk179261的penicilliumjanczewskii，登录号为mh492021的penicilliumarizonense，登录号为kx359603的penicilliumcanescens，登录号为nr_138358的penicilliummurcianum，登录号为kp016839的penicilliumjanczewskii相似性都达到了100％。这个结果说明，its区序列不能确定z863菌株属于什么种，只能明确该菌株是青霉属penicillium中的canescentia组(penicilliumsect.canescentia)中的种类。

而用z863的bena基因序列检索genbank数据库，对比结果显示，此序列与登录号为mg832201的penicilliumwaksmanii，登录号为kp016919的penicilliumgriseoazureum，登录号为mg832199的penicilliumjanczewskii相似性超过99％；与登录号为kj866964的penicilliumechinulatum，登录号为mg832186的penicilliumcanescens相似性高达98.8％。

而用z863的lsu基因序列检索genbank数据库，对比结果显示，此序列与登录号为mh872986的penicilliumradiatolobatum，登录号为mh867903的penicilliumcanescens，登录号为mh877145的penicilliumjanczewskii相似性达到100％；

用z863的ssu序列检索genbank数据库，对比结果显示，此序列与登录号为ab027410的penicilliumsacculum，登录号为kt601570的penicilliumchrysogenum，登录号为jn642222的penicilliumsolitum，与登录号为jn938976的penicilliumverrucosum相似性超过99％。

用z863的tef序列检索genbank数据库，对比结果显示，此序列与登录号为xm_022626304的penicilliumarizonense，相似性达到98％，与登录号为xm_002558686的penicilliumchrysogenum，登录号为xm_016739759的penicilliumexpansum的相似性达到96％。

用z863的rpb2序列检索genbank数据库，对比结果显示，此序列与登录号为kp016850的penicilliumdunedinense，相似性达到98.8％；与登录号为kp016852的penicilliumgriseoazureum相似性达到98.7％；与登录号为jn406612的penicilliumjanczewskii相似性达到97.6％，与登录号为jn121485的penicilliumcanescens相似性达到96.6％。

用z863的cam序列检索genbank数据库，对比结果显示，此序列与登录号为kj775405的penicilliumdunedinense，相似性达到98％；与登录号为kp016823的penicilliumgriseoazureum相似性达到98.8％；与登录号为eu644079的penicilliumjanczewskii相似性达到97.7％。

用z863的tubulin序列检索genbank数据库，对比结果显示，此序列与登录号为jn112041的penicilliumjanczewskii，相似性达到97％，与其他种的相似性都在95％以下。

由于以上的每一个单独的dna片段序列的相似性比较的结果都不同，单凭一个单独的dna片段不能确定的分类地位，我们参考其他研究(persoonia36，2016：247–280)中关于penicilliumsect.canescentia组的研究结果，采用its、cam、bena三个片段进行综合系统发育分析。

表1构建系统树用到的基因序列

将所得序列与genbank数据库中的核苷酸序列进行blastn比对，从genbank数据库中下载相似的序列(见表1)，通过bioedit对三种序列分别进行排列后校正，然后将三种合并为一个序列，采用paup4.0b10软件的非加权简约法进行系统树的构建。通过1000次的bootstrap评估系统树分支的稳定性。我们以aspergillusmuricatus作为外群，构建系统发育树，系统发育树分析结果如图3，表明z863菌株与penicilliumjanczewskii、p.nigricans、p.griseoazureum、p.echinatum的亲缘关系较近，但是并不属于其中的任何一个种类，表明是个新种。将该新筛选到的z863菌株暂命名为penicilliumsp.，株号z863，于2019年10月30日保藏于位于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏号为cctccno：m2019870。

实施例4通过对峙培养研究z863对植物病原菌的抑制作用

采用平板对峙培养法。在直径为9厘米的培养皿中加入pda培养基15ml，冷却后在培养皿中分别接入z863和植物病原菌，两个接种物相距4cm。然后置于25℃的培养箱中培养1周，检查对病原菌的抑制情况。测试的病原菌有柑桔黑点病菌(diaporthecitri)、柑桔炭疽病菌(colletotrichumgloeosporioides)、柑桔黑斑病菌(phyllostictacitrichinaensis)、稻瘟病菌(pyriculariaoryae)、小麦赤霉病菌(fusarumgraminearum)、梨轮纹病菌(botryosphaeriakuwatsukai)、立枯丝核菌(rhizoctoniasolani)。

结果如图4～11所示：经检测，菌株z863对稻瘟病菌、柑桔黑点病菌、柑桔炭疽病菌、柑桔黑斑病菌都有明显的抑制作用，但对梨轮文病菌、立枯丝核菌和小麦赤霉病菌没有抑制作用。

序列表

<110>浙江大学

<120>一种具有抑菌作用的青霉菌及应用

<160>24

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>586

<212>dna

<213>青霉菌(penicilliumsp.)

<400>1

ttcctccgcttattgatatgcttaagttcagcgggtatccctacctgatccgaggtcaac60

ctggaaaaaagttttggttgatcggcaagcgccggccgggcctacagagcgggtgacaaa120

gccccatacgctcgaggaccggacgcggtgccgccgctgcctttcgggcccgtccccccg180

ggaagggggacgagacccaacacacaagccgggcttgagggcagcaatgacgctcggaca240

ggcatgccccccggaataccagggggcgcaatgtgcgttcaaagactcgatgattcactg300

aattctgcaattcacattacgtatcgcatttcgctgcgttcttcatcgatgccggaacca360

agagatccgttgttgaaagttttaaataatttatatttagactcagactgcaattttcat420

acagagttcaaggtgtcttcggcgggcgcgggcccgggggcagatgccccccggcggccg480

tgaggcgggcccgccgaagcaacaaggtacaataaacacgggtgggaggttgaattcaga540

gaattctcgctcggtaatgatccttccgcaggttcacctacggaag586

<210>2

<211>446

<212>dna

<213>青霉菌(penicilliumsp.)

<400>2

cagacagatatcgagacttttttcgcgtcattggttcacaatttactgactggattacag60

gcaaaccatctccggtgagcacggtctcgatggcgatggacagtaagttcaatgtggaat120

ttcttgtggtgggttgggcagctgatatcttgttaggtacaacggtacctccgacctcca180

gctcgagcgcatgaacgtctacttcaaccatgtgagtacaatatgttggaattggctgct240

taagcattatctgacttctatgttttgacccctcaggcccacggtgacaagtacgttccc300

cgtgccgttctcgtcgacttggagcccggtaccatggacgctgtccgctccggtcctttc360

ggcaagcttttccgccccgacaacttcgtcttcggtcagtccggtgctggtaacaactgg420

gccaagggtcactacacctgagggta446

<210>3

<211>893

<212>dna

<213>青霉菌(penicilliumsp.)

<400>3

cagatggttcgattagtctttcgcccctatacccaaattcgacgatcgatttgcacgtca60

gaaccgctacgagcctccaccagagtttcctctggcttcgccctattcaggcatagttca120

ccatctttcgggtcccaacagctacgctcttactcaaatccatccgaagacatcaggatc180

ggtcgatggtgcacccaaagggttcccacctccgttcgctttcactgcgcgcacgggttt240

gacacccgaacactcgcgtagatgttagactccttggtccgtgtttcaagacgggtcgct300

tacgaccattatgccaacgtccgagccgaagcgcgttcctcggtctaggcaggtcgcatt360

gcaccctcggctataagacgcccctgggggcgttaccttccgagggcctttgaccgaccg420

cccaaaccgacgttggcccgcccgcggggaagtacaccggcacgaatgccggctgaaccc480

cgcgagcgagtctggtcgcaagcgcttccctttcaacaatttcacgtgctttttaactct540

cttttcaaagtgcttttcatctttcgatcactctacttgtgcgctatcggtctccggcca600

atatttagctttagatgaaatttaccacccatttagagctgcattcccaaacaactcgac660

tcgtcgaaggagcttcacacgggcgcggacaccccatcccatacgggattttcaccctct720

atgacgtcccgttccagggaacttagatggggaccgctcccgaagcatcctctgcaaatt780

acaatgcggaccccgaaggagccagctttcaaatttgagctcttgccgcttcactcgccg840

ttactggggcaatccctgttggtttcttttcctccgcttattgatatgctata893

<210>4

<211>1044

<212>dna

<213>青霉菌(penicilliumsp.)

<400>4

gcatgtctagtataagcaacttgtactgtgaaactgcgaatggctcattaaatcagttat60

cgtttatttgatagtaccttactacatggatacctgtggtaattctagagctaatacatg120

ctaaaaaccccgactcacgaaggggtgtatttattagataaaaaaccaacgcccttcggg180

gctccttggtgaatcataataacttaacgaatcgcatggccttgcgccggcgatggttca240

ttcaaatttctgccctatcaactttcgatggtaggatagtggcctaccatggtggcaacg300

ggtaacggggaattagggttcgattccggagagggagcctgagaaacggctaccacatcc360

aaggaaggcagcaggcgcgcaaattacccaatcccgatacggggaggtagtgacaataaa420

tactgatacggggctcttttgggtctcgtaattggaatgagaacaatttaaatcccttaa480

cgaggaacaattggagggcaagtctggtgccagcagccgcggtaattccagctccaatag540

cgtatattaaagttgttgcagttaaaaagctcgtagttgaaccttgggtctggctggccg600

gtccgcctcaccgcgagtactggtccggctggacctttccttctggggaacctcatggcc660

ttcactggctgtggggggaaccaggacttttactgtgaaaaaattagagtgttcaaagca720

ggcctttgctcgaatacattagcatggaataatagaataggacgtgcggttctattttgt780

tggtttctaggaccgccgtaatgattaatagggatagtcgggggcgtcagtattcagctg840

tcagaggtgaaattcttggatttgctgaagactaactactgcgaaagcattcgccaagga900

tgttttcattaatcagggaacgaaagttatgggatcgaagacgatcagataccgtcgtag960

tcttaaccataaactatgccgactagggatcggacgggattctataatgacccgttcggc1020

accttacgagaaatcaaagttttt1044

<210>5

<211>1001

<212>dna

<213>青霉菌(penicilliumsp.)

<400>5

gtgattccatcaagaacatgatcactggtacctcccaggctgactgcgccattctcatca60

tcgcctccggcactggtgagttcgaggctggtatctccaaggatggccagacccgtgagc120

acgctctgcttgccttcaccctcggtgttaagcagctcatcgttgccctcaacaagatgg180

acacctgcaagtggtccgaggaccgttacaacgagattgtcaaggagacctccaacttca240

tcaagaaggtcggctacaaccccaagtccgttcccttcgtccccatctccggcttcaacg300

gcgacaacatgctcgagccctcccccaactgcccctggtacaagggttgggagaaggaga360

ccaagtccggcaagtccaccggaaagaccctcctcgaggccattgacgccatcgacaccc420

ccgtccgtccctccaacaagcccctccgtcttcccctccaggatgtgtacaagatctccg480

gtattggcacagttcccgtcggccgtgtcgagactggtatcattacccccggcatggtcg540

tcaccttcgctcccgccaacgtgaccactgaagtcaagtccgtcgagatgcaccaccagc600

agctcaaggccggtaaccccggtgacaacgtcggcttcaacgtcaagaacgtttccgtca660

aggaggttcgccgtggtaacgtcgcttccgactccaagaacgaccccgccatgggctgtg720

actccttcaacgcccaggtcatcgtcctgaaccaccccggtcaggtcggcgctggatacg780

ctcccgttctggactgccacactgcccacattgcttgcaagttctccgagctcctcgaga840

agattgaccgccgtaccggtaaggccaccgagacctcccccaagttcatcaagtccggtg900

atgccgctatcgtcaagatggttccctccaagcccatgtgtgttgaggccttcaccgact960

accccctctcggtcgtttcgccgtccgtgacatgcgtcaga1001

<210>6

<211>1032

<212>dna

<213>青霉菌(penicilliumsp.)

<400>6

tggctggaccccttctggccaccttttccgtgttcttttcacccgagtgacccgtgacct60

tcaacgttacgtgcagcgcagtgtcgagaccaaccgtgagatctacctcaacattggtat120

caaggcggccaccctcacaggaggtctgaagtatgctcttgctaccggtaactggggtga180

gcagaagaaggccgccagcgccaaggctggtgtgtcccaggtgctgagtcgttacacttt240

cgcctcttcattgtcccatctgcgacgtaccaacacacccattggcagagatggaaagat300

tgccaaaccacgtcaactacacaacacccattggggtttggtctgtccagctgagacacc360

ggaaggtcaggcttgtggtctggtcaagaacttggccctcatgtgctacatcactgttgg420

tacgccgagtgagcccatcattgatttcatgattcagcgaaatatggaagttctcgagga480

gttcgaacctcaggtcacgccaaatgcaaccaaggtgtttgtcaacggtgtctgggttgg540

tattcacagagacccttcgcatcttgtcgctactatgcaaaatcttcgtcgacgtaacat600

gatctcgcacgaggttagtttgattcgtgacatccgtgagcgtgaattcaagattttcac660

cgacaccggtcgcgtgtgccgtcccctgttcgtcatcgacaatgatcccaagagtgagaa720

ctcaggtggattgatcctcaacaaggagcacattcgcaagcttgagcaagataaggatct780

accggccgatatggacccagaagaccgtcgcgagcagtacttcggatgggatggtcttgt840

tcgttctggtgcagttgaatatgtcgatgctgaagaagaggagactatcatgattgtcat900

gacgcccgaagatctcgagatttcccgacaactccaggctggttacgctctccccgagga960

cgagaccaatgatcccaacaagcgcgttcgctcgattctcagccagcgtgcccacacttg1020

gacacattgtga1032

<210>7

<211>514

<212>dna

<213>青霉菌(penicilliumsp.)

<400>7

agctcagcggcggagatgaaaccgttgttgtcgcggtcgaacaccttgaacgcctcgcga60

atctcctcctcggaatctgtgtccttcatcttgcgggccatcatggtcaagaactctatc120

gacgggtcaatagccatctcgtttgggatctagtggacacgggaaagtaccggggaagtc180

aatagtgccattgttgtcagcgtcaacctcgttgatcatgtcctgcagctcagactcgga240

ggggttctggcccagagagcgcatgacggtgccaagctccttggtggtgatttgtcctgg300

aggtggaatcggtcttagtatatcgtttctttcaattcgggggcagcagacactgctgcc360

agttcaactgggttgtcgggcgaggtcacacttaccatcgccatccttgtcctatttcgc420

atcaaagccgtcagtatgttgtccagccttcataacttcaatccacgggtggaaacactt480

acaaacagggagaaggcctccttgtactcggaga514

<210>8

<211>766

<212>dna

<213>青霉菌(penicilliumsp.)

<400>8

caggtgccgagctcgttgaccaggtcatcgatgtcgtccgccgtgaggccgaggcttgtg60

actgcctccagggtttccagatcacccactccctcggtggtggtaccggtgccggtatgg120

gtacactcctgatctccaagatccgtgaggagttccccgaccgtatgatggccaccttct180

ccgtcgttccttctcccaaggtttccgacaccgttgttgagccttacaacgccaccctct240

ccgtccaccagctcgttgagcactccgacgagaccttctgtattgataacgaggtatgca300

atgcgtgggaaccagcaatggcacatcactgacgaatttaggctctgtacgacatctgca360

tgcgtaccctcaagctgtcccagccctcgtacggtgacctgaaccacctcgtctccgccg420

tcatgtccggtgtgaccacctccctccgtttccccggccagctcaactccgatctccgca480

agctcgccgtcaacatggtgcccttcccccgtctgcacttcttcatggtcggcttcgctc540

ccctgaccagccgcagcggctaccagtaccgccaggtcagcgttcccgagttgacccagc600

agatgttcgaccccaagaacatgatggctgcttccgacttccgtaacggccgttacctca660

cctgctccgctctcttccgcggtaaggtctccatgaaggaggttgaggaccagatgcgca720

acatccagaacaagaaccagagctacttcgttgagtggattcccaa766

<210>9

<211>19

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>9

tccgtaggtgaacctgcgg19

<210>10

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>10

tcctccgcttattgatatgc20

<210>11

<211>24

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>11

ggtaaccaaatcggtgctgctttc24

<210>12

<211>24

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>12

accctcagtgtagtgacccttggc24

<210>13

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

<221>r

<222>(1)..(1)

<223>risa/g

<400>13

ccgagtacaaggargccttc20

<210>14

<211>21

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

<221>r

<222>(1)..(1)

<223>risa/g

<220>

<221>r

<222>(1)..(1)

<223>risa/g

<400>14

ccgatrgaggtcatracgtgg21

<210>15

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

<221>y

<222>(1)..(1)

<223>yisc/t

<220>

<221>m

<222>(1)..(1)

<223>misa/c

<220>

<221>w

<222>(1)..(1)

<223>misa/t

<400>15

gaygaymgwgatcayttygg20

<210>16

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

<221>r

<222>(1)..(1)

<223>risa/g

<220>

<221>y

<222>(1)..(1)

<223>yisc/t

<400>16

cccatrgcttgyttrcccat20

<210>17

<211>19

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>17

gtagtcatatgcttgtctc19

<210>18

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>18

cttccgtcaattcctttaag20

<210>19

<211>17

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>19

atcctgagggaaacttc17

<210>20

<211>17

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>20

acccgctgaacttaagc17

<210>21

<211>19

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>21

ggcttcaacgtgaagaacg19

<210>22

<211>19

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

<221>k

<222>(1)..(1)

<223>kisg/t

<220>

<221>r

<222>(1)..(1)

<223>risa/g

<400>22

ccgtkcaarccrgagatgg19

<210>23

<211>25

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>23

taacaactgctgggccaagggtcac25

<210>24

<211>21

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>24

tctggatgttgttgggaatcc21