一种分泌AXL抗体的杂交瘤细胞的制备筛选方法与流程

本申请涉及生物及抗体工程领域，具体而言，涉及一种分泌axl抗体的杂交瘤细胞的制备筛选方法。

背景技术：

axl属于tyro-3家族的受体酪氨酸激酶，又称ark、ufo或tyro-7。其配体为gas6，gas6是一种分子量为70kda的蛋白质，与抗凝因子s同源。axl结合配体并激活后，会引起一系列的信号级联，导致pi3k-akt以及ras/erk和β-catenin/tcf通路的激活。

axl在多种肿瘤组织中异常高表达，比如乳腺癌、结肠癌、前列腺癌、胃癌、子宫内膜癌、肾癌、肝细胞癌、胸腺肿瘤、食管肉瘤、慢性髓淋巴瘤、急性髓系淋巴瘤、黑素瘤以及头颈部肿瘤中有高表达。

已有研究表明axl在侵袭性很强的乳腺癌中异常高表且与肿瘤迁移高度相关。体外实验证实肿瘤组织的迁移和侵袭依赖于axl的活性，而采用抗体治疗抑制这种活性则可以抑制其活性(wo04008147)。同样，在体内抑制axl，如表达一种无活性的axl或采用sirna抑制axl的表达，则可以有效的阻断了小鼠体内移植瘤的生长。

迄今，已有几种axl抗体开发用于临床治疗，如美国专利公开号为us20190352407a1，有的axl抗体还制备成药物偶联抗体形式如中国专利cn110536703a，用于直接杀伤肿瘤组织。我们认为axl是一个在多种肿瘤组织中高表，且在肿瘤的发生、发展过程中作为主要驱动者，其药物开发潜力尚未被完全释放。主要原因如下：其一，现有抗体其阻断功能不高；其二，依赖欧联药物对肿瘤进行杀伤的策略，可能会因潜在毒性限制其应用范围。基于这一推断，筛选获得具有较高阻断活性的抗体，并通过基因工程手段，探索除adc策略之外的治疗手段，具有潜在的成药优势，可能会为未被满足的临床需求提供可选的解决方案。

技术实现要素：

本申请的公开了一种分泌axl抗体的杂交瘤细胞的制备筛选方法，制备方法包括以下步骤：

采用axl免疫原混合物50μg注射免疫小鼠，检测抗体效价，抗体效价达到106，停止免疫；

取小鼠脾脏，制备成脾细胞液；将脾细胞液与骨髓瘤细胞液在40℃水浴条件下加入peg溶液进行融合，离心得到杂交瘤细胞混合物；

重悬杂交瘤细胞混合物；

包被axl抗原，加入杂交瘤细胞混合物孵育1h，洗涤拍干后加入二抗孵育并拍干，终止反应筛选得到阳性的分泌axl抗体的杂交瘤细胞；并通过elisa检测杂交瘤细胞的亲和力。

在前述的一些实施例中，axl免疫原混合物为axl-mfc融合蛋白与弗氏完全佐剂按照1:1的质量比混合得到；

检测抗体效价前还包括加强免疫3次加强免疫；加强免疫的免疫原采用axl-mfc融合蛋白与弗氏不完全佐剂按照1:1的质量比混合得到；加强免疫间隔两周进行一次。

在实施例中，用免疫原与弗氏完全佐剂对小鼠进行免疫后，再进行多次加强免疫，可以提高抗体的结合效果，提高产生的抗体与抗原的亲和力。

在前述的一些实施例中，骨髓瘤细胞是sp20细胞，所述sp20细胞的浓度为1×10⁷个/ml。

在前述的一些实施例中，脾细胞与骨髓瘤细胞比例为3:1。

在实施例中，通过过量的脾细胞与骨髓瘤细胞混合，有利于脾细胞完全均能与骨髓瘤细胞融合。

在前述的一些实施例中，peg溶液预热至40℃。

在实施例中，将peg溶液也预热到40℃有利于细胞的融合，由于加热温度变高，细胞膜的流动性加强，脾细胞与骨髓瘤细胞就能融合加速。

在前述的一些实施例中，重悬杂交瘤细胞混合物包括用20％的fbs培养基稀释细胞至5×10⁴个/孔的浓度，在37℃，5％的co2条件下培养7-10天。

在前述的一些实施例中，包被axl抗原的量为2μg/孔。

在前述的一些实施例中，筛选得到阳性的分泌axl抗体的条件为od450值大于1。

在前述的一些实施例中，检测杂交瘤细胞的亲和力的抗原用gas6-his。

在前述的一些实施例中，用0.5μg/ml的axl-mfc与所述杂交瘤细胞按照1:1混合作为一抗。

与现有技术相比，本申请的有益效果为：本申请提供的分泌axl抗体的杂交瘤细胞的制备筛选方法，通过初次免疫后，结果几次加强免疫后，就能得到可以产生效价较高的脾细胞，通过脾细胞与骨髓瘤细胞融合，就能产生技能持续产生效价高，又能持续分裂增殖的杂交瘤细胞。

附图说明

图1是实验例3的抗体结合实验图；

图2是实验例4中抗体阻断实验结果图；

图3是实验例5中流式细胞筛选实验结果图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本申请的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本申请，而不应视为限制本申请的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

以下结合实施例对本申请的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

本实施例提供一种分泌axl抗体的杂交瘤细胞的制备筛选方法，该制备筛选方法包括以下步骤：

选择小鼠品系为bala/c，6-8周龄的健康雌鼠。具体免疫操作步骤如下：

1.1第一次免疫时采用弗氏完全佐剂，axl-mfc免疫抗原(融合蛋白)与免疫佐剂(弗氏完全佐剂)比例为1:1，在免疫前只需将抗原和佐剂轻柔混合即可(注意：抗原和佐剂免疫前放在冰上)采用腹部皮下多点注射方式，每个点注射50μg；

1.2间隔两周连续3次加强免疫：采用弗氏不完全佐剂，每个点注射30μg；

1.3进行抗体效价检测，抗原axl-hfc用包被液稀释，每孔包被1μg抗原；

1.4以50μl/孔量加入酶标板孔中，置4℃过夜或37℃包被2小时；弃去孔内的液体，同时用洗涤液200μl洗3次，拍干；每孔加200μl封闭液4℃过夜或37℃封闭2小时

1.5洗涤液200μl洗3次；此时包被板可-20℃或4℃保存备用；每孔加50μl一抗(待检小鼠血清)，同时设立阳性、阴性对照孔；37℃孵育1h；洗涤液200μl洗5次，拍干；

1.6加酶标二抗，每孔50μl，37℃孵育1h，洗涤液200μl洗5次，拍干；加底物液tmb50μl，37℃显色2～15min；以2mol/lh2so4终止反应，酶标仪450nm读取od值；观察结果，抗体效价达到10的6次方以上方可进行细胞融合。

1.7间隔两周进行冲刺免疫，此时不加佐剂只用抗原进行腹腔免疫，每个点注射50μg，冲刺免疫3天后即可进行细胞融合

实施例2

本实施例进行脾细胞与骨髓瘤细胞进行融合，具体的操作步骤如下所示：

1.1摘除一侧眼球放血后配合脊椎脱臼，处死的小鼠置于70％酒精；以镊子夹起小鼠左后肢股沟内侧的皮肤，以剪刀横剪，继而竖剪，或以手撕开，暴露系膜。股沟处若有淋巴结，可取下浸入10mlrmpi1640培养基(于9cm培养皿内)。小心的摘下脾脏，浸入上述培养基内，仔细剪除多余的白色脂肪或结缔组织，夹起并浸入新鲜的培养基，晃动洗脾1-2分钟；

1.2将洗涤好的脾及淋巴结移入细胞筛内，此细胞筛提前浸入新鲜的20ml培养基；以注射器推头于细胞筛内研磨脾，将培养基(含细胞)转移至干净的离心管；向细胞筛内缓慢加入20ml培养基冲洗；将滤过的细胞移入离心管合并轻轻吹打离心管内液体，离心；1000rpm，5min，弃上清；加入40ml培养基，重悬细胞，再次离心，弃上清；

1.3向管内加入1-5ml红细胞裂解液(sigma，r7757-100ml)，重悬，小心吹打1-2min；加入40ml培养基终止裂解反应；离心：1000rpm，5min，弃上清；加入10ml培养基重悬细胞；

1.4取10μl细胞悬液移入干净的ep管，并加入90μl培养基稀释，取此稀释液10μl至新的ep管，并加入10μl4％trypanblue。于倒置显微镜下计数细胞并计算细胞活率；

1.5余下大部细胞以培养基定容至30ml，离心，弃上清(此时设置水浴40c，并预热pegsolution(sigma1450))；

1.6以10ml培养基重悬脾细胞，按照1：3的比率加入sp20(提前收集，洗涤，重悬至培养基，～10^7/ml)。其中sp20：脾细胞＝1：3(sp20，以10-20％为佳)；

1.7用培养基定容到20ml，离心。弃上清；烧杯内注入40c水，将装有细胞的管置于此烧杯水浴2min左右；在60s内向此管内缓慢的滴入1ml预热的peg，边加边混匀，保持水浴；

1.8吸取此细胞悬液，缓慢滴回管内，保持水浴；60s内缓慢加入1ml培养基，边加边混匀，保持水浴；缓慢加入10ml培养基，持续混匀和水浴；缓慢加入培养基，定容至20ml；混匀，水浴10min。(水温缓慢降至室温)，离心，弃上清；得到杂交瘤细胞混合物。

1.8按每孔5×10⁴个细胞，100μl培养液计算所需96孔板(corningcostar3599)及培养基(完全培养基，p/s，20％fbs，hat)，以完全培养基重悬细胞，并分装至培养板内；37℃，5％co2培养7-10天；取50ul上清，做elisa检测；阳性孔培养液转至约1mlht培养基，并在24孔板内培养，2-3天后检测

实施例3

本实施例开放和验证抗体结合方法。为检测抗体axl-his与抗体anti-axl-10g5(higg1/migg2a)的亲和力，优化获得elisa实验步骤如下：

1.1axl-his(0.7322mg/mllot：20191112分装冻存于-80℃)，(96-wellfbottomplate厂家：constar)；包被浓度：0.5μg/ml；1μg/ml；2μg/ml；5μg/ml，50μl/孔，各16孔(pbs稀释),孵育：37℃，2h；洗涤：pbst洗板3次；

1.25％脱脂奶粉，200μl/孔，4℃封闭过夜；洗涤：pbst洗板3次；

1.3将已抛光处理的电极浸在乙醇中短暂超声5s，然后再将电极浸入去离子水中，再将短暂超声5s将电极用去离子水清洗，空气中晾干待用；

1.4一抗：anti-axl-10g5(higg1/migg2a)梯度稀释，加样，37℃反应1h，采用棋盘滴定法；

表1棋盘滴定法

按照50μl/孔，37℃，1h，pbst洗板5次

1.5goat-anti-mousefc-hrp1:50000，50μl/孔，37℃，1h；用pbst溶液洗板5次

goat-anti-humanfc-hrp1:50000，50μl/孔，37℃，1h；洗涤：pbst洗板5次；

1.6tmb底物显色液(厂家：sigma，货号：t4444)，50μl/孔，37℃或室温显色2～10min；

1.7用2m的h2so4以50μl/孔的量加入到96孔板中；酶标仪450nm读取od值；并进行实验结果及数据分析。

实数据结果分析如图1所示，可以看出，本实验摸索的实验方法稳定可靠。

实施例4

本实施例对抗体阻断方法的开发，为检测抗体anti-axl-migg2a对受体axl-mfc与配体gas6-his结合的阻断效力优化elisa试验方法如下：

1.1用抗原gas6-his(1mg/ml的lot：20191015分装冻存于-20℃)(96-wellfbottomplate厂家：constar)以4μg/ml的包被浓度再每孔按照50μl/孔加入溶液，共8孔(并用pbs溶液进行稀释)；孵育：37℃，2h；洗涤：pbst洗板3次；

1.25％脱脂奶粉，200μl/孔，37℃封闭2h；洗涤：pbst洗板3次；

1.3axl-mfc(0.5μg/ml)与anti-axl-migg2a梯度稀释进行1:1混合37℃预孵育60min，加样，37℃反应1h；50μl/孔，37℃，1h，pbst洗板5次；

表2稀释滴定的方法如下：

1.4以goat-anti-mousefc-hrp1:50000，50μl/孔，37℃，1h洗涤：pbst洗板5次；tmb底物显色液(厂家：sigma，货号：t4444)，50μl/孔，37℃或室温显色2～10min；以2m的h2so4终止反应，50μl/孔；酶标仪450nm读取od值并对实验结果及数据分析。

实验结果如表3和图2所示；利用graphpadprism软件分析试验结果。

可以看出，抗体的抑制率随着浓度提高变高。

表3抑制率实验

实施例5

本实施例通过流式细胞仪筛选细胞的方法进行摸索和改进，为检测hela细胞与抗体anti-axl-10g5(migg2a)的亲和力，检测方法包括：

1.1将hela细胞用胰酶消化，计数，将细胞密度调整至3×10⁶/ml取100μl细胞悬液转到圆底96孔板(厂家：constar)，共17孔；置于冰盒上备用；

1.2以1000rpm离心2min，buffer重悬洗一次，离心去上清(冰盒上操作)buffer：dmem+1％bsa；

1.3anti-axl-10g5(migg2a)(1.9303mg/ml)抗体梯度稀释，8点定标曲，同时设复孔，冰盒上孵育进行操作；每个浓度取50μl，分别加入细胞沉淀中，重悬细胞，混匀，冰上孵育30min；1000rpm离心2min，buffer重悬洗一次，离心去上清，100μl；buffer重悬(冰盒上操作)；

表4抗体稀释的方法如下：

1.4以pe-goat-anti-mouseigg1:300，吸取50μl加入到细胞悬液中，在冰上孵育30min后离心去上清，buffer重悬洗一次，离心去上清，约200μl的buffer重悬(冰盒上操作)；

1.5将细胞悬液转移到1.5ml的ep管中；采用流式细胞仪检测pe荧光信号值；并进行实验结果及数据分析。

实验结果如图3所示，可以看出通过本实施例获得的筛选方法较为有效。

实施例6

本实施例对杂交瘤细胞进行筛选，杂交瘤细胞筛选的方法包括以下步骤：

1.1axl-his抗原用包被液稀释，一般每孔包被2μg抗原；以50μl/孔量加入酶标板孔中，置4℃过夜或37℃包被2小时；弃去孔内的液体，同时用洗涤液洗3次，拍干，每孔加200μl封闭液4℃过夜或37℃封闭2小时；

1.2洗涤液洗3次；此时包被板可-20℃或4℃保存备用；每孔加50μl待检杂交瘤细胞培养上清，同时设立阳性、阴性对照孔；37℃孵育1小时；洗涤，拍干；

1.3加酶标二抗，每孔50μl，37℃孵育1小时，洗涤，拍干；加底物液tmb50μl，37℃显色2-15min；以1mol/lh2so4终止反应，酶标仪450nm读取od值；

1.4结果判定：结果显示，筛得杂交瘤细胞高阳性抗体株80个，450nm阳性od值均＞1。

进行第二轮筛选

2.1gas6-his(1mg/ml的lot：20191015分装冻存于-20℃)(96-wellfbottomplate厂家：constar)；包被浓度：2μg/ml，50μl/孔，共8孔(pbs稀释)孵育：37℃，2h；洗涤：pbst洗板3次；

2.2用5％脱脂奶粉，200μl/孔，37℃封闭2h；pbst溶液洗板3次；

2.3axl-mfc(0.5μg/ml)与杂交瘤细胞上清进行1:1混合，同时设立阳性、阴性对照孔,37℃预孵育30min，转板，50μl/孔，37℃，1h，pbst洗板5次；

2.4以goat-anti-mousefc-hrp1:50000，50μl/孔，37℃，1h；pbst溶液洗板5次；

2.5用tmb底物显色液(厂家：sigma，货号：t4444)，50μl/孔，37℃或室温显色2～15min；2m的h2so4，50μl/孔；酶标仪450nm读取od值；并对实验结果及数据分析。

根据实验结果显示，筛选得到两个诊断效率较高的杂交瘤细胞株，阻断效率分别为：41.93％和40.08％。

以上所描述的实施例是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。本申请的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本申请的范围，而是仅仅表示本申请的选定实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。