一株秸秆腐生菌及其应用的制作方法

本发明涉及微生物领域，尤其涉及一株秸秆腐生菌及其应用。

背景技术：

水稻是我国主要粮食作物，也是最主要的经济作物。水稻在收获后残留大量秸秆，是可利用农村资源；而水稻秸秆在很多地区不能够有效还田，且被燃烧用于取暖，对环境污染造成严重影响。

腐解真菌在水稻秸秆降解过程中对腐殖酸的影响过程研究欠缺，没有有效的技术体系支撑。目前在研究水稻秸秆降解过程中微生物的分离和鉴定已迫在眉睫。

技术实现要素：

本发明是要解决现有秸秆难于降解的问题，提供一株秸秆腐生菌及其应用。

本发明秸秆腐生菌为终极腐霉(pythiumultimum)tl1，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期是2019年10月18日，保藏编号为cgmccno.18590。

本发明的终极腐霉(pythiumultimum)tl1可以以菌丝形态生长于固体的马铃薯蔗糖培养基中。

本发明的终极腐霉(pythiumultimum)tl1的菌落颜色为白色，菌丝为白色，地毯状散状，孢子为分生孢子。

本发明的终极腐霉(pythiumultimum)tl1通过blast分析与基因库中序列进行同源性比对，与终极腐菌(pythiumultimum)的同源性最高，达99％，通过结合菌体形态特征、生长条件等鉴定结果确定，本发明的菌株tl1为终极腐菌(pythiumultimum)。

本发明提供终极腐霉tl1在降解秸秆中的应用。

进一步的，所述秸秆为水稻秸秆。

本发明还提供终极腐霉tl1在水稻秸秆腐解过程中影响腐殖酸含量的应用。

进一步的，所述终极腐霉tl1在水稻秸秆腐解过程中促进水稻秸秆产生腐殖酸。

本发明的有益效果：

本发明终极腐霉tl1不仅能在水稻秸秆为基质的条件下快速繁殖，7天即可长满水稻秸秆界面，说明终极腐霉tl1能够降解水稻秸秆。而且终极腐霉tl1对水稻秸秆腐解过程的腐殖酸含量具有影响，可促进1g水稻秸秆产腐殖酸0.005g。

本发明利用生物降解水稻秸秆的手段，即利用高效微生物对水稻秸秆进行降解，更为环保；且降解水稻秸秆过程中产生的腐殖酸，腐殖酸可以用于改良土壤，促进植被生长。

附图说明

图1为终极腐霉tl1在pda平板上的形态图；

图2为终极腐霉tl1的系统进化树；

图3为终极腐霉tl1在水稻秸秆基质平皿中快速繁殖图片；

图4为终极腐霉tl1发酵秸秆后水稻秸秆腐殖酸含量。

具体实施方式

本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。

具体实施方式一：本实施方式秸秆腐生菌为终极腐霉(pythiumultimum)tl1，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期是2019年10月18日，保藏编号为cgmccno.18590。

本实施方式的终极腐霉(pythiumultimum)tl1可以以菌丝形态生长于固体的马铃薯蔗糖培养基中。

本实施方式的终极腐霉(pythiumultimum)tl1的菌落颜色为白色，菌丝为白色，地毯状散状，孢子为分生孢子。菌株tl1在pda平板上的形态图如图1所示。

具体实施方式二：本实施方式终极腐霉(pythiumultimum)tl1的获取方法为：

初筛：采用平板分离法，选取来源于吉林省长春市中国科学院东北地理与农业生态研究所试验田茎部和叶部腐烂水稻的样品，裁剪为2cm后置于45ml无菌水中冲洗数次，放置于灭菌的滤纸片上晾干后，将2cm的茎和叶样品放置于马铃薯固体培养基，倒置于25℃培养箱中培养2-3天，观察菌落的生长及透明圈产生情况。

马铃薯固体培养基：土豆200g去皮，切块后置于500ml水中煮沸10min，纱布过滤得滤液，蔗糖10g，琼脂粉10g，加蒸馏水定容至1000ml，115℃高压蒸汽灭菌30min。每个9cm×9cm平板倒入约20ml培养基。

复筛：在马铃薯固体培养基上，将10多株生长较快但形态、颜色等不同形状的菌落分别挑选出来，进行纯培养，直至菌落单一，筛选出菌株。将菌株切块后放置于在水稻秸秆培养基中培养，快速生长，该菌株即为本实施方式的菌株tl1。

水稻秸秆培养基：水稻秸秆加适量水润湿后，放置于9cm×9cm平板，121℃高压蒸汽灭菌20min。

对菌株tl1进行分子鉴定，利用基因组提取试剂盒(fastdnaspinkitforsoil)提取菌株tl1的基因组，进行its的扩增。pcr通用引物为：its1f(5ˊ-tccgtaggtgaacctgcgg-3ˊ)，its4r(5ˊ-tcctccgcttattgatatgc-3ˊ)，反应体系25μl，premixversion2.012.5μl，27f(10nm)1μl，1492r(10nm)1μl，dna模板1μl，无菌水不足至25μl。反应条件为：94℃预变性4min；94℃变性30s，53℃退火50s，72℃延伸50s，35个循环；72℃终延伸5min。pcr扩增后，产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳检验，结果在750-800bp处有明显的特征条带。将pcr扩增产物送到生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，所得序列上传到genbank，序列如序列表中seqidno：1所示。通过blast分析与基因库中序列进行同源性比对，并用mega5.1软件中neihbor-joinhing构建系统发育进化树，如图2所示。菌株tl1与终极腐菌(pythiumultimum)的同源性最高，达99％，通过结合菌体形态特征、生长条件等鉴定结果确定，本实施方式的菌株tl1为终极腐菌(pythiumultimum)tl1。

具体实施方式三：终极腐霉(pythiumultimum)tl1能够降解水稻秸秆。

对菌株tl1进行秸秆降解实验。将等体积烘干后的水稻秸秆加入30ml水放置于组培皿中，115℃高压蒸汽灭菌30min。然后无菌条件下接种1cm直接打孔的菌株tl1的pda菌块。对照组为不接菌。置于25℃培养箱中培养30天。菌株tl1在水稻秸秆基质平皿中快速繁殖图片如图3所示。使用电子天平称量秸秆降解前后重量，结果如表1所示。发现接种菌株秸秆失重率为0.049％，而未接种秸秆失重率为0.014％。说明终极腐霉tl1能够降解水稻秸秆。

具体实施方式四：终极腐霉(pythiumultimum)tl1对水稻秸秆腐解过程中腐殖酸含量的影响。

将等体积的水稻秸秆放置于培养皿中，115℃高压蒸汽灭菌30min。然后无菌条件下接种1cm直接打孔的tl1菌株pda菌块。对照组为不接菌。置于25℃培养箱中培养30天。

使用重量法测量腐殖酸的含量。将培养皿中发酵后的水稻秸秆置于烘箱中50℃烘干，取出5g样品，置于50ml0.2mol/l的naoh溶液中摇床培养20min，然后加入0.2mol/l的hcl中和液体，并调节ph为2.5左右，使液体中产生絮状沉淀。然后使用真空过滤器抽滤样品并洗脱酸性。所得到的固体沉淀置于平皿中，放置于烘箱中50℃烘干并测量重量。

菌株tl1发酵秸秆后水稻秸秆腐殖酸含量如图4所示。测量结果显示，菌株tl1对水稻秸秆腐解过程的腐殖酸含量具有影响，可促进1g水稻秸秆产腐殖酸0.005g

结论：终极腐霉tl1促进水稻秸秆降解过程产生腐殖酸。

表1

序列表

<110>中国科学院东北地理与农业生态研究所

<120>一株秸秆腐生菌及其应用

<160>3

<210>1

<211>904

<212>dna

<213>终极腐霉（pythiumultimum）

<220>

<223>终极腐霉tl1

<400>1

ttgccgcccccttttagactgtccacgtgactgtagcaagtctagcgctgtcactgagct60

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<210>2

<211>19

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>引物its1f

<400>2

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<210>3

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>引物its1r

<400>3

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